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抗咽喉细菌复合抗原的IgY抗体活性研究
11:25:40&& 来源：本站&& 作者：管理员&& 人气：590次
抗咽喉细菌复合抗原的IgY抗体活性研究
蒙永祥 张 玲① 黄春龙 林学颜② 广东省大日生物化学药业有限公司,广州510507中国图书分类号 R730 文献标识码 A 文章编号
[摘 要] 目的:应用咽喉分离的细菌混合抗原免疫母鸡,提取鸡蛋黄中IgY ,通过ELISA方法证实IgY抗体的特异活性.
方法:采取咽喉炎相关的多种细菌作抗原免疫产蛋母鸡,收集鸡蛋,从蛋黄中提取IgY ,经纯化后进行SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳和抗体活性的ELIAS测定.结果:电泳呈现12条带,证明IgY抗体中至少有12种抗体成分, ELISA结果表明IgY抗体效价为1:512.热稳定性试验结果显示,在37℃温度下, IgY抗体活性无改变.结论:应用多种混合的细菌抗原免疫母鸡,其鸡蛋黄中含有相应的IgY抗体成分,对热具有高度稳定性.
[关键词] 鸡蛋黄;免疫球蛋白IgY;细菌复合抗原;抗体
Study on the activity of IgY against complex bacteria in pharynx and throat
MENGYong2Xiang,ZHANGLing,HUANGChun2Long,LINXue2Yan.GreatSunCompanyofBiochemistryPharmacolo2gy,Guangzhou515007,China
[Abstract] Objective:To detect the activity of IgY against complex bacteria in pharynx and throat.Methods:Purified antigens against bacteria in pharynx and throat was used to immunize egglaid hens. The eggs from immunized hens were collected and abstract IgY from the yolks. The antibody activity of IgY was detected by SDS2PAGE electrophoresis and ELISA.Results:SDS2PAGE electrophoresis represented at least twelve ladders ,and the titer of ELISA was 1:512.Conclusion:IgY antibody was obtained in egg yolk after immunized hens with complex bacteria. The activity of IgY was detected. IgY showed stable to heat.
[Key words] E Immunoglobulin yolk IgY;BacteAntibody
采用鸡作为免疫宿主产生大量有效的免疫球蛋白IgY是收集抗体的好方法.Klemperer在1893年已指出母鸡的抗体是从血清传递至蛋黄中,授予鸡胚胎或雏鸡的被动免疫性.1981年Jensenius等,通过实验证实鸟类就像哺乳类动物一样,用抗原免疫的母鸡产生抗体的免疫性可以通过血清转递至蛋黄中,以保护其子代.由于在鸡体内只有IgG分子能通过卵黄囊转输至蛋黄中,因此用抗原免疫的母鸡所生的鸡蛋黄中只有IgG分子,因鸡蛋黄的英文名称为"Yolk",特取它的第一个字母"Y"为代表,将鸡蛋黄中的免疫球蛋白IgG称之为IgYImmunoglobulinYolk ,IgY.IgY的优点是由于它的种系发生距离较远 1 ,IgY抗体可以识别一些哺乳类动物相同类型的蛋白质,使它得到更广泛的应用,以常规的免疫学方法获得IgG抗体和IgY抗体相比较,免疫一只兔每月可获得200 mg IgG特异性抗体约5 %,鸡的IgY抗体每月可收获1 500 mg特异性IgY为2 %～10 % 2 .Fis2cher等人的研究也指出IgY抗体具有无需放血,仅收集免疫的鸡蛋,即可从蛋黄中获得①中山大学肿瘤防治中心实验研究部,广州510089②中山大学中山医学院免疫学教研室,广州510089作者简介:蒙永祥1959年-,男,副主任医师,主要从事新药研制开发.大量而效价持久的IgY抗体,方便而经济, IgY的分离快速而简单等特性 3 .本文应用引起咽喉炎和扁桃体炎的病原菌免疫产蛋的母鸡,提取鸡蛋黄中IgY抗体,并采用SDS2聚丙烯酰胺凝胶SDS2PAGE电泳检测其抗体成分, ELISA测定其活性 4 ,并进行IgY热稳定性试验.结果证实鸡蛋黄中IgY抗体的特异性活性,为免疫球蛋白IgY在临床诊断与治疗的应用提供了有力的依据.
1 材料与方法
111 动物 来亨鸡购于华南农业大学.
112 抗原 多种细菌复合抗原由广东省大日生物化学药业有限公司和美国雅臣药业集团有限公司提供,其中含金黄色葡萄球菌,白色葡萄球菌,β2溶血性链球菌,G簇溶血性链球菌,肺炎球菌,类白喉杆菌,乳杆菌,大肠埃希氏菌,拟杆菌等研制"喉友"咽喉喷剂的细菌复合抗原,冻干保存备用.
113 免疫 新产蛋母鸡两只,每只分别于双翅皮下,背部两侧皮下,腹部和双腿部皮下注射,每周1次,每次注射抗原1 ml加完全福氏佐剂,共4次,最后一次注射后3天,加强免疫一次,一周后开始收集鸡蛋,置4℃冰箱保存备用. 393 蒙永祥等 抗咽喉细菌复合抗原的IgY抗体活性研究 第6期
114 IgY抗体的纯化 鸡蛋外壳经消毒后,剪一小孔,吸除蛋白,分离提取蛋黄液,加9倍体积pH710 , 011 molPL磷酸缓冲液含0106 molPL NaCl,置电动搅拌器搅匀,应用10 mgPml蛋黄液,上DEAE2Sepha2dex A50柱215×315 cm滤过,分部收集20 mlPh, 510 mlP分部.取每峰洗脱液,以ELISA方法测定抗体活性,用0122μm滤膜除菌并冻干.
