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细胞工程复习2
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防风体细胞胚发生发育的研究
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细胞工程复习230
一、.实验室的三大组成：准备；接种；培养；1.功能与要求：A.器皿的洗涤，培养及配置，灭菌；间无菌C.对离体材料进行培养，控光照温度，防微生；2.辅助实验室：细胞学实验室，生化分析实验室；3.基本设备的配置:养设备（双层中空，冷光源灯管；4.基本技术灭菌（物理化学，控温时间）操作环境灭；5.培养基组成及配置（无机盐，有机化合物，生长调；MS培养基――应用最广
一、.实验室的三大组成：准备；接种；培养1.功能与要求：A.器皿的洗涤，培养及配置，灭菌，材料处理，宽敞通风清洁防滑。B.无菌操作，封闭，干燥，长时间无菌
C.对离体材料进行培养，控光照温度，防微生物感染，干燥清洁2.辅助实验室：细胞学实验室，生化分析实验室3.基本设备的配置:养设备（双层中空，冷光源灯管），其它设备4.基本技术 灭菌（物理化学，控温时间）操作环境灭菌（气体熏蒸（甲醛高锰酸钾）或紫外照射）5.培养基组成及配置（无机盐，有机化合物，生长调节物质，水，其他附加成分）MS培养基――应用最广泛
White培养基――生根培养基N6培养基――单子叶植物离体培养
B5培养基――豆科作物的起始培养先配成母液，使用时按比例稀释。按顺序添加6.外植体：用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。（1） 外植体的取材三种来源：生长在自然环境下的植物（内源菌）、无菌环境下培养的植物、在温室控制环境条件下生长的植物（2）外植体灭菌（不同外植体在灭菌剂浓度、时间、程序上应有所区别，教材P85）外植体→清洗整理→杀菌剂灭菌→无菌水冲洗（3）培养条件的控制A.光照
光照调节：强度、时间和光质的控制。光照调节是分阶段进行的：外植体培养初期和愈伤组织增殖阶段，黑暗或弱光。器官分化阶段，高强度光照。B.温度
适温有利于细胞分裂，而在一定范围内降低培养温度则使细胞的质量增加。而且温度的调节还与培养类型有关：组织器官粗，细胞原生质体精。C.培养基PH
通常使用的pH值范围是5.5-6.5。pH在4.0以下或7.0以上培养物不能正常生长。pH变化的原因：外植体对各种成分吸收的差异、代谢产物的释放、高温灭菌。D.气体调节
培养室的透气程度和培养容器的封闭程度影响气体交换，影响培养物的生长状态。培养器皿的密闭性：捆扎松紧度和材料透气性。固体培养，组织完全浸入培养基，停止生长。液体培养，振荡培养可改善通气条件。小规模培养，培养室的透气程度影响不大；批量化大规模生产，应考虑空气交换。二、.1.细胞全能性：一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力称之为细胞的全能性。2.细胞分化：是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。3.再分化：在离体条件下，当细胞脱分化以后，无序生长的细胞及其愈伤组织要重新进入有序生长进而才能再生个体，因此，通常把离体培养下的这一过程称为再分化4.极性：是指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。通常把离体培养中TE细胞的出现作为组织分化的标志5.细胞脱分化：培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程a.离体培养下，脱分化过程发生在第一次有丝分裂之前 。静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。 b.细胞的脱分化过程可分为3个阶段：第一阶段为启动阶段，表现为细胞质增生，并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；第二阶段为演变阶段，此时细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体；第三阶段为脱分化终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。c.