第五章紫外吸收及荧光光谱法(2011)_百度文库
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第五章紫外吸收及荧光光谱法(2011)
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紫外可见吸收光谱法
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官方公共微信第5章 紫外吸收光谱分析法（5）上课用_石河子大学：电化学_ppt_大学课件预览_高等教育资讯网
石河子大学：电化学：第5章 紫外吸收光谱分析法（5）上课用
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生物工程学院 1第五章紫外 -可见吸收光谱分析法第一节 概 述generalization第二节 光的吸收第三节 光吸收的基本定律Lambert-Beer’sLaw第四节 紫外可见光分光光度计 UV-VIS spectrometer第五节 定性与定量分析Qualitative- QuantitativeAnalysisUltraviolet-visiblemolecular absorptionspectrometry,UV-VIS 生物工程学院 2第五章紫外 -可见吸收光谱分析法第一节 概 述generalizationUltraviolet-visiblemolecular absorptionspectrometry,UV-VIS一、定义二,分光光度法与 比色法区别三、特点 生物工程学院 3紫外吸收光谱：分子价电子（最外层电子）能级跃迁。波长范围,100-760 nm.(1) 远紫外光区,100-200nm(2) 近紫外光区, 200-400nm(3)可见光区,400-760nm250 300 350 400nm1234eλ可用于结构鉴定和定量分析。电子跃迁的同时，伴随着振动转动能级的跃迁 ;带状光谱。 生物工程学院 4? 一、定义? 基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法, 包括 比色法, 可见分光光度法及紫外分光光度法 等 。 本章重点讨论可见光区的吸光光度法及紫外光区的紫外分光光度法 。? 日常分析工作中 ----KMn04水溶液呈深紫色, K2CrO4溶液呈黄色, CuSO4溶液呈蓝色 ……当这些有色物质溶液的浓度改变时, 溶液颜色的深浅也随之改变, 溶液越浓, 颜色越深 ----可以通过比较溶液颜色的深浅来测定物质的含量 。? 这种基于比较溶液颜色的深浅进行定量分析的方法, 称为 目视比色法 。 采用分光光度计对物质吸光度进行测定, 从而求出物质含量的方法, 称之为 分光光度法 。 生物工程学院 5? 紫外 -可见吸收光谱分析法 是利用物质的分子对某一波长范围的光的吸收作用, 对物质进行定性分析, 定量分析及结构分析的方法 。? 按所吸收光的波长区域不同, 分为紫外分光光度法 (200-400nm)和可见分光光度法 (400-760nm)，合称为紫外 ―可见分光光度法 (200-760nm)。? 分光光度法是在比色法 ( colorimetry)的基础上发展起来的 。 生物工程学院 6二,分光光度法 与 比色法区别? 比色法只限于在 可见光区,分光光度法则可以扩展到 紫外光区和红外光区 。? 比色法用的 单色光 是来自滤光片，谱带宽度从 40－ 120nm,精度 不高，分光光度法则要求近于真正单色光，其光谱带宽最大不超过 3－ 5nm,在紫外区可到 1nm以下，来自棱镜或光栅，具有较高的精度。 生物工程学院 7三、紫外 ―可见分光光度法特点? (1) 仪器设备和操作都比较简单, 费用少, 分析速度较快 。? (2)灵敏度较高 。? (3)有较好的选择性 。 通过适当地选择测量条件, 一般可在多种组分共存的体系中, 对某一种物质进行测定 。? (4)精密度和准确度较高 。 在仪器设备和其他测量条件较好的情况下, 其相对误差可减小到 1％ 一 2％ 。? (5)用途广泛 。 医药, 化工, 冶金, 环境保护, 地质等诸多领域 ---已成为必不可少的测试手段之一 。? 无机和有机物质 --定性和定量测定,结构分析 。 生物工程学院 8第五章紫外 -可见吸收光谱分析法第二节 光的吸收Ultraviolet-visiblemolecular absorptionspectrometry,UV-VIS一、光的基本性质二,物质的颜色和对光的选择性吸收三,吸收光谱曲线四、紫外吸收光谱的产生五、有机物吸收光谱与电子跃迁 生物工程学院 9? 一, 光的基本性质? 光是一种电磁波, 具有波动性和微粒性 。? 波动性 ??＝ C微粒性? 波长 (或频率 )一定, 光子的能量一定 。 波长越短,光子的能量越大 。?? E，注,? 生物工程学院 10? 自然界中存在各种不同波长的电磁波, 电磁辐射 (电磁波 )按其波长可分为不同区域,? ?一射线 5*10-3?0.14nm? X一射线 10-3?10nm? 远紫外 10?200nm? 近紫外 200?400nm? 可见光 400?760nm? 近红外 0.75?2.5?m? 中红外 2.5?50?m? 远红外 50?1000?m? 微波 0.1?100cm? 无线电波 1?1000m? 分光光度法所使用的光谱范围在 200nm-10μ（ 1μ= 1,000nm ） 之间 。 其中 200nm－ 400nm为紫外光区, 400nm－760nm为可见光区, 760nm－ 10,000nm为红外光区 。 生物工程学院 11? 理论上将具有同一波长的光称为 单色光,由不同波长的光组成的光称为 复合光 。? 人眼能感觉到的光称为 可见光, 它的波长范围约为 400―760nm。 白光 (日光, 白炽灯光,日光灯光等 )是由各种不同色光按一定强度比例混合而成的 。? 一束白光通过三棱镜可分为红, 橙, 黄,绿, 青, 蓝, 紫等七种色光, 这七种色光可以混合为白光 。 