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求一篇有关绿色荧光蛋白研究的毕业论文
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【关键词】
树突状细胞；绿色荧光蛋白；RNA；转染
Effect of dendritic cells transfected with total RNA of HepG2 cell line using GFP marker in vitro
【Abstract】 AIM: To investigate the feasibility of GFP as a marker to observe the dendritic cells (DCs) transfected with total RNA of tumor cells and the feasibility of the transfected DCs serving as a vaccine for potential immunotherapy. METHODS: Plasmid pGFPC3 was transfected into HepG2 stably. Total RNA was extracted from the HepG2GFP using T DCs were induced by liver cancer patients peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), and transfected with the total RNA. The effect of transfection...
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出门在外也不愁绿色荧光蛋白作为报告基因在分子生物学中的应用68
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绿色荧光蛋白作为报告基因在分子生物学中的应用68
绿色荧光蛋白作为报告基因在分子生物学中的应用；摘要：随着科学技术的不断更新和发展，绿色荧光蛋白；关键词：绿色荧光蛋白；报告基因；应用；TheApplicationofGFPAsRep；绿色荧光蛋白(greenfluorescentp；1关于GFP；1.1GFP的发现；1962年被下村修等人在太平洋多管水母中发现；1.2GFP的作用机理；GFP编码238个氨基
绿色荧光蛋白作为报告基因在分子生物学中的应用摘要：随着科学技术的不断更新和发展，绿色荧光蛋白在动物学、植物学、微生物学等领域的应用研究越来越广泛。绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)可作为报告基因，且具有分子量较小、荧光性质稳定、对生物体无毒性作用、检测时不需要底物等的特点。本文就对荧光蛋白在分子生物学中的应用做一综述。关键词：绿色荧光蛋白；报告基因；应用 The Application of GFP As Reporter Gene In the Molecular Biology Abstract: With the upgrade and development of science and technology, the application of green fluorescent protein used in Zoology, Botany and microbiology is more extensive. As a reporter gene, GFP have some characteristics, such as low molecular weight, good fluorescent stability, non- toxicity to organisms. This paper reviews the application of GFP in the molecular biology. Key words: green fluorescent protein, reporter gene, application of GFP 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)是一类来自于海洋生物如水母、水螅和珊瑚等腔肠动物内的一种生物发光蛋白，当受到紫外或蓝光激发时，能发射出绿色荧光。随后，人们从不同动物体内提取出了各种不同的GFP，其中研究较为深入的是来自多管水母科和海紫罗兰科的GFP，即Aequoria GFP和Renilla GFP。本文根据近几年国内外的研究进展，综合介绍一下GFP作为报告基因的应用。1 关于GFP1.1 GFP的发现1962年被下村修等人在太平洋多管水母中发现。1992年Prasher等详细描述了源于维多利亚水母绿色荧光蛋白的基因和蛋白质结构。1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞中克隆表达了绿色荧光蛋白。美籍华裔钱永健带领的研究小组培养出了许多GFP突变体。与野生型的GFP相比，这些突变体能更快的发射荧光，颜色更强，且有多种颜色1.2 GFP的作用机理GFP编码238个氨基酸的多肽单体，相对分子质量为27kDa。