细胞脱分化与愈伤组织形成：愈伤组织的形成是脱分化的细胞重新进入活跃分裂的结果，但不是脱分化的过程。有些外植体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞进而形成体细胞胚。在组织器官培养时，愈伤组织内的细胞脱分化程度不一致。脱分化是细胞全能性表达的前题，再分化是细胞全能性表达的最终体现，细胞脱分化和再分化是离体培养过程中细胞全能性表现的基本过程。6. 植物的离体器官发生：指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。7.不定根、不定芽：指在一些非正常发生部位形成的根或芽，离体培养中通常是指从愈伤组织上发生的根和芽。器官发生方式：先芽后根
、先根后芽 、根芽同步发生 ；器官发生过程：①、经过愈伤组织的器官发生
愈伤组织形成→生长中心形成→器官原基及器官形成
②、不经过愈伤组织的器官发生（两种）a、茎尖培养中芽形成
b、外植体直接发生芽8.影响器官发生的因素
①遗传背景
②生理状态
③激素 培养过程中，细胞对外源激素的吸收效率和代谢途径直接影响激素的活性从而影响其培养效果。外源激素进入细胞内以后，以自由和束缚两种形式存在。细胞分裂素被外植体吸收后，在细胞内以自由碱基形式（活化形式）和核甘形式（钝化形式）两种形式存在。生长素进入细胞后，一部分以游离状态存在，另一部分则与氨基酸结合形成生长素－氨基酸复合体。
④光照（培养条件下，光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不是合成光合产物。）9.体细胞胚状体：离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或胚状体。10.体细胞胚形成的方式：直接途径（体细胞胚从外植体上直接发生）；间接途径（经过愈伤组织的体细胞胚形成，经过悬浮细胞的体细胞胚形成）11.器官发生与体细胞胚发生的差异答：与器官发生相比较，体细胞胚发育再生植株有二个明显的特点，体细胞具有双极性；体细胞胚形成后于母体的维管束联系较少，出现生殖隔离。大多数体细胞起源单细胞，通过体细胞胚胎形成再生植株，其遗传相对稳定，而器官发生途径的再生植株来源复杂，形成的个体常为嵌合植株。12.体细胞胚与合子胚的比较答：一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的结构。 子叶常不规范。 体积明显小于合子胚，在一些贮藏物质的含量上也存在较大差异。并且，体细胞胚不能有明显的脱水干燥过程。没有明显的休眠期，一般在心形期以后的各个阶段均可直接发育成小植株。13.思考题细胞学说与细胞全能性的概念。细胞分化的阶段及细胞结构的变化。离体条件下生长素与细胞分裂素在细胞分化中的作用。器官发生的影响因素。体细胞胚与合子胚在形成途径和结构上的异同。影响体细胞胚形成的因素及调控。根据体细胞胚形成的生化和分子基础，思考如何深入进行体细胞胚形成的理论与技术研究。三、1..体细胞无性系与体细胞无性系变异的概念：由任何形式的细胞培养所产生的植株统称为体细胞无性系，而把这些植株所表现出来的变异称之为体细胞无性系变异。2..体细胞无性系变异的特点：普遍性，局限性，嵌合性植物脱毒：利用植物组织培养技术，脱除植物细胞中侵染的病毒，生产健康的繁殖材料。快速繁殖：利用细胞的再生特性，在组织培养条件下加速繁殖材料的个体生产，提高繁殖系数。基本原理：茎尖脱毒是控制植物病毒的有效途径；病毒在植物体内的分布具有不均匀性。3.影响茎尖培养法脱除植物病毒的因素1）材料病毒侵染的程度；2）外植体的生理状态；3）起始培养的茎尖大小4.离体繁殖的步骤过程：无菌培养物的建立（自然条件下的繁殖特点，离体下茎芽增值方式，取材部位）
培养物的增值（芽增殖，不定芽增值，胚状体增值，愈伤组织增值）器官分化（生根培养）