实验证明, 如果把适当的两种色光按一定强度比例混合, 也可以成为白光, 这两种色光称为 互补色光 。? 日光等白光是一对对互补色光按适当的强度比例混合而成的 。 生物工程学院 12? 二, 物质的颜色和对光的选择性吸收? 物质呈现的颜色与光有着密切的关系 -----与光的组成和物质本身的结构有关 。? 当光束照射到物质上时，物质对于不同波长的光的 吸收、透射、反射、折射的程度 不同，而使物质呈现不同的颜色。? 对 固体 物质来说，当 白光照射到物质上 时，如果物质对各种波长的光 完全吸收,则 呈现黑色 ；如果 完全反射,则 呈现白色 ；如果对各种波长的光 均匀吸收,则 呈现灰色 ；如果 选择地吸收 某些波长的光，则 呈现反射或透射光的颜色 。 生物工程学院 13? 对溶液来说，溶液呈现不同的颜色是由于溶液中的质点 (离子或分子 )对不同波长的光具有选择性吸收而引起的。? 当白光通过某种溶液时，如果它选择性地吸收了白光中某种色光，则溶液呈现透射光的颜色，也就是说,溶液呈现的是它吸收光的互补色光的颜色 。物质呈现颜色与吸收光波长的关系见表? 1―2。?? 互补色光图紫青蓝青蓝黄橙红白光绿 生物工程学院 14? 表 1―2物质的颜色与吸收光颜色和波长的关系物质的颜色 吸收光颜色 波长（ nm）黄绿 紫 400-450黄 蓝 450-480橙 青蓝 480-490红 青 490-500紫红 绿 500-560紫 黄绿 560-580蓝 黄 580-600青蓝 橙 600-650青 红 650-760 生物工程学院 15? 三、吸收光谱曲线? 如果将各种波长的单色光依次通过某一固定浓度的有色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度 (即吸光度 A),然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条曲线，称为 吸收光谱曲线 (简称吸收曲线 )。从曲线可以清楚地看到该有色溶液对光的吸收情况。（图 1-1）图 1-1 吸收光谱图示意 图 1-2 KMnO4 溶液的光吸收曲线 生物工程学院 16? 吸收峰（ 1） -------最大吸收波长 (?max),谷（ 2） ----最低吸收波长 (?min)；? 肩峰（ 3） ；? 末端吸收（ 4） 。? 图 1―2是四个不同浓度 KMnO4溶液的光吸收曲线 。 生物工程学院 17? 从图上可以看到：? (l) KMnO4溶液对不同? 波长的光吸收情况不同 。? 对波长为 525nm的绿色? 光吸收最多, 在吸收曲线上有一高峰, 而对红色光和紫色光吸收很少, 几乎能完全透过, 因此 KMnO4溶液呈紫红色；? (2)不同浓度 KMnO4溶液的吸收曲线形状相似, 最大吸收波长不变 。 可作为物质 定性分析的依据 ；? (3)同一物质不同浓度的溶液，在一定波长处吸光度随浓度增加而增大 。若 在最大吸收波长处测定吸光度，灵敏度最高 。这个特性可作为 物质定量分析的依据 。 生物工程学院 18四、紫外吸收光谱的产生― 电子跃迁与分子吸收光谱?物质分子内部三种运动形式：（ 1）电子相对于原子核的运动；（ 2）原子核在其平衡位置附近的相对振动；（ 3）分子本身绕其重心的转动。?分子具有三种不同能级,电子能级、振动能级和转动能级?三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量。?分子的内能,电子能量 Ee, 振动能量 Ev,转动能量 Er?一个分子吸收了外来辐射后，其 能量变化 ΔE为这 3种 能量变化之和。 即, Δ E＝ Δ Ee+ Δ Ev+ Δ Er能量大小顺序为,ΔΕe&ΔΕv&ΔΕr 生物工程学院 19能级跃迁当分子从外界吸收能量之后，产生 电子跃迁,即分子最外层电子或价电子由 基态跃迁至激发态 。电子能级间跃迁的同时，总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现 光谱带 --带状光谱 。E2激发态E1基态 生物工程学院 20（ 1） 转动能级 间的能量差 ΔΕr,0.005～ 0.050eV,跃迁产生吸收光谱位于 远红外区 。 远红外光谱或分子转动光谱 ；（ 2） 振动能级 的能量差 ΔΕv约为,0.05～１ eV,跃迁产生的吸收光谱位于 红外区, 红外光谱或分子振动光谱 ；（ 3） 电子能级 的能量差 ΔΕe较大 1～ 20eV。 电子跃迁产生的吸收光谱在 紫外 ― 可见光区, 紫外 ― 可见光谱或分子的电子光谱 ；讨论能量大小顺序为,ΔΕe&ΔΕv&ΔΕr 生物工程学院 21五、有机物吸收光谱与电子跃迁ultraviolet spectrometry of organic compounds?预备知识,? 价电子,σ电子 → 饱和的 σ键π电子 不饱和的 π键n电子? 轨道,电子围绕原子或分子运动的几率 ;轨道不同, 电子所具有能量不同? 基态与激发态,电子吸收能量, 由基态 →激发态? 成键轨道 (σ)与反键轨道 (σ*),σ &π&n &π*&σ*?分子轨道理论的基本内容?（ 1）分子轨道是由原子轨道线性组合而成的,分子轨道属于所有结合在一起的 原子所共有。并且 ――参加组合的原子轨道数 =组成的分子轨道数?（ 2）成键两原子各提供一个原子轨道，将产生两个能量不同的分子轨道 。 能量低于原来原子轨道的称成键分子轨道，能量高于原来原子轨道的称反键分子轨 。并且：成键分子轨道数 = 反键分子轨道数。有机化合物，他们在化学组成上有什么共同点？都含有 C原子，多数含有 H原子 --含碳的化合物或碳氢化合物及其衍生物。 生物工程学院 221．紫外 ― 可见吸收光谱,紫外 ―可见吸收光谱是由于 分子中价电子的跃迁 而产生的。按分子轨道理论，在有机分子中存在 σ, π, n三种价电子,它们对应有 σ 和 σ ＊, π 和 π ＊ 及 n轨道。当它们吸收一定能量 ?E后，可以产生 σ → σ ＊, π → π ＊, n→ σ ＊,n→ π ＊ 类型的电子跃迁（从基态向激发态 (反键轨道 )跃迁）。