3D Insert 细胞接种规程
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3D InsertTM 细胞接种规程
此操作规程应用于在未经处理的细胞培养板中，将细胞接种于3D InsertTM支架中。遵循这个三维细胞接种规程是个关键。遵循这个规程可以使细胞悬液通过毛细作用力完全进入支架内部，这样一来，细胞将附着在支架上。
材料和设备
未经过处理的无菌细胞培养板&&&&&&& 无菌镊子
移液器&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 无菌枪头
真空吸尘器&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 生物安全罩
细胞培养孵化器
1、计算合适的细胞浓度用于三维细胞接种。参考表3和表4找到相应的三维支架细胞生长面积。我们建议您使用通常用于二维细胞培养的细胞接种密度（细胞数量/cm2）。附录为一个实例。
2、取出需要培养的细胞，培养于适当浓度的培养基中。
3、小心地吸取正确体积（表1）的细胞悬液，慢慢地滴到每一个3D InsertTM支架的上表面，覆盖支架表面80-90%的面积。注意：不要让细胞悬液接触到孔的边缘。这会导致细胞接种效率的下降。
接种体积（&l）
4、轻轻地将培养板放入孵化器中。避免晃动培养板！
5、3小时后，从孵化器中取出带有支架的培养板。在生物安全罩中，向每一个孔中加入适量体积（表2）的新鲜培养液。确保支架完全浸没并静置于孔的底部。再将培养板
放回孵化器。
3小时后加入的体积（&l）
3小时后总共的体积（&l）
6、接下来的步骤和普通细胞组织培养的一致，直到进行分析。
表3：细胞接种表面积和从二维到三维PS支架的转化比率
2维生长面积
3维生长面积（PS1520）
3维生长面积（PS3040）
3维/2维比率（PS1520）
3维/2维比率（PS3040）
表4：细胞接种表面积和从二维到三维PCL支架的转化比率
2维生长面积
3维生长面积（PCL3030）
3维生长面积（PCL3050）
3维/2维比率（PCL3030）
3维/2维比率（PCL3050）
一个实例，关于如何计算三维支架接种的细胞悬液浓度。我们建议细胞接种的密度（细胞数量/cm2）和您平时用于二维细胞培养时的一样。然而，由于3D InsertTM提供了比传统二维孔更大的表面积（表3、4），您需要接种到比在传统二维孔中更多的细胞到每一层支架上。下面是一个三维细胞接种实例，细胞将接种到96孔包装的3D-InsertTM-PS支架的共24个支架上去。
a、假设您在进行二维细胞培养时需要向96孔板的每个孔接种1000个细胞，那
&& 么当使用3D-InsertTM-PS进行实验时，就需要向每个孔中的三维支
&& 架接种1000 &4.2=4200个细胞，因为96孔3D-InsertTM-PS支架的
&& 表面积是传统二维96孔面积的4.2倍（表3第5列）。注意：在您的实验中
&& 务必使用表3和表4里合适的比例值。
b、这4200个细胞将会包含在15&l的溶液中（96孔3D-InsertTM-PS支架
&& 的接种体积）。因此，您要准备的细胞悬液的浓度是ml=280，000个细胞
c、一个普通的3D-InsertTM-PS包装装有24个支架。实验中对于这些支
&& 架都使用280,000个细胞/ml的浓度，因此要将这24个支架都进行接种，总
&& 共需要24 & 0.015ml=0.36 ml。一定要多准备些细胞悬液，以弥补移液过程
&& 中可能出现的损耗。我们通常会多准备两个支架的用量。这样，额外的体积
&& 是2 & 0.015 ml = 0.03 ml.因此，接种所需的细胞悬液总体积是0.36 ml +