植株形成与移栽5.花药培养：把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成为植株的过程。花药是植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。6.花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离出来，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养。从培养方法和技术方面来讲，它属于细胞培养的范畴。7.花粉培基本过程：外植体选择－外植体(花蕾)预处理―外植体消毒―剥取花药―接种―诱导培养―分化培养四分体 ― 小孢子 ― 单核花粉 ― 双核花粉最适期花粉培和小孢子培养常取四分体到单核早期的材料花药培养中花药低温处理：可以激发花粉母细胞产生两个相等核，而不是一个营养核一个生殖核；保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老；激发花粉产生原胚；促使细胞同步分裂。花培植株的后续处理形态学鉴定：不同倍性植株形态差别明显（叶、花等的形状、大小、颜色等）染色体分析：对根尖或茎尖细胞进行染色体计数。流式细胞仪鉴定：可迅速鉴定叶片单个细胞的DNA含量，进而根据DNA含量曲线图推断细胞的倍性。花陪植株染色体加倍方法：低温诱导，秋水仙素花粉培养的方法：①直接培养 ②预培养 ③哺育培养 ④看护培养 ⑤微室培养花粉的分离方法：机械挤压梯度离心法
自然散粉法――这一方法可以和预培养结合进行磁拌法幼胚培养的关键技术1. 取材时期：大多数幼胚培养成功的实例证明，适宜于幼胚培养的胚发育时期多为球形胚至鱼雷形胚。以幼胚抢救为目的的胚培养取材，必须在胚退化衰败之前。 只需将果实彻底消毒。2. 幼胚剥离
胚剥离的成功与否是幼胚培养成功与否的关键。幼胚是一种半透明、高粘稠状组织，剥离过程中极易失水干缩，一定要注意保湿，且操作要迅速。有关胚发育的细胞学和生理生化研究表明，胚柄积极参与幼胚的发育，特别是球形期以前的幼胚培养，胚剥离时应带胚柄。3. 培养条件的控制：剥离出来的幼胚要立即接种到培养基上进行培养。在培养之前必须对所培养的对象在自然发育条件下的特性充分了解，比如胚的休眠问题、是否需要春化作用、胚萌发的温度等。悬浮培养：是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。愈伤组织诱导的要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。悬浮系的建立与继代培养的过程：25℃下黑暗培养。培养初期，悬浮细胞培养物可能呈现粘稠状，影响细胞生长，需每隔3d换1次新鲜培养基。每隔1-2周继代一次（过滤或离心）。一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：悬浮培养物分散性良好，细胞团较小。一般在30-50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。细胞生长迅速。悬浮细胞的生长量一般2-3 d甚至更短时间便可增加一倍。植物细胞规模化培养体系的建立：1、种子细胞选择
2、种子细胞增殖与放大培养：足够数量的种子细胞；适宜的配套培养体系。3、大规模培养体系建立：植物细胞大规模培养，根据一个培养周期中是否添加培养基可分为成批培养、连续培养和半连续培养等。悬浮培养细胞的同步化：分选法，饥饿法，抑制剂法，低温处理提高次生代谢产物的方法1、选择适宜的起始材料
2、培养基：培养基既要满足植物细胞的生物量增长，还要满足细胞合成和积累次生产物的需要。
3、前体的应用
4、激发子的应用：也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中一个反应，并形成细胞特征性自身防御反应的分子。5、培养技术的选择原生质体分离：基础材料的准备；预处理与酶解；原生质体收集与纯化；原生质体活力测定原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。?使原生质体处于等渗或略高于细胞内的渗透压的环境中。?渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。原生质体的分离方法：（l）机械分离法（缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。）（2）酶解分离法（优点：酶解法可以获得大量的原生质体，而且几乎所有植物或它们的器官、组织或细胞均可用酶解法获得原生质体。缺点：这些酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。用酶法降解细胞壁，会影响所获原生质体的活力。）酶解法的步骤
――将材料放入酶液（叶片撕下表皮，下胚轴切成小块，悬浮细胞如细胞大小不均匀要先过滤）。
――抽真空5-10 min。