这些电子跃迁所需能量大小的顺序为,n→ π ＊ &π → π ＊ &n→ σ ＊ &σ → σ ＊ 。五、有机物吸收光谱与电子跃迁ultraviolet spectrometry of organic compoundssp *s *RKE,B np?EC OHnpsH形成单键的电子 -σ 键电子 ； 形成双键的电子 - π 键电子 ； 氧、氮、硫、卤素等含有未成键的孤对电子 -n键电子。 生物工程学院 232、紫外、可见吸收光谱法 研究的主要对象 几乎所有有机分子的紫外、可见吸收光谱都是由于 n→ π ＊和 共扼的 π → π ＊ 跃迁产生。并随着共轭系统延长，其最大吸收波长向长波方向移动。因此 紫外、可见吸收光谱法主要研究醛、酮,?,?-不饱和醛酮、芳香化合物、杂环化合物、共扼多烯等化合物。3、紫外、可见吸收光谱所 使用的溶剂 含有 σ → σ＊ 和 n→ σ ＊ 跃迁的化合物是测定紫外和 (或 )可见吸收光谱时的良好溶剂，如 醇、醚和饱和烷烃 等。 生物工程学院 244、溶剂对吸收曲线的影响当溶剂的极性由非极性改变到极性时，吸收峰的精细结构消失，吸收带变向平滑；同时还会使吸收的最大吸收波长 ?max发生变化，如由 n→ π ＊ 跃迁产生的吸收带发生紫移（ λ max向短波方向移动 ），而由 π → π ＊ 跃迁产生的吸收带发生红移（ λ max向长波方向移动） 。吸收强度即摩尔吸光系数 ε 增大或减小的现象分别称为 增色效应 或减色效应,如图所示。 生物工程学院 25二、紫外 -可见吸收光谱的电子跃迁类型?预备知识：? 价电子,σ电子 → 饱和的 σ键π电子 不饱和的 π键n电子? 轨道,电子围绕原子或分子运动的几率轨道不同, 电子所具有能量不同? 基态与激发态,电子吸收能量, 由基态 →激发态 c? 成键轨道与反键轨道,σ&π&n &π*&σ* 生物工程学院 26图示b 生物工程学院 27?电子跃迁类型：1.σ→ σ *跃迁：? 饱和烃 （甲烷，乙烷）? E很高,λ&150nm（ 远紫外区）2,n → σ *跃迁：? 含杂原子饱和基团 （ ―OH,―NH2）? E较大,λ150~250nm（ 真空紫外区）3,π→ π *跃迁：? 不饱和基团 （ ―C＝ C―,―C ＝ O ）? E较小,λ~ 200nm? 体系共轭,E更小,λ更大4,n→ π *跃迁：? 含杂原子不饱和基团 （ ―C ≡N, C＝ O ）? E最小,λ 200~400nm（ 近紫外区）? 按能量大小,σ→ σ * &n → σ * &π→ π * &n→ π * 生物工程学院 28图示 生物工程学院 29续前?注：?紫外光谱电子跃迁类型, n― π*跃迁π― π*跃迁? 饱和化合物无紫外吸收? 电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系? 根据分子结构 →推测可能产生的电子跃迁类型；? 根据吸收谱带波长和电子跃迁类型→推测分子中可能存在的基团 （ 分子结构鉴定 ） 生物工程学院 30三、相关的基本概念1,吸收光谱 （ 吸收曲线 ）,不同波长光对样品作用不同, 吸收强度不同以 λ~A作图 next2,吸收光谱特征：定性依据吸收峰 →λmax吸收谷 →λmin肩峰 →λsh末端吸收 →饱和 σ-σ跃迁产生 生物工程学院 31图示back 生物工程学院 32续前 3,生色团 （ 发色团 ）, 能吸收紫外 -可见光的基团? 有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团具 n 电子和 π电子的基团产生 n→ π*跃迁和 π→ π*跃迁跃迁 E较低?例,C＝ C； C＝ O； C＝ N； ― N＝ N―4,助色团,本身无紫外吸收, 但可以使生色团吸收峰加强同时使吸收峰长移的基团?有机物：连有杂原子的饱和基团?例,― OH,― OR,― NH―, ― NR2―, ― X注：当出现几个发色团共轭, 则几个发色团所产生的吸收带将消失, 代之出现新的共轭吸收带, 其波长将比单个发色团的吸收波长长, 强度也增强 生物工程学院 33续前5,红移和蓝移：由于化合物结构变化 （ 共轭, 引入助色团取代基 ）或采用不同溶剂后吸收峰位置向长波方向的移动, 叫红移 （ 长移 ）吸收峰位置向短波方向移动, 叫蓝移 （ 紫移, 短移 ）6,增色效应和减色效应增色效应：吸收强度增强的效应减色效应：吸收强度减小的效应7,强带和弱带：εmax&105 → 强带εmin&103 → 弱带 生物工程学院 34四、吸收带类型和影响因素1,R带：由含杂原子的不饱和基团的 n →π*跃迁产生?C＝ O； C＝ N； ― N＝ N―? E小, λmax250~400nm,εmax&100? 溶剂极性 ↑,λmax↓ → 蓝移 （ 短移 ）2,K带：由共轭双键的 π→ π*跃迁产生?(― CH＝ CH― )n,― CH＝ C― CO―? λmax &200nm,εmax&104? 共轭体系增长, λmax↑→红移, εmax↑? 溶剂极性 ↑,对于 ― (― CH＝ CH― )n― λmax不变对于 ― CH＝ C― CO― λmax↑→红移 生物工程学院 35续前 3,B带：由 π→ π*跃迁产生?芳香族化合物的主要特征吸收带? λmax =254nm,宽带, 具有精细结构；? εmax=200? 极性溶剂中, 或苯环连有取代基, 其精细结构消失4,E带：由苯环环形共轭系统的 π→ π*跃迁产生?芳香族化合物的特征吸收带? E1 180nm εmax&104 （ 常观察不到 ）? E2 200nm εmax=7000 强吸收? 苯环有发色团取代且与苯环共轭时, E2带与 K带合并一起红移 （ 长移 ） 生物工程学院 36图示 生物工程学院 37图示 生物工程学院 38图示 生物工程学院 39续前?影响吸收带位置的因素：1,溶剂效应：?对 λmax影响,nextn-π*跃迁：溶剂极性 ↑,λmax↓蓝移π-π*跃迁：溶剂极性 ↑, λmax↑红移?对吸收光谱精细结构影响 next溶剂极性 ↑,苯环精细结构消失?