&& 0.03ml = 0.39 ml。
d、使用您原来的/常备的细胞悬液，制作一份密度280，000个细胞/ml的细胞
&& 悬液，总共0.39ml。这就是接种24片3D-InsertTM-PS支架所需的
&& 工作体积。
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[求助]接种96孔板的肿瘤细胞药物筛选练习，怎样才能平行
查看完整版本请点击这里：
鄙人做的是肿瘤细胞药物筛选练习（选用的是hela细胞），步骤是：
1.取哦诶样的hela细胞，倾去旧的培养基，PBS清洗2-3次
2.加入适量的0.25%胰蛋白酶消化一段时间
3.倾去胰酶，加入2mL左右培养基终止消化，吹打培养瓶壁，使细胞悬液均 匀
4.移入10mL玻璃离心管中，平衡后，离心5min，1500rpm
5.倾去上清液，加入4mL-5mL新培养基，吹打均匀，计数
6.取新的10mL玻璃离心管加入所需量的细胞细胞悬液及培养基（使得细胞悬液，细胞的密度为2*104），混匀
7.将混合均匀的细胞悬液转移到加样的凹槽中，再摇一摇
8.96孔板用八道枪平行加样，每孔90微升，二氧化碳培养箱中过夜
9.次日，加PBS每孔10微升，二氧化碳培养箱培养
10.培养44h，加MTT每孔10微升，二氧化碳培养箱培养
11.再过4h，二氧化碳培养箱中取出，倒板，甩去上清液，加DMAOMTT每孔10微升,震荡，酶标仪570nm测OD值。
问题是：鄙人是新手，可做了两个月了还是不平行，附图，我觉的步骤没有多大的问题吧（老板指导的），不知是不是什么小细节没有把握好呢？还有就是细胞悬液混匀时总是出现许多的泡泡，计数板中细胞也不是很均匀，请各位高手指点迷津，看看可能是什么地方的问题。 查看完整版本请点击这里：
园丁## ( 17:42:27)
有没有注意到周围边上的数值普遍比中间的高？
最外层的孔水蒸气挥发的快，而且细胞容易分布不均匀（靠外边的温度降低速度快，细胞容易沉下来），所以周边的一排孔最好不要用，而且要加PBS保持周围的湿度一致。
细胞计数这一步非常关键，一定要混匀了才能吸细胞悬液计数，而且要保证四个中方格的细胞数差不多，中方格细胞数量少于30的算出来的结果不准确。我一般是用1ml的枪混匀，然后用200ul的枪吸一滴出来加在盖玻片边缘让它吸附过去。
种板的时候细胞混匀也很重要，我一般种一块板都用巴氏吸管吹几下，才接着种下一块板；因为有血清，所以有气泡是正常的，当然能减少气泡是最好的
细胞如果贴壁不牢，倒板的方法容易使带有结晶的细胞脱壁，造成数值不均，我一般是用排枪吸掉一半，另一半用200ul的枪小心的吸干净，再加DMSO
个人意见，仅供参考，^_^
zranqi_1 ( 17:42:51)
你的结果已经相当不错呢！
应该给我传授一下你做MTT的经验，
我现在真的是不知道自己该怎么办呢！
vcve ( 17:43:17)
请问一下，你用的这是什么分析软件啊？可以告诉我吗？我也马上要做MTT了。可是现在还无从下手。谢谢！
dongdongqiang ( 17:43:41)
不是什么分析软件
就是酶标仪自带的输出方式
guagua ( 17:44:01)
我最近也在做MTT，做了几次结果不平行，总结了一下，可能有一下的原因，大家可以讨论一下：
首先种板子的时候，细胞一定要均匀，如果一开始就不均匀，到后面细胞分裂的总数就不同；我用的96孔板的四周都是各加100 ul的灭菌水，这样细胞孔的培养液就不会大量的挥发，即使挥发，也比较平行；
加上MTT，吸走上清的时候，一定要小心，否则会把生成的紫色结晶给吸出来，自然会导致结果的不平行；
用酶标测定的时候，建议振荡15秒后测一遍，之后再不振荡测一遍，结果以不振荡测定的为准；振荡后马上测定，有可能液面还不平稳，导致吸光度的误差；