GFP呈圆柱体结构，直径约为3nm，长约为4nm，外围是由11条片层链组成，内部含一个螺旋，两端由短的螺旋片段封闭，生色基团被保护于圆柱体内部。与荧光的产生直接有关的是GFP分子中一小段被称为荧光生色团的部位。生色团的形成不受种属的限制。其通过分子内自催化环化所产生的对羟基苯哑甲基咪唑酮。它形成于蛋白序列中位于65―67位的残基。这3个氨基酸被强制构成一个急转弯的构型，Gly67的氨基就会对Ser65的羰基进行强亲核进攻。通过环化和脱水形成咪唑酮的结构，这时GFP还没有荧光性质。只有当氧分子存在时，残基66的折叠键脱氢，形成与咪唑酮相连的双键，才形成了具有荧光性质的GFP发色团。荧光生色团非常稳定，不易变性，用酸、碱处理或者加入盐酸胍都不会使它失去荧光。 2 GFP作为报告基因在分子生物学中的应用GFP作为报告分子和细胞标记最明显的优势是无需底物或辅因子参与。并且无论在活细胞还是在完整的转基因胚胎和动物中, 都能有效地监测基因转移。GFP作为一个新型报告基因其用途甚广，在生物学领域中发挥着重要作用，本文将从以下几方面进行阐述。2.1 GFP作为融合标签利用DNA重组技术, 将目的基因与GFP基因构成融合基因, 转染合适的细胞进行表达, 然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察，来检测蛋白质分子的定位、迁移、构象变化以及分子间的相互作用，或者靶向标记某些细胞器。此方法是GFP作为报告基因应用得最多也是最成功的。GFP同宿主蛋白构成融合子来监测宿主蛋白的定位。在多数情况下，GFP基因在N一或C一末端与异源基因用常规的分子生物学手段就可以接合构成编码融合蛋白的嵌合基因。迄今为止, GFP已成功地靶入了大部分细胞器中, 如质膜、细胞核、内质网、高尔基体、分泌小体、线粒体、液泡和吞噬体等。另外，除用于特定蛋白的标记定位外,GFP 亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。2.2 GFP基因作为免疫标记物利用GFP的发光特性使免疫反应呈绿色荧光从而可以直接观察, 可望取代传统的标记技术, 建立特异、灵敏、简便和快速的免疫诊断新方法。 3 问题与展望虽然GFP在分子生物学的众多研究领域有着广泛的应用：GFP本身不断改进及优化：对它的应用在技术上出现更多的创新；其应用范围也会越来越开阔，但在研究中仍然存在着一系列的问题。考虑到目前现状和所存在的问题，预期今后将研究更多的突变改进型GFP。它们或具有更高的荧光活性，或分别具有不同的吸收或发射光谱特性。使得作为报告基因的荧光蛋白更具功能特异性。让荧光蛋白发挥出更好的荧光特性。最后，结合非破坏性的三维图像重建技术，无疑可提供有关细胞和有机体正常生命活动的更为真实和生动的图景。总之，GFP已成为对活体细胞进行分子生物学研究的有力工具。随着此领域研究的不断深入，活细胞分子生物学的研究必将大放异彩。参考文献Heim R, P rasher D C, T sien R Y. W avelength Mutations and Posttransat ional Autoxidation of Green Fluorescent Protein. Proc Natl Acad Sci USA ,1994, 91(26) : 12 .Wang JL（汪军玲），Wang ST（王松太）（2009）. Green Fluorescent Protein andThe Results of Scientific Revolution. Animal Husbandry And Feed Scimce(畜牧与饲料科学) 30(10):143～144Ch al fie M, Kain S. GFP: Green Fluorescent Protein Strat egiesand Applicat ions . New York: Wiley & Sons , .Vogt A, Codore H, Day BW, Hukriede NA, Tsang M.J Vis Exp .Development ofautomated imaging and analysis for zebrafish chemical screens.. 2010 Jun24;(40). pii: 1900. doi: 10..Pascual M, Monferrer L, Fernandez Costa JM, Bargiela A, Artero R, Llamusi B. AGFP-tagged Muscleblind C protein isoform reporter construct. Fly (Austin). 2010 Oct 3;4(4). [Epub ahead of print]Roth MS, Latz MI, Goericke R, Deheyn DD. Green fluorescent protein regulation inthe coral Acropora yongei during photoacclimation. J Exp Biol. 2010 Nov1;213(Pt 21):3644-55.Tsai MH, Aki R, Amoh Y, Hoffman RM, Katsuoka K, Kimura H, Lee C, Chang CH.