溶剂的选择 ―― 极性；纯度高；截止波长 &λmax2,pH值的影响：影响物质存在型体, 影响吸收波长 生物工程学院 40图示back 生物工程学院 41图示back 生物工程学院 42第五章紫外 -可见吸收光谱分析法第三节 光吸收的基本定律Ultraviolet-visiblemolecular absorptionspectrometry,UV-VIS一、朗伯 ――比耳定律二,透光度、吸光度、吸光系数、摩尔吸光系数三,偏离朗伯 ―比耳定律的因素 生物工程学院 43? 一、朗伯 ――比耳定律? 分 光 光 度 法 的 定 量 依 据 是 朗 伯 ――比 耳 定 律（ Lambert-Beer’sLaw ） 。? A＝ lg（ I0/I） ＝ KCL? 式中,I0为入射光强度； I为透射光强度；? A为吸光度； L为液层厚度 (即光程长度 )；? C为溶液浓度； K为吸光系数；? 上式是朗伯 ――比耳定律的数学表达式, 其 物理意义为：当一束平行单色光通过均匀的有色溶液时, 溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比 。? 朗伯 ――比耳定律 不仅适用于有色溶液，也适用于其它均匀、非散射的吸光物质 (包括液体、气体和固体 )，是各类吸光光度法的定量依据 。 生物工程学院 44? 朗伯－比尔定律是 分光光度法 的基本原理，这个定律是有色溶液对 单色光 的吸收程度与溶液及液层厚度间的定量关系。 是由朗伯定律和比尔定律归纳而得 。? 1 朗伯定律 一束单色光通过溶液后, 由于溶液吸收了一部分光能, 光的强度就要减弱：若溶液浓度不变, 则 溶液的厚度 愈大 （ 即光在溶液中所经过的途径愈长 ）, 光的强度 减低也愈显著 。 即 A=k′l? 2 比尔定律 一束单色光照射厚度一定的均匀溶液时, 吸光度与溶液的浓度成正比, 即 A=k″C? 3 朗 伯 － 比 尔 定 律如果同时考虑吸收层的厚度和溶液浓度对光吸收的影响, 则必然将朗伯定律和比尔定律合并起来, 吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比, 这就是朗伯－比尔定律 。 生物工程学院 45? 二、透光度、吸光度、吸光系数、摩尔吸光系数。? 透过光的强度 I与入射光的强度 I0之比称为透光度,用 T（ Transmittance） 表示 。 其值不大于 l。 常用百分数 (T％ )表示：即 T=I/I0, T％ =100 T。? 为了表示物质对光的吸收程度, 常采用 吸光度 A（ Absorbance） 这一概念 。 即 透光度倒数的对数值? A= lg（ 1/T） =lg（ I0/I） 。 如果 I＝ I0,说明溶液对光完全不吸收, 则 lg（ I0/I） ＝ 0； I值越小, 说明溶液对光的吸收程度越大, lg（ I0/I） 值也越大 。 因此, 将 lg（ I0/I）一项称为溶液的吸光度, 常用符号 A表示 。 即? A＝ lg（ I0/I） = lg（ 1/T） =KCL 生物工程学院 46? 通过上述讨论，可知吸光度与有色溶液的浓度成正比，而透光度与有色溶液的浓度成反比，从图 1一 5可以清楚地看出它们之间的关系。图 l一 5 吸光度、透光度与溶液浓度的关系 生物工程学院 47? 式 A＝ KCL中的 K值为吸光系数，随 C,L所用单位不同而不同。 如果液层厚度 L的单位为 cm,浓度 C的单位为 g／ l时，则常数 K用 a表示,a称为吸光系数,它的单位为 l／ g.cm； 如果 L的单位为 cm,C 的单位为 mol／ l时，则常数 K用 e表示,e称为摩尔吸光系数,它的单位为 l／ mo1.cm,e 在数值上等于浓度为 1mol／l,液层厚度为 1cm时有色溶液的吸光度，但是,在分析实践中，不能直接取浓度为 lmol／ l的有色溶液测定e值，而是测定适当低浓度溶液的吸光度。通过汁算求得 e 值。 由于 e值与入射光的波长有关,故在表示某物质溶液的 e时,常用下面标注的入射光的波长。在某 ―物质的最大吸收波长 (峰 )处所测得的摩尔吸光系数用 e?max表示。 e?max 数值范围在 10一 105之间，e?max?104认为是强吸收 ；在 103?104之间是中强吸收 ；e?max ＜ 103是弱吸收。 生物工程学院 48? 吸光系数与物质的熔点或沸点等物理常数一样, 是鉴定物质的重要依据 。 有时不同物质可能有相同的入 max, 但它们的吸收系数却不一定相同 。 在化合物组成成分不明的情况下, 物质的相对分子量是一无所知的,故而摩尔浓度无法确定,就无法使用摩尔吸光系数 。 为了方便起见, 还 常 采 用 比 吸 光 系 数 （ SpecialAbsorptirity)这一概念 。? 比吸光系数是质量浓度为１ ％ （ W/V),l为１ cm时的吸光度值, 用 E1cm1%表示 。 E1cm1%与 e间的关系式为 e=M,E1cm1%/10 ； 式中 M为吸光物质的相对分子质量 。 生物工程学院 49? 举例,Fe（ Ⅱ ） -2,2′,2′′-三联吡啶在波长 522nm处的摩尔吸光系数为 e为 1.11*104L·mol-1·cm-1, 用 1cm吸收池在该波长处测得百分透光度为 38.5 。 试计算铁的浓度为多少？? 解：? （ 1） 首先将百分透光度改写成透光度并换算成吸光度：? 100T= 38.5 ； T=0.385； A=-lgT= 0.415? （ 2） 由朗伯 -比耳定律得,A=eCL? C=A/ eL= 0.415/（ 1.11*104* 1） =3.74*10-5 mol·l-1? 答：略 生物工程学院 50? 三, 偏离朗伯 ―比耳定律的因素? 根据朗伯 ―比耳定律，当吸收池厚度不变，以吸光度对浓度作图时，应得到一条通过原点直线 。但在实际工作中，吸光度与浓度间的线性关系常常发生偏离，即对比耳定律发生偏离，一般以负偏离的情况居多。引起偏离比耳定律的因素很多，下面讨论一些较为常见的因素 。 生物工程学院 51? 1 非单色光,在所有偏离比耳定律的因素中,非单色光是较为重要的一个因素 。