Ao7 ( 17:44:22)
呵呵，我最近也在做，lz的结果非常号了
给大家建议：最好不要用排枪，组间差太大……
不该偷懒啊
wmp1234 ( 17:44:47)
各位好啊，我也在做MTT，想请问一下做悬浮细胞的MTT时加入DMSO去除上清液一定要离心吗？
为什么空白对照孔（单纯培养基）加入DMSO后有颜色？镜下见细胞死光光了但MTT所测的OD值却很高，而有较多活细胞的孔OD值却很小有时为负数呢？有什么原因会导致这种结果？MTT结果与培养基的PH值有关吗？除与活细胞数量有关外，还与哪些因素有关呢？
我还是新手身边没有人指导，望各位帮帮忙吧，谢谢！
kswl870 ( 17:45:19)
避免气泡的方法：吹打细胞悬液时不要把滴管里面的悬液全部挤掉，留一点在里面在进行下一次的吸取，这样能有效避免气泡的产生，师姐传授的方法，很好用，大家可以试试！
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请问96孔板如何重复使用
我想要重复使用96孔板，听说可以用酸泡过后，再照紫外，请问各位高手具体的过程。泡的是盐酸吗，紫外要找多长时间，最好有这么做过的高手能回帖，谢谢啦~~
好像是在75%的酒精里泡吧，紫外大概两三个小时大概就可以了，意见仅供参考，呵呵~ 我们以前回收利用过，因为是贴壁细胞，不容易洗干净，就直接泡铬酸洗液了，过夜浸泡就可以，时间太长会变黄，然后清水清洗五遍以上，纯净水3遍以上，烘干，使用前紫外照射45min以上就可以了 铬酸洗液就是重铬酸钾和浓硫酸按照一定比例配制得洗液。 提醒下，铬酸很毒。。如果可以换新的，还是换新的吧 其实我觉得你还应该考虑另外两个问题：
一、经济：一块96孔板，进口的也贵不到哪去，国产的更便宜，你重复利用，这么一折腾，时间，精力以及洗板所要产生的费用，另外你还得承担一些实验过程中的潜在危险，如浓酸可能会腐蚀你的衣服甚至是皮肤。
二、效率：96孔板的材料均以吸附能力强为特点，所以很多东西你很难洗干净，最关键的是压根就没有一个固定的指标来提示你这个板是否已经洗干净了。那么你再用这个板来进行第二次实验，如果实验结果与你预期的不一样，你就无法排除是这个板没洗干净的原因造成的。
生化领域的一些实验真的很难摸透，因为影响因素太多了，就算你按照标准的流程走，你也很有可能做失败。同样的一个人在不同的实验室用同样的一批样品使用同样的一个方法和同样的一批试剂进行同一个实验，也就是说就地方不一样，其它都一样，得出的实验结果是相反的，重复三次结果还是一样。这是我亲身经历的事情。当时连我导师都没法解释这是为何。
科研是要付出代价的，不要让自己的实验纠结在这种不应该纠结的地方。该节省的地方要节省，不该节省的地方千万别节省，除非你非要跟你自己过不去。 建议不要回收了.我们实验室以前回收过,也做过对比,回收的板子对实验误差还是比较大的. 直接泡0.1%新洁尔灭洗液，然后纯水冲洗干净。晾干后包好，去辐照中心γ射线辐照杀菌即可，我读书时这样做过，保证不会污染。紫外线也不一定行的。 用的是德国的板子，测的结果一直不大好，做标准曲线做不好，板子有一定的因素，我想星级专家为您解答难题！
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问题解决中
问题提出时间： 14:01:08
流感病毒在96孔里面的CPE
20 [悬赏中]
各位高手好，小弟做流感病毒的，我想知道流感病毒在96孔板中的CPE到底是怎样？
行业分类：公共卫生、流行病学
回答时间： 07:00:16
病毒与细胞的相互作用
来源：动物微生物学