GFP-Fluorescence-guided UVC Irradiation Inhibits Melanoma Growth andAngiogenesis in Nude Mice. Anticancer Res. ):3291-4.钟卫鸿，陈建孟，陈伟，路争，宋艳荣。珊瑚和海葵来源红荧光蛋白的研究和应用。中国生物工程杂志,）：10～14程在全,丁玉梅,曾黎琼,黄兴奇, WU RAY。绿色荧光蛋白基因作为报告基因在水稻基因转化中的应用研究。云南植物研究 2002 , 24 (3) : 341～351 黄淑贤 绿色荧光蛋白在植物上应用研究进展 生物技术 北京农业2010 年7 月下旬刊吴沛桥，巴晓革，胡海，赵静。绿色荧光蛋白GFP 的研究进展及应用 生物医学工程研究 ) : 83～86唐孝青, 李 斌, 伍小兵, 张 亮。绿色荧光蛋白及其应用的研究进展 陕西农业科学 3～124，145余林辉，姚伟，段真珍，何正权，来佑勤。绿色荧光蛋白及其在农作物研究中的应用 安徽农业科学,Journal of Anhui Agri. Sci. ) :15788 -1张敏，任慧霞。报告基因的应用研究进展 食品与药品Food and Drug 2007 年第9卷第09A 期包含各类专业文献、各类资格考试、生活休闲娱乐、中学教育、外语学习资料、行业资料、文学作品欣赏、绿色荧光蛋白作为报告基因在分子生物学中的应用68等内容。
　绿色荧光蛋白在转基因动物中的应用_生物学_自然科学_专业资料。绿色荧光蛋白在转...转基因 在研究基因的表达或蛋白质的定位与时序变化时常用荧光物质或报告基因作为... 　在随着分子生物学理论与技术的发展,对绿色荧光蛋白的理论研究进一步 深入,并且...基因作为新型报告基因越来越受到关注,目前已经应用GFP作为 选择标记基因成功构建多... 　家的广泛关注,现已被普 遍应用到分子生物学研究的...水母中发光蛋白水母素,并发现一 种绿色的荧光蛋白。...GFP 作为一种新的报告基因,与以往lacZ、 CAT 等... 　作为报告基因,绿色荧光蛋白能够在活细胞中表达发光蛋白。作为荧光 标记分子,绿色...在细胞生物学应用 过程中,各种GFP突变型在高温下的正确折叠非常重要。在酵母中,... 　在细胞生物学与分子生物学领域中, 绿色荧光 蛋白基因常被用作报告基因。 四、 GFP 的应用 1、酵母双杂交系统 原理:将已知蛋白作为诱饵蛋白,在系统中捕获与其相互... 　在细胞生物 学与分子生物学领域中,绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因。 (3)...在EYFP 基础上改进的突 变体mCitrine[21]和mVenus[22]是目前应用最多的黄色... 　目前, GFP 已被广泛应用到真菌的研究中, 并也取得了前所未 有的成果 【1-...性质,可以用绿色荧光蛋白来标记几乎任何生物分子或 细胞,作为一种新型的报告基因... 　分子生物学设计性实验开题报告 题目:绿色荧光蛋白( 题目:绿色荧光蛋白(GFP)基因...甚至能超过细 菌中蛋白量的 30 %,因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达... 　自 1992 年绿色荧光蛋白基因从水母体内克隆以来,现在已经从很多的海洋生物物种中...毒性且检测方法简单,将其作为报告基因已广泛应用于细胞生物学和分子生物学领域。...论文发表、论文指导
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绿色荧光蛋白的发现与发展
&&&&&&本期共收录文章20篇
　　文章编号：(49－04中图分类号：G633.8文献标识码：B 中国论文网 /9/view-911810.htm　　 　　生物发光是一个很普遍的生物学现象。早期的生物研究大多涉及分类、形成和生态方面，后来重点转移到生态、生化的研究，目前已进入分子生物学的研究水平。从不同生物体内提取的荧光蛋白的结构、性质不尽相同。迄今，腔肠动物门多管水母属的维多利亚多管水母（aequorea victoria）的发光蛋白系统研究得较为深入。 　　多管水母体内存在着两种发光蛋白，即光蛋白――水母素（aequorin）和绿色荧光蛋白（GFP，green fluorescent protein）。光蛋白作为分子标记及Ca2+的生物学指示剂，已被成功地应用于哺乳动物、植物、酵母、大肠杆菌细胞，用于检测很多重要的生理学和病理学反应。