――酶解：24-28℃，pH 5.4-6.0，黑暗静止条件下进行，每隔一段时间轻轻晃动。 ?原则：以最低的酶浓度最短的时间得到尽可能多的有活力的原生质体。?酶的种类、浓度和酶解时间因材料而异。原生质体活力测定1. FDA法 原理：本身无荧光，可透膜，进入细胞后，受内酯酶作用分解成有荧光的物质，紫外线照射产生绿色荧光。无活力的原生质体无荧光。有叶绿素的原生质体，黄绿色荧光为有活力，红色荧光无活力。2. 形态特征观察：形态完整，含饱满细胞质，颜色新鲜的正常球形原生质体为有活力的原生质体。同时，可根据胞质环流来确定原生质体活力。3. 荧光增白剂（CFW）染色法
原理：检测细胞壁的形成从而确定原生质体活力。结合于新合成的细胞壁上，400nm激发光产生绿色荧光。?细胞壁分解完全无荧光（红色荧光），有活力的原生质体随细胞壁的再生会产生绿色荧光。体细胞杂交是指两个离体细胞通过一定诱导技术使质膜接触而融合在一起随后导致两个细胞核物质融合的技术。 植物体细胞杂交则是指除去细胞壁的原生质体融合。体细胞融合方法：物理法：显微操作、电融合化学法：PH法、硝酸钠融合法。生物法：仙台病毒法。杂种植株的鉴定方法：1.形态学鉴定根据双亲的形态学性状观察进行鉴定。如叶片的大小、形状，花的颜色、花形等。2.染色体计数鉴定――数目、形态3.生化分析――同工酶分析体细胞杂种的同工酶谱可表现为双亲酶带的总和，或同时出现双亲特有的谱带，或也有可能出现新的杂种带和丢失部分亲本带。体细胞杂交技术的应用1.获得新物种：通过远缘不亲和的种间、属间、甚至科间的原生质体融合，往往可以把两个亲本的染色体组合在一起，形成杂合二价体。如果杂种植株可育，并能稳定遗传，就有可能形成新物种。2.培育作物新种质和新品种通过近缘种内或种间的原生质体融合，可以获得稳定的具有双亲两套染色体的体细胞杂种植株。他们往往可育，并能直接作为育种的新材料从中选育新品种。在转移与栽培种有性杂交不亲和的野生种所具有的优良抗性基因方面具有重要意义。Eg. 马铃薯栽培种与野生种融合，得到抗马铃薯Y病毒的杂种植株。3.转移细胞质基因控制的性状体细胞杂交涉及的基因重组包括核基因重组和质基因重组。创造了细胞质变异的新途径。在雄性不育性状转移上具有重要的意义。人工种子：人工种子亦称体细胞种子。 根据包被分：1、繁殖体的类型：裸露的或休眠的繁殖体（干燥的体细胞胚，休眠的块茎等）2、人工种皮包被的繁殖体
3、水凝胶包埋在人为包被的人工种子所选繁殖体的类型：体细胞胚繁殖体、微型营养变态器官繁殖体、芽繁殖体。体细胞胚作为繁殖体的要求：首先其基本要求是要具有发育上的同步性，还必需满足形态正常，具有完整的胚结构；与母体植物的基因型基本相同，特别是在重要经济性状和农艺性状上没有变异；具有较好的成熟性，能耐一定程度的脱水。其次，作为实用化的体细胞胚种子还必需满足一定的数量需求，规模化生产是其基本前提。 包含各类专业文献、文学作品欣赏、专业论文、外语学习资料、幼儿教育、小学教育、细胞工程复习230等内容。
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··········
硕士学位论文
拟南芥器官发生及体细胞胚发生相关基因的表达模式分析
姓名：辛伟
申请学位级别：硕士
专业：细胞生物学
指导教师：向凤宁
山东大学硕士学位论文
植物细胞具有全能性，任何一个细胞都有发育成完整个体的潜在能力。其主
要体现在植物组织培养中的脱分化、分化、器官形成或胚胎发生直到完整植株的
形态建成等一系列过程中。离体器官发生是指培养条件下植物的组织或细胞团
愈伤组织 分化形成不定芽，不定根或花芽等器官的过程。体细胞胚胎发生是
指离体条件下植物的体细胞通过与合子胚发生相类似的途径发育成新个体的过
程。目前，有关不定芽再生及体细胞胚发生的分子机理和基因调控研究还很少，
有待展开系统的研究。
本研究以发育成熟的拟南芥种子为外植体，建立了高频率不定芽再生的离体
培养体系。详细地研究了离体器官发生和不定芽再生的形态学和组织学变化，分
并分析了生长素极性分布在离体器官发生过程中的作用，为理解离体器官发生和
不定芽再生的发育过程及其分子机理提供重要信息。
另外，利用拟南芥成熟种子获得分化与非不分化的愈伤组织，并分析体细胞
胚发生相关基因在上述愈伤组织中的表达变化，为深入研究体细胞胚发生的分子
机制奠定了基础。
主要研究结果如下：
1．高频率不定芽再生培养体系的建立
利用C01．0生态型拟南芥成熟种子为外
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