病毒的种类千差万别，其宿主细胞种类也多达200多种，病毒与宿主细胞之间作用的表现形式各异。目前对病毒与细胞的相互作用研究，还是以细胞培养为基础的病毒所致的细胞、亚细胞及分子水平的变化为主。
（一）、病毒与细胞相互作用的类型
1. 杀细胞和非杀细胞感染：病毒感染细胞后按细胞是否死亡分为杀细胞和非杀细胞感染两大类。前者在病毒感染后可致细胞死亡，可产生感染性病毒颗粒；后者在病毒感染后不致细胞死亡，细胞形态改变（转化）或不改变，产生或不产生感染性病毒颗粒。
2. 生产性和非生产性感染：病毒感染细胞后按能否产生和释放子代病毒颗粒分为生产性(productive)和非生产性(nonproductive)感染，后者又称顿挫感染(abortive infection)。
3. 允许性和非允许性感染：病毒感染细胞后按细胞是否让病毒完成复制过程分为允许性(permissive)和非允许性(nonpermissive)感染。前者是细胞可让病毒完成复制过程，后者则阻断了病毒复制过程的某个环节，两者均可产生细胞的病理变化。
4. 持续感染(persistent infection)：是指持续长时间的感染。最重要的非生产性的病毒与细胞的相互作用是持续性感染或隐性感染，广义的持续感染还包括潜伏感染。持续感染过程中不形成传染性病毒颗粒，也可能是病毒基因组被整合到宿主细胞DNA内，或以附体(episome)形式存在。潜伏感染的细胞在某些情况下并不释放病毒颗粒，但在被激活后则可变为生产性的。隐性或持续性感染也可能表现为转化。
（二）、病毒引致的杀细胞变化
某些病毒感染单层细胞后，可导致细胞损伤，称之为细胞病变(cytopathic effect，CPE)。病毒产生CPE的能力与其对动物的致病力正相关，因此常以半数细胞感染量(tissue culture infectious dose 50，TCID50)来判定病毒的毒力。
CPE的表现因病毒与细胞的种类而异，有多种形式，如细胞圆缩、肿大、形成合胞体或空泡等(见图32-1)，可表现为细胞膜的变化或细胞骨架的变化。
涉及细胞膜的CPE：许多病毒能改变宿主细胞膜的通透性，以完成其复制。最突出的是，有囊膜的病毒出芽过程中能将其融合蛋白直接插入宿主细胞膜，结果导致膜融合以及合胞体形成。合胞体(syncytia)是病毒感染后导致感染细胞及相邻细胞的细胞膜融合，形成多核的巨细胞。融合形成的融合桥可允许病毒亚单位如核衣壳、核酸等通过，以逃逸宿主的防御系统。细胞膜融合由病毒融合蛋白或其他表面蛋白介导，例如流感病毒的血凝素、新城疫病毒的F蛋白等。
涉及细胞骨架的CPE：细胞骨架由微丝、中介丝及微管组成，与细胞结构的完整性、物质运输及运动性等有关。有些病毒感染可致微丝解聚，有的则能破坏微管，均可造成严重的细胞损伤，导致细胞崩解。
病毒引致的细胞凋亡与坏死：病毒感染引致的细胞死亡可分为凋亡(apoptosis)和坏死(necrosis)，更多的细胞死亡是因病毒感染引起了细胞的程序性死亡机制所致。凋亡和坏死的细胞有不同的形态变化，凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，内源性核酸内切酶被激活，将细胞DNA降解成180～200 bp的片段，在琼脂糖凝胶电泳时可见称之为&梯带&(lader)的特征性电泳条带；坏死的细胞没有内切酶激活所致的变化。
凋亡是宿主细胞的重要防御机制，可在子代病毒产出前，通过细胞凋亡及早清楚感染病毒的细胞，至少可延缓病毒在体内的蔓延。坏死总是发生在病毒复制完成后，通过坏死使细胞崩解以释放其子代病毒。
（三）、空斑形成
经空斑试验，致细胞死亡的病毒可使原先病毒感染的细胞及病毒扩散的周围细胞崩解死亡而形成一个近似圆形的斑点，称为空斑或蚀斑(plaque)。空斑是细胞病变的一种特殊表现形式，不同病毒或同一种病毒的不同毒株可形成形态、大小和染色性不同的空斑，可作为病毒鉴定的依据。