GFP作为良好的细胞、发育、分子生物学的活体标记，用于监测各种体系中的基因表达、蛋白定位以及多种细胞活动。利用GFP进行示踪的研究范围相当广泛，从细胞生物学的基础研究如细胞骨架和细胞分化、细胞器动力学和囊泡跟踪，到一些热门的前沿和学科和技术领域，如器官移植、基因治疗、神经生物学等等。 　　日本科学家下村修（Osamu Shimomura）、美国科学家马丁?沙尔菲（Martin Chalfie）和美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）因在发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献而分享了2008年的诺贝尔化学奖。他们的工作不但在科学上对化学、生物学、医学等领域具有重要的意义，而且也与人们的日常生活密切相关，对于提高人类的生活品质以及进一步改善人类的健康有十分重要的意义。 　　 　　1研究GFP的时间线索 　　 　　GFP从最初被发现到今天广为应用，经历了半个多世纪的时间。首先简单回顾一下这半个多世纪内和GFP相关的主要事件。 　　1955年人们首次注意到水母体内的绿色荧光物质。 　　1962年下村修从维多利亚多管水母中提取并分离了GFP，证实了绿色荧光物质是一种蛋白质。它的溶液在日光下略呈绿色，在白炽灯下略显黄色，而在紫外灯下则发出强烈的绿色荧光。 　　1969年之前称为绿色蛋白质（green protein）得名“绿色荧光蛋白”。 　　1974年研究发现光蛋白和GFP两种分子之间会发生能量转移（图2）。 　　 　　1979年下村修找到了GFP中的生色基团（Chromophore）（图3，图5）。 　　1985年普腊石（Douglas Prasher）根据蛋白质的氨基酸顺序拿到了光蛋白（水母素）的基因。 　　1992年普腊石拿到了GFP的基因。 　　1993年GFP中生色基团的结构被确认。 　　1994年沙尔菲通过大肠杆菌和线虫研究获得了GFP的生色机理；是年，第一种蓝色荧光蛋白被报道，并提到了它可用于荧光共振能量转移（FRET）实验中。 　　1995年研制出了增强型绿色荧光蛋白（EGFP），它的转录速度比野生GFP快四倍。 　　1996年得到了野生GFP和EGFP的晶体结构，钱永健在EGFP的基础上，利用突变技术，设计并研制出黄色荧光蛋白。 　　1997年光蛋白和GFP被用于Ca2+的敏感指示剂。 　　1999年后各种各样的荧光蛋白被发明、改造并用于科学研究。 　　在研究GFP的50多年间，2008年诺贝尔化学奖的三位得主做出了至关重要的贡献。 　　 　　2下村修与维多利亚水母 　　 　　在下村修以前就有人研究过生物发光现象，例如萤火虫发出荧光，是由荧光酶（luciferase）作为酶催化氧化底物分子荧光素（luciferin）以后产生荧光。而蛋白质本身发光，无需底物，起源是下村修的研究。 　　1962年，下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道，他们分离纯化了维多利亚多管水母中的发光蛋白―水母素。据说下村修用水母提取发光蛋白时，有天下班前，他将产物倒进水池里。临出门前关灯，回望了一眼水池，见到水池闪闪发光。因为水池也排放有养鱼缸的水，他怀疑是鱼缸成分影响了光蛋白。然而不久之后，他便确定钙离子能增强光蛋白发光。 　　1963年，他和另一位研究者约翰森在《科学》杂志报道钙和光蛋白发光的关系。其后Ridgway和Ashley提出可以用光蛋白来检测钙浓度，创造了检测钙的新方法。钙离子是生物体内的重要信号分子，光蛋白成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法，是目前仍用的方法之一。 　　其实早在1955年，Davenport和Nicol就发现水母可以发出绿光，但不知其因。在1962年下村修和约翰森在那篇纯化光蛋白的文章中，有个注脚，说还发现了另一种蛋白，它在日光下略呈绿色，在白炽灯下略显黄色，而在紫外灯下则发出强烈的绿色荧光。其后他们仔细研究了其发光特性。1974年，通过纯化他们得到了这种蛋白，当时称之为绿色蛋白，即现在所谓的称绿色荧光蛋白。Morin和Hastings提出光蛋白和GFP之间可以发生能量转移。光蛋白在钙刺激下会发光，其能量可转移到GFP，刺激GFP发光（图2）。 　　GFP是一种酸性球状蛋白质，它的发射光谱在505 nm具有吸收峰；激发光谱则在395 nm和470 nm具有吸收高峰（图4）。 　　