如何用transwell测角膜内皮细胞计数仪通透性

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2015-03-06 01:31 标签： 角膜内皮细胞计数
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【求助】用transwell测内皮细胞通透性
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这个帖子发布于5年零364天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
由于实验要用transwell测内皮细胞通透性，不知道如何选择型号和孔径等问题，有谁做过，请指点一下，谢谢了
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淋巴细胞一般选用5um的肿瘤细胞及DC则选用8um的根据细胞的大小来选择
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我的经验，EC migration用的fiter的的pore size 为8um。建议你买corning的24孔板的transwell(我们实验室别人用过)，培养板和transwell配套的，效果蛮好的，我用过millipore的millicell inserts。价格差不多30元一个，国内一般都有现货的。migration的实验要注意培养板与insters要注意配合，这决定了the bottom chamber 的家液量和the upper chamber的细胞悬液的量。
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谢谢各位，还有一个问题，我看有人用荧光染料来检测，可我们实验室条件有限，有没有人用其他的染料或什么方法来检测这两个室的浓度差？以此来判断内皮细胞的通透性的改变？谢谢
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greentrees 我的经验，EC migration用的fiter的的pore size 为8um。建议你买corning的24孔板的transwell(我们实验室别人用过)，培养板和transwell配套的，效果蛮好的，我用过millipore的millicell inserts。价格差不多30元一个，国内一般都有现货的。migration的实验要注意培养板与insters要注意配合，这决定了the bottom chamber 的家液量和the upper chamber的细胞悬液的量。我也想做内皮细胞的迁移，是不是内皮细胞比较大，必须用8um的小室阿？小室使用之前要先用明胶或其他的处理吗？最后染色好像有好多种说法，有说用乙醇固定，有用甲醛固定的，染料也各不一样，到底怎么样比较合适阿？
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平滑肌细胞transwell实验
亲爱的虫友们，我现在在做平滑肌细胞transwell实验，具体步骤如下：
1 制作人工基底膜混合液：取出-20?C冻存的Matrigel凝胶，预置4?C融化后，按1：5比将100ulMatrigel与500ul 无血清DMEM培养基混合，整个操作过程在冰上及无菌条件下进行。
2 包被基底膜：Transwell上室多孔Polycarbonate（聚酯碳酸酯）滤膜上加入人工基底膜混合液50ul，37℃平铺胶化2~3h。
3 准备细胞悬液和小室
（1） 消化法从细胞培养瓶中获取细胞：消化、离心和计数后用无血清DMEM培养基制备成单细胞悬液；
（2） 上室加入200ul单细胞悬液（细胞数约为1.5×105/室）；
（3） 下室加入800ul含20%FBS的DMEM；
（4） 装有Transwell小室的24孔板放置37℃、5%CO2的培养箱中培养。
5 染色和计数
培养结束，取出Transwell小室，PBS洗涤3遍（每遍5min）；
4%多聚甲醛室温固定15min，PBS洗涤3遍 ；
用棉签轻轻擦去上层未穿透膜的VSMC；
0.5%结晶紫染色15~30min，PBS洗涤3遍；
风干，揭下滤膜后反贴在载玻片上，用显微镜低倍镜观察，每个滤膜随机选取3个视野，高倍镜（×200）下分别计数3个视野的穿膜细胞数，计算每个视野的平均细胞数。
我觉得以上步骤是没有问题的，但是我取12h和36h的tanswell小室进行染色，一个细胞都看不到，所以在此想请教各位虫友，是不是时间短，细胞没有侵袭下来？还是我没有染上颜色呢？我买的结晶紫是2.5%的结晶紫染液，用ddH2O稀释成0.5%染的，难道是稀释结晶紫的时候不能用ddH2O，得用无水乙醇或是PBS？你们稀释结晶紫是用什么稀释的啊？
有没有做过平滑肌细胞迁移的战友啊，你们做的时候平滑肌细胞大约多长时间能侵袭下来啊？
急求围观。。。。。
我以前用双蒸水配多聚甲醛，固定后就测不到细胞了，原因一样，你用双蒸水配结晶紫，结果就是不等渗，细胞都破碎了，细胞核都溜了，自然就看不到。建议用PBS稀释。没做过平滑肌细胞，所以时间不知道，感觉12h不够长，围观。。。 : Originally posted by western虫 at
我以前用双蒸水配多聚甲醛，固定后就测不到细胞了，原因一样，你用双蒸水配结晶紫，结果就是不等渗，细胞都破碎了，细胞核都溜了，自然就看不到。建议用PBS稀释。没做过平滑肌细胞，所以时间不知道，感觉12h不够长， ... 谢谢，我再重新配配多聚甲醛试试~~~~~ 呜呜。。。。。。大家快来交流一下啊~~~~~自己顶一下！ 你都完结了，自然交流少了。
如果还没确定，给星星的时候，少给几个
另外，请关注本版置顶帖，里面有惊喜 前辈，我现在正在重复你的实验，经历你当时的痛苦！
请教一下：如何“用棉签轻轻擦去上层未穿透膜的VSMC；”？
具体操作，还望赐教？
如何确定完全擦掉了呢？
var cpro_id = 'u1216994';
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