115 ELISA试验 按常规方法进行.羊抗鸡IgG2HPR生产厂家KPL , Size : 0105 mg ,使用浓度范围: 1:500～1:2 500.
11511 包被抗原:酶标反应板在包被前用缓冲液洗涤3次,甩干,每排1～10孔加抗原011 ml包被,第12孔加包被液011 ml ,置4℃过夜.
11512 次日倾去所有液体,以洗涤液洗4次,每孔加5 %小牛血清稀释液011 ml ,置37℃培养箱封闭40分钟或置4℃过夜,洗4次.
11513 加样:取上述纯化的待测IgY抗体,用5 %小牛血清稀释液按1:2,1:4,1:8等倍比稀释至1:1 024,第1～10孔分别加等比稀释液011 ml ,每个稀释度设3个复孔,第12孔加5 %小牛血清011 ml ,置37℃培养箱孵育40分钟后,取出洗4次.
11514 每孔加入羊抗鸡IgG2HRP抗体011 ml ,置37℃培养箱40分钟,然后洗4次.
11515 显色:每孔加入酶免底物一滴,显色后再加一滴终止液,终止显色反应.
116 SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 取SDS2聚丙烯酰胺凝胶1支,溶于200 ml双蒸水,分装小管,10μlP管,取一管加Tris2HCl缓冲液10μl ,室温融化后,在沸水浴中加热5分钟后上样.电泳时间为50分钟,干胶后,用考马斯兰R2250染色,观察结果.
117 IgY热稳定性试验 将纯化的IgY抗体原液,分别置37℃,45℃,55℃,65℃,75℃,15分钟后,以上述缓冲液稀释500倍,进行ELISA试验.
211 SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 纯化的鸡蛋黄IgY经SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳后用考马斯兰R2250染色,显示12条带见图1.
212 ELISA测定结果 按上述操作后,酶标板置酶标仪450 nm波长,检测OD值,以PPN值≥211为阳性,结果如表1.由表1可以看出,根据PPN值≥211为阳性,当倍比稀释度到1:512时仍为阳性,表明"喉友"口腔喷剂中IgY浓度达到该水平即可检出,即其效价为1:512.
213 IgY热稳定性 37℃15分钟, IgY抗体的活性几乎无变化,在45℃,55℃,65℃15分钟, IgY抗体活性下降约30 % ,在75℃其活性迅速下降.图1 IgY SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳结果Fig. 1 Result of SDS2PAGE electrophoresis for IgY
Note :1 ,2. purifyied IgY;M. marker.表1 EL ISA测定IgY活性的结果Tab. 1 The activity of IgY detected by EL ISA No1112
Dilution of sample1:21:41:81:161:321:641:21:1 024PBlank control.OD value Average OD value of three repeated wells 04P01133 PPN value11534PP Note :PPN value represented the ratio of OD value between sample and blank control . 493 中国免疫学杂志2004年第20卷
据考证IgY的进化已有300亿年的历史,从它的进化过程表明IgY的功能可能是从IgG进化的,而且是较高级的抗体.IgY存在于多种动物中,由较低等的动物,两栖类脊椎动物,以至高级的鸟类,在这些不同种属的动物中,IgY是血液中的IgG透过卵黄囊转递至蛋黄中的免疫球蛋白,近年来已经由许多免疫学家研究证实,蛋黄中的IgY十分浓集,滴度比血液IgG至少高一个滴度.我们实验室测定结果也表明蛋黄IgY浓度比血液IgG高一个滴度.由于IgY的种系发生与哺乳动物IgG抗体的相距较远.因此,采用抗原免疫产蛋母鸡从鸡蛋黄中可以收集到大量纯度高的IgY ,可作为医学上的诊断试剂和治疗制剂 5 ,6 ,其优点之多是免疫哺乳类动物不可替代的,用抗原免疫母鸡收集鸡蛋方便,无需放血和宰杀动物并可大量连续地收集鸡蛋提取IgY ,源源不断地为诊断试剂和治疗制剂提供原料.本实验应用咽喉炎,扁桃体炎患者炎症局部常见细菌和正常人咽喉部分离的细菌,如A簇β型溶血性链球菌,肺炎双球菌,溶血性链球菌,金黄色葡萄球菌,白色葡萄球菌等细菌混合免疫来亨鸡,再从免疫母鸡的鸡蛋黄中提取获得IgY抗体,经SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳后所呈现的12条带,说明了本实验应用细菌免疫母鸡能够得到相应的IgY抗体,在ELISA实验中也得到了证实;本实验对IgY抗体的
稳定性也进行了研究,结果表明IgY抗体在37℃条件下稳定性好,适于大量制备和保存.多年来人们一直沿用传统的免疫学方法,利用抗原免疫哺乳动物,例如鼠,兔,羊或马等,再抽取血液分离血清,从中提取免疫球蛋白抗体,用于研制各种生物药物和诊断试剂,为人类疾病的诊断治疗和预防作出了巨大的贡献.随着科学的飞速发展,从免疫母鸡所生的鸡蛋黄中提取IgY抗体制备生物诊断试剂和治疗
制剂是一项崭新的技术,它有可能逐渐替代应用免疫动物提取血清免疫球蛋白的传统方法.
4 参考文献
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[收稿 修回
编辑 许四平
上接第392页
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[收稿 修回
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