只有完整的GFP分子才会产生生物荧光，但与荧光的产生直接有关的是GFP分子中一小段被称为生色基团的部位。在GFP的初级氨基酸序列上，第65个至第67个氨基酸（Ser-Tyr-Gly）形成环状六肽三体，以共价键与GFP蛋白肽键骨架相连（图5）。生色基团形成的机理目前尚不清楚，但在有分子氧存在的条件下，酪氨酸氧化成脱氢酪氨酸，并环化形成六肽，这可能是形成色基的必然过程。下村修最先推导了水母GFP色基结构，后来又进行了进一步验证与修改。 　　 　　下村修本人对GFP的应用前景不感兴趣，也没有意识到应用的重要性。但他的研究却切切实实地对之后的生物科学起到了革命性的作用。当他离开普林斯顿到Woods Hole海洋研究所后，他的同事普腊石（Douglas Prasher）对生物示踪分子非常感兴趣。1985年普腊石和日裔科学家Satoshi Inouye独立根据蛋白质顺序拿到了光蛋白的基因（准确地说是cDNA）。1992年，普腊石拿到了GFP的基因。有了cDNA，一般生物学研究者就能很好地应用它，比使用蛋白质更为方便。 　　1996年，GFP的晶体结构也被研究得到，它是一个由11个β－折叠的蛋白质以一个α－螺旋蛋白质为中心轴所形成的笼状圆柱体，生色基团是α－螺旋蛋白质的重要组成部分，它的位置非常接近这个笼状圆柱体的中心位置（图6）。另一种平面的GFP表示方式如图7，其中绿色的代表β－折叠，红色的代表α－螺旋。 　　 　　3沙尔菲将GFP应用于生物示踪 　　 　　将GFP表达到其他生物体这项工作，1994年由两个实验室独立进行：美国哥伦比亚大学做线虫的沙尔菲实验室，和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji。 　　沙尔菲在之前的工作中一直和Caenorhabditis elegans（一种被广泛用于生物研究的线虫）打交道。C. elegans这种线虫只有959个细胞的一个脑，并且其三分之一的基因和人类基因有关。更重要的是，C. elegans是透明的，研究人员可以很方便的应用显微镜对其进行观察研究。
　　1988年当沙尔菲得知GFP后，他意识到可以使用这一工具对C. elegans进行研究，它可以作为变化的绿色信号对线虫不同细胞间的活动进行示踪观察。他将GFP基因与其他不同基因结合成可发出荧光的蛋白质的想法付诸于实践后，就能观察到细胞中不同蛋白质的形成。 　　沙尔菲使用DNA技术，将GFP的基因作为一个片段注射到成熟的线虫的性腺细胞核中（图7A），由于线虫是雌雄同体，它可以使自已受精。GFP基因就出现在它的卵中（图7B），这些卵分裂后形成新的细胞核在紫外光照射下可发出荧光（图7C和D），图7E中显示了两个这样的细胞核。 　　 　　光蛋白和GFP都有重要的应用，但光蛋白是荧光酶的一种，它需要荧光素才能发光，而GFP蛋白质本身即能发光，在原理上有重大突破。在上世纪90年代，科学家一般认为荧光物质在细胞中是通过许多步骤得到，每一步都需要蛋白质来控制，并且此过程需要一些特殊的蛋白质（荧光素）来产生GFP中的生色基团。但沙尔菲用实验证实了这个假设是错误的。沙尔菲的研究向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的示踪分子的作用。 　　当时沙尔菲的论文引起了巨大轰动，很多生物学研究者纷纷将GFP引入自己的系统。在一个新系统表达GFP就能在《自然》、《科学》上发表文章，其实不过是跟风性质，没有原创性。 　　将GFP用作示踪分子，具有以下优点：①荧光稳定；②检测方便；③无种属特异性，也没有细胞种类和位置的限制；④GFP对受体细胞基本无毒害；⑤由于其他生物本身不含有GFP，因此不会出现假阳性结果；⑥不需任何反应底物和辅助因子；⑦可制成永久标本；⑧灵敏度高。 　　尽管GFP作为报告基因或示踪分子有许多优点，但野生GFP发出的荧光较弱。其次，荧光反应不是酶反应，不能通过添加某些物质来加强信号，且不易对荧光进行定量检测。另一方面，GFP基因在植物细胞内的表现频率并不高，甚至在某些植物细胞中并不表现。所以有更多的科学家对GFP进行了改进。 　　从1961年到1974年，下村修和约翰森的研究遥遥领先，而很少被人注意。在1974年以后，特别是八十年代后的后继工作，很多研究生都能够完成。其中例外的是钱永健所在实验室所发现的变种出现新颜色，这一发现却非显而易见。 　　 　　