一个空斑可能由一个以上的病毒颗粒感染所致，因此可将获得的单个空斑制成悬液，高度稀释后再作空斑，最终可获得只含一个病毒颗粒及其子代的空斑，即为斑点克隆，可进行病毒纯化。利用空斑技术可对病毒定量，定量单位称为空斑形成单位(plaque-forming unit，PFU)。
（四）、包涵体形成
某些病毒感染细胞的胞浆内和/或胞核内产生单个或多个、圆形或不规则、嗜酸性或嗜碱性的特殊小体，称为包涵体(inclusion body或inclusion)。包涵体的形态、染色特性和存在部位以及在哪些宿主细胞形成，具有病毒种属(型)的特性，常作为病毒性疾病诊断的一个依据。
包涵体的性质并不相同。有的是病毒集团，由大量病毒颗粒晶格样排列而成，如腺病毒、呼肠病毒的包涵体；有的是病毒成分的蓄积，如狂犬病毒产生的Negri氏体，是堆积的核衣壳；有的则是病毒合成的场所，称病毒工厂(viral factory)，如痘病毒的病毒胞浆；还有一些是细胞退行性变化的产物，如疱疹病毒感染细胞的染色质浓缩形成一个清晰可辨的圈，称&猫头鹰眼&。
（五）、病毒引致的非杀细胞变化
非杀细胞病毒的感染通常引致持续感染，对细胞的新陈代谢无大碍，细胞大多能继续生长并分裂，同时还可产生并释放子代病毒颗粒。这多见于某些RNA病毒的感染，尤其是某些副黏病毒。除少数例外，大多数持续感染的细胞发生慢性渐进性变化直至死亡。一般持续感染不影响宿主器官的功能，而对不能迅速替补修复的细胞如神经元，持续性感染损伤将会影响正常功能。
（六）、干扰素
病毒感染的细胞能抵抗相同或不同病毒的再次感染，即为病毒的干扰(interference)。已证实干扰具有两种主要的机制，一是由缺陷型突变株所致，通常干扰同源病毒，另一是由干扰素(interferon，IFN)介导。
干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及RNA和蛋白质的合成。
1. 干扰素的产生：很多类型的细胞在被病毒感染后几小时内就能产生干扰素，几天内达到高浓度，能在初次免疫反应尚未形成之前，发挥免疫作用。干扰素由宿主细胞基因编码，病毒感染细胞后，病毒遗传物质与宿主细胞核糖体作用，使细胞产生干扰素的编码基因去抑制，从而产生干扰素。除感染细胞外，致敏T淋巴细胞、B细胞和NK细胞也同样能产生干扰素。
2. 干扰素的性质：目前已发现人类有约24种干扰素，动物的干扰素稍少。干扰素属于正常细胞调节蛋白即细胞因子家族，按化学性质可分为a、b及g 三个型，其中人的a型至少有22个亚型。其特性可见表32-2。
干扰素是一类具诱生性、宿主特异性和广谱抗病毒活性的细胞因子。干扰素是细胞对强烈刺激如病毒感染应答时的一过性分泌物；干扰素特别是b及g 型干扰素具有一定程度的宿主特异性，例如鼠干扰素对人无效，反之亦然；干扰素无病毒特异性，又一种病毒诱生的干扰素可对抗他种病毒感染完全有效。
3. 干扰素的抗病毒活性：干扰素从细胞内释放出来后，可停留在分泌部位或经循环至全身，与其他细胞胞浆膜上的特异受体结合，可保护其免受病毒感染。a、b干扰素与受体结合后，通过信号转导激活复杂的转录过程，又导致许多细胞蛋白的合成。g 干扰素与受体结合，可激活另一套基因及蛋白的代谢，直接或间接抑制病毒的复制。eIF-2是真核细胞内合成蛋白质的启动物质，干扰素诱导产生pl/eIF-2a激酶，使eIF-2磷酸化，失去活性，从而抑制病毒蛋白质的合成。
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松针油抗甲型流感病毒的实验研究