严格地说，朗伯 ―比耳定律 仅适用于单色光 。但在实际上,经过分光后用于测量的是一小段波长范围的复合光。 由于吸光物质对不同波长的光的吸收能力不一样，就导致了对比耳定律的负偏离。? 在所使用的波长范围内，吸光物质的吸收能力变化越大，这种偏离就越显著。例如，按图 1-6所示的吸收光谱，谱带 I的吸光系数变化不大，用谱带 I进行分析，造成的偏离就比较小。 而谱带 Ⅱ 的吸光系数变化较大，用谱带 ?进行分析就会造成较大的负偏离。所以,通常选择吸光物质的最大吸收波长作为分析用波长。? 这样，不仅能保证测定有较高? 的灵敏度，而且此处曲线较为平坦，? 吸光系数变化不大，对比耳定律的? 偏离程度就比较小。 生物工程学院 52? 2 朗伯 -比耳定律通常只适用于稀溶液。? 3 光的散射也会造成对朗伯 -比耳定律的偏离。? 4 光的折射，溶液中物质产生的荧光、非平行光等都可以造成对比耳定律的偏离。但这些因素造成的偏离对测定的影响很小，一般可忽略不计。例如，在入射光束与光轴的夹角为 50时，非平行光引起吸光度的最大相对偏差仅为 0,2％。 生物工程学院 53第五章紫外 -可见吸收光谱分析法 一、基本组成general process二、分光光度计的类型types of spectrometer三、分光光度计的校正第四节紫外 ―可见分光光度计Ultraviolet-visiblemolecular absorptionspectrometry,UV-VISultraviolet -visible spectrometer 生物工程学院 54仪器紫外 -可见分光光度计 生物工程学院 55一、基本组成general process光源 单色器 样品室 检测器 显示1,光源,作用 --提供入射光在整个紫外光区或可见光谱区 可以发射连续光谱,具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区, 钨灯 作为光源，其辐射波长范围在 320～ 2500 nm。紫外区,氢,氘灯 。发射 185～ 400 nm的连续光谱。 生物工程学院 562.单色器作用：将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光（的光学系统） 。①入射狭缝,光源的光由此进入单色器；②准光装置,透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件,将复合光分解成单色光； 棱镜或光栅；④聚焦装置,透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝 。 生物工程学院 57能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅棱镜有玻璃和石英两种材料。它们的 色散原理是依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开 。 由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于 350 ~ 3200 nm的波长范围，即只能用于可见光域内。石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从 185 ~ 4000nm,即可用于紫外、可见和近红外三 个光域 。光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的, 它可用于紫外、可见及红外光域,而且在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点是各级光谱会重叠而产生干扰。 生物工程学院 583.样品室样品室 放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件 。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在 紫外区须采用石英池, 可见区一般用玻璃池。注意,用作盛空白溶液的比色皿与盛试样溶液的比色皿应互相匹配，即有相同的厚度与相同的透光性。为了减少反射损失，比色皿的光学面必须完全垂直于光束方向。? 不能用手指拿比色皿杯的光学面，用后要及时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过 15分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。 生物工程学院 594.检测器利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号,常用的有光电池、光电管或 光电倍增管 。5,结果显示记录系统检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理 生物工程学院 60?紫外 -可见分光光度计与 可见分光光度计的异同点：相同点：均遵守朗伯 -比耳定律 。不同点,（ 1） 测定波长范围不同：可见分光光度计是 400-760nm。紫外可见分光光度计是 200-760nm。（ 2） 使用的光源不同：可见分光光度计使用的是钨丝灯或卤钨灯；紫外可见分光光度计在可见区使用的是钨丝灯或卤钨灯, 在紫外区使用的是氘灯 。（ 3） 使用的吸收池不同：可见分光光度计使用的是玻璃比色皿；紫外可见分光光度计在可见区使用的是玻璃比色皿, 在紫外区使用的是石英比色皿 。（ 4） 单色器中的色散元件不同：可见分光光度计使用的是玻璃棱镜；紫外可见分光光度计使用的是石英棱镜 生物工程学院 61二、分光光度计的类型 types of spectrometer? 按光路结构可分为：?单光束分光光度计 (如上分厂的 751型、日本岛津 Uv―120型,721分光光度计 )；? 单波长双光束分光光度计 (如日本岛津 Uv一 200型，国产710型,730型,740型 )；?双波长双光束分光光度计?（国产 WFZ800-5型，?