4钱永健改造并发展了GFP的应用 　　 　　随着生物信息学、定点突变，DNA－shuffling等一系列理论和技术的应用，绿色荧光蛋白的家族成员不断扩大，出现荧光光谱、温度敏感性等改变的多种变异型。具有不同光谱特性的GFP突变体的获得拓宽了GFP的应用范围，解决了许多单独运用GFP不能解决的问题。GFP基因的改进目前主要通过以下几个途径得到突变体GFP：①更换GFP生色团氨基酸；②改变碱基组成；③除去GFP基因中隐蔽剪接位点；④插入植物内含子；⑤更换强启动子等突变体GFP；⑥增加荧光强度和热稳定性。 　　目前已有的具不同光谱的突变型有EBFP（增强型蓝色荧光蛋白）、ECFP（增强型青色荧光蛋白）、EGFP（增强型绿色荧光蛋白）和EVFP（增强型黄色荧光蛋白），分别呈现蓝、青、绿、黄四种颜色。至今所获得突变型的最大发射波长为529nm，为黄绿色荧光。 　　钱永健是和下村修研究相关的一位重要科学家。从八十年代一开始，他的工作就非常引人瞩目。同时他十分肯定下村修的工作，较早公开介绍下村修的发现。在他的研究工作中，有两项重要工作都与下村修有一定联系。 　　一项是研究钙染料。1980年钱永健发明检测Ca2+浓度的染料分子，1981年改进了将染料引入细胞的方法，以后发明了更多、更好的染料，被广泛地应用。检测钙的方法有三种：选择性电极、光蛋白、钙染料。在钱永健研制的钙染料没有出现以前，具有空间检测能力的只有光蛋白，但当时光蛋白需要注射到细胞内，应用不方便。钱永健的钙染料可以通透到细胞里面去。 　　钱永健的第二项工作是研究GFP。1994年起，钱永健开始研究并改造GFP，并获得了多项发现。世界上用的大多数是钱永健实验室改造后的变种。改造后的GFP促进了生色基团的折叠，改善了其荧光特性，甚至可以得到红色、黄绿色、蓝色等多种颜色的荧光蛋白，有的可激活、可变色，大大拓宽了GFP研究的领域。他被公认为这方面的先驱。 　　钱永健对人们理解GFP及GFP族的化学荧光特性做出了重要的贡献，他使不同的GFP产生的荧光颜色覆盖了整个可见光谱，同时他改善了生色基团，增强了GFP的荧光效应，也使荧光的稳定性增强。他发展了GFP，使之成为极有效的研究动态生命过程的基因标记工具。 　　 　　5结束语 　　 　　科学上一个偶然的发现往往会引起巨大的科学革命，新工具的出现会使研究取得意想不到的新成果。当年下村修研究了GFP，但他并没有意识到GFP重要的应用前景。沙尔菲恰恰在自己的实验研究过程中采用了最新的GFP研究成果，并发展了GFP的应用领域。而当今世界上用的GFP大多数是钱永健实验室改造后的变种。 　　获得2008年诺贝尔化学奖的三位科学家在发现和研究GFP的过程中各有贡献，而且可以看出他们的研究是一脉相承的。随着分子生物学理论与技术的发展，对GFP研究的进一步深入，GFP在分子生物学领域的应用进一步加强。GFP工程，包括GFP蛋白工程和GFP基因工程，尤其GFP基因作为新型报告基因越来越受到关注。当然在应用GFP作为研究工具时，也遇到了一些问题。例如将GFP作为选择标记基因成功构建多种表达外源基因的重组质粒时发现一些因素影响着GFP的检测。此外，在细胞生物学的研究过程中发现新生GFP通过折叠和加工成为具有活性的形式过程十分缓慢。但随着生物技术的发展，对GFP的基础理论研究的进一步深入和新型突变体的不断出现，有理由相信这些问题终将会得到解决，从而使GFP更好地为科学研究服务。 　　 　　参考文献： 　　[1]Baird G. S，Zachatias D. A，Tsien R. Y．Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins[J]．Proc Natl Acad Sci USA，1999(20)：． 　　[2]Heim R，Cubitt A. B，Tsien R.省略/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/[EB/OL].． 　　[5]http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm[EB/OL].．
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甜菊（Stevia rebaudiana Bertoni）钙调蛋白基因的克隆、表达及绿色荧光蛋白基因转化甜菊的研究
[博士毕业论文]论文目录&中文摘要第1-8
页 缩略词中英文对照第8-9
页 1 前言第9-38