　　目的 研究松针油抗甲型流感病毒的作用。方法 采用细胞病变抑制实验、噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性，以治疗指数(TI)为评价指标，观察松针油在MDCK细胞中对甲型流感病毒的抑制作用。结果 松针油的细胞毒性较低,松针油在一定浓度范围内对流感病毒有直接灭活作用；在吸附阶段和合成阶段都能抑制流感病毒的复制，但松针油不能阻止病毒侵入细胞。结论 松针油具有很好的抗甲型流感病毒的作用。
【关键词】
松针油 甲型流感病毒 MTT法 CPE
　　流感病毒表面抗原容易变异的特性导致使用疫苗预防流感效果欠佳,目前应用的抗流感药物具有明显的副作用，因此有必要开发更安全、有效的新型抗流感病毒的药物。现代研究表明,松针具有镇痛、抗炎、镇咳、祛痰、抗突变、降血脂、降血压、抑菌等作用〔1〕,其利用价值日益受到重视。松针油抗流感病毒研究目前未见报道，本研究旨在探讨松针油抑制甲型流感病毒的作用及其机制。
材料与方法
甲型流感病毒A3 (A/京防/256/97)由中国预防医学科学院病毒学研究所提供；狗肾传代细胞(MDCK)由武汉大学典型培养物保藏中心提供, 常规方法传代培养。松针叶采于广州市；病毒唑注射液为山东益康药业有限公司市售商品,50 mg/ml,批号：；新生牛血清（杭州四季青生物公司）；RPMI 1640培养液（美国Gibco公司）；MTT（美国Sigma公司）；二甲基亚砜(DMSO,上海菲达有限公司)；胎牛血清(美国Hyclone 公司)；MTT(四甲基偶氮唑盐，美国Sigma公司)。
松针油提取
采用水蒸气蒸馏法。松树叶在实验室阴干后切成小于2 cm的小段,取针叶100 g加到1 000 ml的圆底烧瓶中，加入750 ml蒸馏水，置于水蒸气蒸馏装置中进行提取，蒸馏4 h，取上层精油，用无水乙醚溶解，无水硫酸钠脱水，得到淡黄色油状液体，冷藏备用。
松针油成分分析
用气相色谱?质谱联用仪进行分析。精油气相色谱条件：色谱柱为HP?5石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱温35℃，以每分钟5℃升温至100℃，停留8 min，每分钟5℃升温至190℃，停留5 min，以每分钟10℃升温至280℃，保持至完成成分分析。进料量为0.5 μl，载气He，载气流量1.0 ml/min，分流比50∶1，质谱条件为离子源温度220℃，注入口温度为240℃，电子能量70 eV。
用RPMI?1640培养液将松针油(1.05 g/ml)按1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200和1∶102 400比例进行稀释, 其药液质量浓度分别为10.5、5.25、2.625、1.31、0.656、0.328、0.164、0.08、0.04 、0.02和0.01 mg/ml。
流感病毒的传代及效价测定
将病毒液接种于9日龄鸡胚尿囊腔,0.2 ml/个,37℃培养48 h ,4 ℃过夜后收取尿囊液。红细胞凝集(血凝) 试验测定病毒血凝效价为1∶1 024。红细胞凝集试验按文献〔2〕方法进行。
病毒毒性测定
以50%组织培养感染量(TCID50)表示病毒毒力。将病毒培养液做10倍系列稀释从10-1至10-10。将各稀释度的病毒液接种于单层MDCK细胞中，每一稀释度8个复孔，同时设阴性对照，37℃培养3～5 d，观察细胞病变(CPE)，用Reed?Muench法求出细胞半数感染量（TCID50）。
松针油毒性测定
将细胞维持液稀释的不同浓度松针油分别加入MDCK细胞已长成单层的96孔细胞培养板中,每个浓度重复8个复孔，同时设立正常细胞对照,置于37℃、5%CO2 培养箱内培养,连续观察3 d,记录细胞形态变化。培养结束前4 h吸弃培养板中液体，PBS冲洗3次，每孔加入MTT（5 mg/ml）20 μl，于37℃培养箱中培养4 h，去上清后每孔加DMSO 200 μl，微量振荡器振荡5 min，酶标读数仪比色(波长492 nm)测吸光度值，实验重复3次。