岛津 Uv一 260,265,300型）?三种。 生物工程学院 62二、分光光度计的类型 types of spectrometer?1.单光束,经单色器分光后的 一束平行光,轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描。2.双光束,经单色器分光后经反射镜分解为 强度相等的两束光,一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的 透射比,经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来 。 自动记录，快速全波段扫描。特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。 生物工程学院 633.双波长,由同一 光源发出的光被分成两束,分别经过 两个单色器,得到两束不同波长（ ?1和 ?2）的单色光；快速 交替照射同一吸收池 而后到达检测器。产生交流信号 。 最后由显示器显示出两个波长处的 吸光度差值 ΔA（ ΔA=A?1-A?2）。对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波长分光光度法，往往能提高方法的灵敏度和选择性。利用双波长分光光度计，能获得导数光谱。 生物工程学院 64三、分光光度计的校正通常在实验室工作中，验收新仪器或实验室使用过一段时间后都要进行 波长校正和吸光度校正 。建议采用下述的较为简便和实用的方法来进行校正：镨铷玻璃或钬玻璃 都有若干特征的吸收峰，可用来 校正分光光度计的波长标尺,前者用于可见光区，后者则对紫外和可见光区都适用。也可用K2CrO4标准溶液来校正吸光度标度 。 生物工程学院 65四、分析条件的选择在分析工作中，要使分析方法有较高的灵敏度和准确度，就要选择最佳的试样测定条件，这些条件包括仪器测量条件、试样反应条件以及参比溶液的选择等等。 生物工程学院 66(一 )仪器测量条件的选择1,适宜的吸光度范围偏离朗伯 -比尔定律的一些因素可以给测量带来误差；除此以外，仪器光源不稳定、实验条件的偶然变动、读数精度变动等也可以带来测量误差。这些因素特别是对于浓度较大或较小试样的测定结果影响较大，这就要求选择适宜的吸光度范围（ 0.2―0.8），以使测量结果的误差最小。 生物工程学院 67? 2,入射光波长的选择? 通常是根据被测组分的吸收光谱, 选择最强吸收带的最大吸收波长 ( ? max)为入射光波长 。这样可以得到最大的测量灵敏度, 称为 最大吸收原则 。 当最强吸收峰的 峰形比较尖锐 时, 往往选用吸收稍低, 峰形稍坦的 次强峰或肩峰 进行测定 。 生物工程学院 68?3,狭缝宽度的选择较为精密的分光光度计的狭缝宽度都是可调节的。狭缝宽度直接影响测定的灵敏度和校准曲线的线性范围。狭缝宽度增大，入射光的单色性降低，在一定的程度上会使灵敏度下降，校准曲线偏离朗伯 -比尔定律。当然，并不是狭缝宽度越小越好。 为了选择合适的狭缝宽度，应以减小狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准。一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的 l／ 10。 生物工程学院 69?(二 )显色反应条件的选择对多种物质进行测定时, 常常利用显色反应将被测组分转变为在一定波长范围内有吸收或吸收较大的物质 。 常见的显色反应有配位反应, 氧化还原反应以及增加生色基团的衍生化反应等等 。 生物工程学院 70?1,酸度溶液的酸度对显色反应的影响是多方面的 。例如影响显色剂的颜色变化, 影响有机弱酸的配位反应, 影响被测组分的存在形式等 。 显色反应最适宜的酸度范围可通过实验来确定,测定某一固定浓度的试样的吸光度随酸度的变化, 以吸光度为纵坐标, 溶液的 pH值为横坐标作图 。 曲线的平直部分 ――吸光度恒定部分, 所对应的 pH范围,就是最适宜的酸度范围 。2,显色剂的用量加入过量的显色剂 (developer)可使显色反应趋于完全 。 但显色剂浓度过大, 有可能改变化合物的组成, 使溶液的颜色发生变化 。 生物工程学院 713.显色时间和温度各种显色反应的反应速率各有不同, 需要的反应时间也不一样 。 有些显色反应在实验条件下可瞬间完成,颜色很快达到稳定, 并在较长的时间范围内变化不大 。但也有的显色反应需要一段时间颜色才能达到稳定 。 在实际工作中应通过实验测定溶液在某波长下的吸光度随时间变化的曲线, 以确定显色反应所需的最佳时间 。显色反应大多是在室温下进行的, 但也有的反应在室温下进行较慢, 需要加热才能迅速完成 。 应该注意的是, 某些反应产物在加热条件下会发生分解 。 所以, 对需要加热完成的反应, 也应 通过实验测定吸光度与温度的变化曲线来选择显色反应适宜的温度 。 生物工程学院 72（ 三 )参比溶液的选择测量试样溶液的吸光度时, 先要用参比溶液 (有时称为空白 )调节透光率为 100％, 以消除溶液中其他成分以及吸收池和溶剂对光的反射和吸收所带来的误差 。 参比溶液的组成视试样溶液的性质而定, 合理地选择参比溶液是很重要的 。1.溶剂参比 --当试样溶液的组成较为简单, 共存的其他组分很少且对测定波长的光几乎无吸收时, 可采用溶剂作为参比溶液 。2.试样参比 如果试样基体溶液在测定波长有吸收, 而显色剂不与试样基体显色时, 可按与显色反应相同的条件处理试样,只是不加入显色剂 。3.试剂参比 如果显色剂或其它试剂在测定波长有吸收, 按显色反应相同的条件, 不加入试样, 同样加入试剂和溶剂作为参比溶液 。4.平行操作参比 用不含被测组分的试样, 在相同的条件下与被测试样同时进行处理, 由此得到平行操作参比溶液 。 （ 对照 -处理 ） 生物工程学院 73第五章紫外 -可见吸收光谱分析法一,定性、定量分析qualitative and quanti-tative analysis二、在农业和生物学研究中的应用三、有机物结构确定structure determination oforganic compounds第五节 紫外 -可见吸收光谱的应用Ultraviolet-visiblemolecular absorptionspectrometry,UV-VISapplications of UV-VIS 生物工程学院 74一、定性、定量分析qualitative and quantitative analysis1,定性分析? 依据,主要根据 光谱上一些特征吸收，包括最大吸收波长、最小吸收波长、肩峰、吸收系数、吸光度比值等,特别是最大吸收波长 ?max及吸收系数 emax 和 E1%1cm?max 是鉴定物质的常用物理常数,（ 1） 比较光谱的一致性 (未知试样的鉴定 )? 两个化合物若是相同，其吸收光谱应完全一致。在鉴定时，试样和标准品以相同浓度配制在相同溶剂中，分别测定吸收光谱，比较光谱图是否一致。如果没有标准品，也可以和现成的标准品光谱图 (有专门杂志收载，常称为标准图谱 )相比较。若光谱图一致，那未两者可能是同一物质了。 生物工程学院 75? （ 2）比较最大吸收波长 ?max及吸收系数 emax 或E1%1cm?max 的一致性。? 紫外吸收光谱相同，两种化合物有时不一定相同，所以在比较 ?max 的同时，还要比较emax 或 E1%1cm?max 是否一致。 生物工程学院 76（ 3） 比较吸光度比值的一致性? 有时物质的吸收峰较多，往往规定在几个吸收 峰处吸光度或吸收系数的比值 作鉴别标准。如维生素 B12,有三个吸收峰 278,361及 550nm，就利用下列比值进行比较：?45.382.25 5 03 6 188.162.12 7 83 6 11%11%11%1%1??????nmEnmEnmEnmEcmcmcmcm如果被鉴定的物质，吸收波长相同，峰处吸光度或吸收系数的比值在规定范围内，则可考虑与标准品分子结构基本相同。 生物工程学院 77? （ 4） 化合物中杂质的检查 (纯度检查 )? 如果一化合物在光谱的可见区及近紫外区没有明显的吸收峰, 而它的杂质有较强的吸收峰, 那末含有少量杂质就能被检查出来, 例如乙醇中的杂质如苯, 苯的 ?max为 256nm,而乙醇在此波长处几乎无吸收, 又如四氯化碳中有没有 CS2杂质, 只要观察在 318nm处有没有明显的吸收即可决定 。? 如果一化合物，在可见区或近紫外区有较强的吸收峰，可用吸收系数来检查它的纯度 。例如，菲的氯仿溶液，在296nm处有强吸收 (Lge=4,10),用某一方法精制的菲，溶点 100℃,沸点 340℃,似乎已很纯粹，但用紫外吸收光谱检查，测得的 Lge数值比标准菲低 10％，实际含量只有 90％，其余很可能是蒽等杂质。? 生物工程学院 78? 紫外线吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱比较简单，同一种物质的紫外吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。? 除了特殊情况外，不能单独依靠紫外吸收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法配合。紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。 生物工程学院 792,定量分析依据：朗伯 -比耳定律吸光度,A= e b c透光度,-lgT = e b c灵敏度高：灵敏度用吸收物质在最大吸收波长 ?max处的摩尔吸光系数表示。emax,104～ 105 L· mol-1 ·cm -1；（ 比红外大 ）测量误差与吸光度读数有关：A=0.434,读数相对误差最小；A（ 0.2-0.8） 误差较小。 生物工程学院 80? （ 1） 标准曲线法? 配制一系列的标准溶液, 其浓度包括待测样品的浓度范围, 在干扰少的吸收峰波长处,测定其吸光度 A与浓度 c的标准曲线, 待测样品溶液在相同条件下进行测量, 根据测得的吸光度 Ai值, 从标准曲线上即可查出相应的浓度Ci。?ACCiAi0 生物工程学院 81? （ 2） 标准样品对照法? 当样品溶液遵守比耳定律时, 可在同样测量条件下测量标准溶液及待测样品溶液, 测量到的吸光度分别为 A标 和 A样, 根据比耳定律可得到：? 式中,C标 是已知的, 因此待测样品溶液的浓度 C样 可计算出来 。? 这种方法的误差比标准曲线法要大些, 但不需做标准曲线因而要简便些 。标样标样CCAA? 生物工程学院 82? （ 3） 多组分的定量分析? 当溶液中含有多种物质成分时, 如果它们之间不发生化学反应, 则 总吸光度将是各个成分的吸光度之和 。? A＝ A1十 A2十 … 十 A。 ＝ K1LC1十 K2LC2十 … 十 KnLCn? 我们以溶液中存在两个组分为例来说明, 可在两个波长 ?1及 ?2处测量待测溶液的吸光度, 设它们分别为 A1及 A2，则：? A1＝ K11LC1十 K12LC2? A2＝ K21LC1十 K22LC2? K值可事先测得或从其它文献资料中查得, 解上面的联立方程式即可得到两组分的浓度 C1及 C2。 生物工程学院 83? 例,混合液中 KMn04和 K2Cr207含量的测定 。? (1)吸收曲线的绘制：用 2只 l cm吸收池分别测定 KMn04和 K2Cr207标准溶液在 420―700nm的吸光度 (每隔 10nm测一次 ),在同一坐标纸上绘制两者的吸收曲线 。 如果仪器波长准确, KMn04在 520nm和 545nm有吸收峰,K2Cr207在 440nm有吸收峰 。? (2)摩尔吸光系数的测定：分别吸取 3,0mL标准 KMn04和 K2Cr207溶液加到 2个 50mL容量瓶中, 用 1mol／ LH2SO4稀至刻度, 混匀, 用 l cm吸收池, 以 l mol ／ LH2SO4 溶液作参比, 分别在 440nm和 545nm处测定其吸光度, 根据 A＝ ebc公式, 可算出摩尔吸光系数? (3)混合液中 KMn04和 K2Cr207浓度的测定：吸取 5,0mL试液加到 50mL容量瓶中, 以 1mol／ LH2SO4 溶液稀至刻度, 混匀, 用 l cm吸收池在 440nm和 545nm处测定吸光度 。? (4)计算：将测得的 和 代入下式解联立方程, 即可求出 KMn04和 K2Cr207的浓度 。??MnMnCrCr AAAA 5 4 54 4 05 4 54 4 0,、、MnMnCrCr