松针油对流感病毒抑制作用的观察
　　1.2.7.1
对病毒的直接灭活作用
在药物无毒范围内，不同浓度的含药维持液分别与100TCID50流感病毒液等量混合，37℃作用2 h后，将其接种在MDCK细胞已长成单层的96孔细胞培养板中，37℃吸附2 h后，弃上清，加维持液200 μl，每一浓度设8个复孔，实验同时设细胞对照、病毒对照和病毒唑（50 μg/ml）对照，置于5%CO2、37℃孵箱培养，每日观察CPE，当病毒对照细胞病变达75%以上，MTT法检测细胞存活率，实验重复3次。
　　1.2.7.2
对病毒复制增殖的抑制作用
在长成单层的MDCK细胞的96孔板上，每孔接种20 μl 100 TCID50流感病毒，37℃吸附2 h，弃病毒液。在药物无毒范围内加入不同浓度的含药维持液，每孔200 μl，每一浓度设8个复孔。实验同时设细胞对照、病毒对照和病毒唑（50 μg/ml）对照,余方法同前。
　　1.2.7.3
对病毒吸附的作用
在药物无毒范围内，不同浓度的含药维持液分别与100TCID50流感病毒病毒液等量混合后，立即加到已长成单层MDCK细胞的96孔细胞培养板中，37℃吸附2 h后，弃去96孔板中液体，加维持液200 μl，每一浓度设8个复孔。实验同时设细胞对照、病毒对照和病毒唑（50 μg/ml）对照，余方法同前。
　　1.2.7.4
对甲型流感病毒H1NI亚型侵入细胞的阻断作用
在药物无毒范围内，每孔细胞预先加入不同浓度的含药维持液200 μl，作用4 h后用PBS洗涤三次，每孔再加入100TCID50流感病毒，吸附2 h，弃病毒上清，加维持液200 μl，每一浓度设8个复孔。实验同时设细胞对照、病毒对照和病毒唑（50 μg/ml）对照，余方法同前。
数据用SPSS11.5软件处理。用Linear?Regression方法计算药物半数中毒浓度(TC50)、半数有效浓度(IC50)和对药物剂量与其产生的细胞效应(细胞存活率、抑制率)进行相关性分析,判断是否存在量效关系。组间比较采用方差分析。
松针油气相色谱?质谱（GC?MS）分析结果
利用气质联用仪，用计算机NIST谱库检索松针油各组分的质谱数据，经色谱峰面积归一化法计算得出各化学成分的相对百分含量(图1)。鉴定松针油中的18种成分，占总馏出峰面积的96.66%，主要为柠檬烯32.23%，乙酸龙脑酯24.01%，莰烯18.04%，α?蒎烯15.88%和β?蒎烯3.16%等。
病毒毒力测定
采用Reed?Muench 法计算流感病毒在MDCK细胞中的TCID50为105.75,实验中病毒攻击量为100TCID50/100 μl。
松针油对MDCK细胞的毒性作用
松针油对MDCK细胞的毒性作用表现为细胞增殖缓慢、颗粒较多、折光性强、形态改变、部分细胞破碎脱落。松针油对细胞的毒性作用随着药物浓度的降低而降低，细胞存活率逐渐增加。MTT检测结果表明,松针油对MDCK细胞的毒性作用TC50值为3.3 mg/ml,最大无毒浓度（TC0）为0.815 mg/ml。
松针油抗流感病毒实验结果
对病毒的直接灭活作用
见表1。流感病毒感染所致的MDCK细胞CPE特征为细胞肿胀、变圆、细胞间融合、脱落、碎裂。在松针油无毒范围内，随浓度增加，流感病毒所致的CPE程度降低, 病毒抑制率与浓度呈正相关(表2),与病毒对照比较有明显差异（P＜0.01），抑制效果好于病毒唑（P＜0.05）。说明松针油具有直接灭活流感病毒的作用,其对甲型流感病毒H1NI亚型的IC50为0.11 mg/ml,TI为31。
对病毒复制增殖的抑制作用
松针油能明显抑制流感病毒生物合成,表现随着松针油浓度的增加, 细胞肿胀、变圆等典型CPE 特征逐渐减弱,细胞存活率明显升高，松针油抑制细胞病变的作用随着浓度的增加而增强，与病毒对照比有明显差异（P＜0.01），抑制效果优于病毒唑（P＜0.05）。其对甲型流感病毒H1NI亚型的IC50为0.58 mg/ml,TI为9.3。
对病毒吸附的作用
随着松针油浓度的增加，典型的CPE表现逐渐下降。MTT结果显示松针油可抑制病毒增殖，与病毒对照比较有明显差异（P＜0.01），抑制效果优于病毒唑（P＜0.01），其对甲型流感病毒H1NI亚型的IC50为0.38 mg/ml,TI为7.8。
对甲型流感病毒H1NI亚型侵入细胞的阻断作用
松针油不同浓度均出现典型的CPE。MTT结果显示松针油对病毒抑制率与病毒对照组差异无显著性（P＞0.05）, 说明松针油对病毒侵入细胞无阻断作用，对流感病毒感染无预防作用。
松针油总离子流色谱图（略）
不同方式作用下松针油对甲型流感病毒H1N1亚型的抑制作用（略）
松针油对甲型流感病毒H1N1亚型不同方式作用下细胞病变效应（略）
　　-表示无细胞病变，+表示有25% 细胞发生病变，?表示有50% 细胞发生病变，?表示有75% 细胞发生病变，?表示有100% 细胞发生病变
　　我国被世界公认为流感高发地区，流感病毒表面抗原容易变异的特性导致使用疫苗预防流感效果欠佳，因而在不断跟踪抗原变化，加强新疫苗研制的同时，应加大抗流感病毒药物的研制，寻找一种高效、安全、副作用少的抗病毒药物的研究势在必行。目前的抗病毒化学合成药物由于在体内的毒性和长期应用耐药性而限制了其临床应用。传统中药具有毒副作用小,药源丰富,价格低廉,多靶点作用机制，能调节机体免疫功能,抑制病毒复制, 阻止病毒致细胞病变, 改善临床症状, 在治疗病毒感染性疾病上应用广泛, 显示出了独特的优势和诱人的应用前景,筛选高效低毒的抗病毒中药是当前抗病毒研究热点之一〔4〕。
　　松针为松科松属植物的叶,用药历史悠久,在古代我国就已利用松针来治疗疾病〔5〕。本文初步研究了松针油抗甲型流感病毒H1NI亚型的作用效果。松针油对MDCK细胞的半数细胞毒性浓度TC50为3.3 mg/ml，最大无毒浓度（TC0）为0.815 mg/ml，表明松针油对细胞无明显的毒性作用。MTT结果显示，松针油对甲型流感病毒H1NI亚型有直接灭活作用，而且随着浓度的升高，灭活作用增强，说明松针油可能具有直接杀伤病毒的作用,或者松针油中的某一天然化合物在体表能与甲型流感病毒H1NI亚型表面的某个特征性部位结合,使甲型流感病毒H1NI亚型很难进入细胞进行复制。同时，松针油对抑制甲型流感病毒H1NI亚型在细胞内增殖有明显的作用，其作用机理可能是抑制病毒核酸复制或阻止病毒蛋白合成。松针油在病毒对细胞的吸附阶段也起到一定作用，阻止了病毒的吸附，使病毒不能进入细胞内复制。松针油对病毒侵入细胞无阻断作用，说明松针油不能与细胞表面受体结合，从而不能预防病毒的感染。松针油抗甲型流感病毒H1NI亚型作用机制还有待进一步研究。
【参考文献】
　　1 李 萍，刘友平.松针研究进展〔J〕.成都中医药大学学报，）：49?50.
　　2 郭元吉. 流行性感冒病毒及实验技术〔M〕. 北京:中国三峡出版社,.
　　3 张其威，张楚瑜.抗病毒中药研究的最新进展〔J〕.中成药，）：116?9.
　　4 苏薇薇, 张冰若, 劳业兴，等.松针化学成分及药理研究进展〔J〕.中药材，）：681?3.
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回答时间： 13:10:34
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