eeee,、、MnCrMnCr AA ?? 5 4 54 4 0,MnCrMnCr AA ?? 5 4 54 4 0, MnMnCrCr eeee,、、MnMnnmCrCrnmMnCrMnMnnmCrCrnmMnCrCCACCAeeee?????? 生物工程学院 84? （ 4） 示差分光光度法? 在分光光度法中, 待测试液的浓度过大 (吸光度过高 )或浓度过低 (吸光度过低 ),测量误差都较大 （ A,0.2-0.8） 。 为了克服这一缺点, 改用标准溶液代替空白溶液来调节仪器的 100％ 透光度或 0％ 透光度, 以提高方法的准确度 。 这种方法称为 示差分光光度法, 简称为示差法 。? 目前有浓溶液示差法, 稀溶液示差法和使用两个参比溶液的示差法, 其中以浓溶液示差法应用最多 。 生物工程学院 85? ① 浓溶液 (高浓度试样 )示差分光光度法是采用浓度与试样含量接近的标准溶液作为参比溶液, 来测量未知试样的吸光度 A值, 根据测得的吸光度计算试样的含量, 如果标准溶液浓度为 Cs,待测试样浓度为 Cx,而且 Cx＞ Cs。根据朗伯 ――比耳定律? Ax=el Cx As=el Cs? A=? A= Ax C As= el (CxCCs)= el ? C? 测定时先用比试样稍小的标准溶液, 加入各种试剂后作参比, 调节仪器的透光度为 100％, 即吸光度为 0,然后测量试样溶液的吸光度 。 这时的吸光度实际上是 两者之差? A,它与两者浓度差 ? C成正比, 且处在正常的读数范围 。(见图 ) 生物工程学院 86? 由于用已知浓度的标准溶液作参比,如果该参比溶液的透光度为 10％, 现调至 100％, 就意味着将仪器透光度标尺扩展了 10倍 。 如待测试样的透光度原是 7％,用示差分光光度法测量时将是 70％ 。 生物工程学院 87? ② 低浓度试样的测定? 先用空白溶液调节仪器的透光度为 100％,再用一个 浓度比试液稍高的标准溶液调节透光度为 0％, 然后测量待测试液的透光度 。0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100T（ %）示差法 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100T（ %）x 生物工程学院 88??? 测定浓度适中的试样, 如果希望得到更加准确的读数, 则可选择两个组分相同, 浓度不同的溶液作参比溶液, 试液浓度应介于此两种溶液的浓度之间 。 调节仪器, 使 浓度大的参比溶液的透光度为 0％,浓度小的参比溶液的透光度为 100％, 作工作曲线,并测定试液的透光度, 见上图 。③ 浓度适中的试样（高精密度）的测定 生物工程学院 89? 二, 在农业和生物学研究中的应用? 1,叶片色素提取液中叶绿素 a,b的含量测定? 叶片色素的 85%丙酮提取液中叶绿素 a,b的含量 （ mg/l） 可按 Arnon式计算：? Ca=12.72A663-2.58A645? Cb=22.87A645-4.67A663? 该公式是依据叶绿素 a,b在 663,645nm的吸光系数, 通过解二元联立方程得到 。 式中A663, A645分别为提取液在 1cm样品池内, 对波长 663,645nm光的吸光度 。? 生物工程学院 90? 2,在蛋白质定量分析中的应用,? 除经典的凯式定氮法外, 很多蛋白质定量方法是利用紫外可见光谱法, 常用的是以下几种：? （ 1） 酚试剂法,其原理是根据酚试剂与蛋白质中的芳香族氨基酸 （ 色氨酸, 酪氨酸 ） 产生显色反应, 反应液在可见区的吸光度与蛋白质含量成正比 。 分析波长的选用与样品浓度有关：低浓度时可用 750nm,高浓度时可用500nm。? （ 2） 双缩脲法,其原理是蛋白质分子中的肽健在碱性溶液中能与二价铜离子形成兰色的络合物 。 分析波长可选用 550nm。? （ 3） 紫外吸收光谱测定蛋白质含量,其原理是蛋白质分子中的色氨酸和酪氨酸在 280nm处有较强的吸收 。 此外还可用样品在 215nm与 225nm吸光度之差来测定蛋白质含量 。 生物工程学院 91? 3,氨基酸的吸收光谱测定? 蛋白质水解产生氨基酸, 氨基酸中的游离氨基能与水合茚三酮反应, 产生蓝紫色化合物, 其吸光度与氨基酸含量成正比 。 可在 580nm处测定反应物的吸光度, 确定样品中全氨基酸的含量 。? 4,在测定 DNA中的应用? DNA分子在紫外区有吸收, 纯的 DNA在 280,260，230nm的吸光度之比大体上等于 0.515,1,0.450,因此根据该吸光度比, 可以检查 DNA溶液的纯度 。? 生物工程学院 92三、有机化合物结构辅助解析structure determination of organic compounds可获得的结构信息（ 1） 200-400nm无吸收峰 。 饱和化合物, 单烯 。（ 2） 270-350 nm有吸收峰 （ ε=10-100） 醛酮 n→ π* 跃迁产生的 R 带 。（ 3） 250-300 nm 有中等强度的吸收峰 （ ε=200-2000）, 芳环的特征 吸收 （ 具有精细解构的 B带 ） 。（ 4） 200-250 nm有强吸收峰 （ ε?104）, 表明含有一个共轭体系 （ K） 带 。 共轭二烯,K带 （ ?230 nm） ； ???? 不饱和醛酮,K带 ?230 nm, R带 ?310-330 nm260nm,300 nm,330 nm有强吸收峰, 3,4,5个双键的共轭体系 。 生物工程学院 93结束欢迎您再来，再见！
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