页 　　1．1 钙调蛋白的研究历史进展第9-16
页 　　　　1．1．1 钙调蛋白的发现第10
页 　　　　1．1．2 钙调蛋白的理化特点第10-12
页 　　　　1．1．3 钙调蛋白的功能第12-14
页 　　　　1．1．4 植物CaM的基因结构及其多型性第14
页 　　　　1．1．5 植物中CaM及CaM相关基因的表达动力学第14-16
页 　　1．2 胞质钙信号的研究进展第16-25
页 　　　　1．2．1 钙离子成为胞内信使的基础第17
页 　　　　1．2．2 细胞的钙转移系统第17-22
页 　　　　1．2．3 钙信号的研究方法进展第22-23
页 　　　　1．2．4 钙离子瞬时改变对植物的调控异质性第23-25
页 　　1．3 植物遗传转化的研究进展第25-31
页 　　　　1．3．1 植物遗传转化现状概述第25-26
页 　　　　1．3．2 品质改良基因工程研究第26-27
页 　　　　1．3．3 调控生长发育的基因工程研究第27-28
页 　　　　1．3．4 生产医用蛋白的基因工程研究第28-29
页 　　　　1．3．5 生产工业原料的基因工程研究第29
页 　　　　1．3．6 抗非生物胁迫基因工程研究第29-30
页 　　　　1．3．7 抗病虫害基因工程研究第30-31
页 　　1．4 绿色荧光蛋白的研究现状第31-36
页 　　　　1．4．1 绿色荧光蛋白的生化特性和发光机理第32-33
页 　　　　1．4．2 绿色荧光蛋白的改造第33-34
页 　　　　1．4．3 绿色荧光蛋白在植物中的应用第34-36
页 　　1．5 本研究的目的与意义第36-38
页 2 材料与方法第38-51
页 　　2．1 材料第38
页 　　2．2 甜菊钙调蛋白基因的克隆、表达载体的构建及诱导表达第38-44
页 　　　　2．2．1 甜菊总RNA的提取与纯化第38
页 　　　　2．2．2 RNA的甲醛变性电泳第38
页 　　　　2．2．3 甜菊cDNA第一链的合成第38-39
页 　　　　2．2．4 PCR体外扩增第39
页 　　　　2．2．5 PCR扩增产物的纯化第39
页 　　　　2．2．6 DNA连接反应第39-40
页 　　　　2．2．7 E．coli感受态细胞的制备第40
页 　　　　2．2．8 连接产物转化E．coli感受态细胞第40
页 　　　　2．2．9 重组子克隆的筛选鉴定第40
页 　　　　2．2．10 质粒的小量提取第40-41
页 　　　　2．2．11 限制性内切酶酶切第41
页 　　　　2．2．12 原核表达载体PLC的构建第41
页 　　　　2．2．13 表达产物的诱导第41-42
页 　　　　2．2．14 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）第42
页 　　　　2．2．15 苯基-琼脂糖（phenyl-sepharose）疏水亲和层析第42
页 　　　　2．2．16 RCaM-1的提纯第42-43
页 　　　　2．2．17 花椰菜钙调蛋白的纯化第43
页 　　　　2．2．18 小鼠抗花椰菜钙调蛋白血清的制备第43
页 　　　　2．2．19 蛋白质斑点杂交第43-44
页 　　　　2．2．20 Western Blot分析第44
页 　　2．3 盐胁迫对甜菊钙离子浓度的影响第44-45
页 　　　　2．3．1 甜菊愈伤组织的培养第44
页 　　　　2．3．2 原生质体的制备第44
页 　　　　2．3．3 原生质体活性的测定第44-45
页 　　　　2．3．4 Fluo-3／AM负载条件的确定第45
页 　　　　2．3．5 激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）测定时样品处理第45
页 　　　　2．3．6 Ca~（2+）浓度变化的LSCM测定第45
页 　　2．4 绿色荧光蛋白植物双元表达载体的构建第45-47
页 　　　　2．4．1 GFP-mut2基因的PCR扩增第46
页 　　　　2．4．2 中间载体pBΩG的构建第46
页 　　　　2．4．3 植物双元表达载体1301pBΩG的构建第46
页 　　　　2．4．4 双元质粒载体转化农杆菌第46-47
页 　　2．5 绿色荧光蛋白基因转化甜菊愈伤组织第47-51
页 　　　　2．5．1 甜菊再生系统的优化第47
页 　　　　2．5．2 甜菊HYG基础抗性的测定第47
页 　　　　2．5．3 农杆菌法转化第47-48
页 　　　　2．5．4 转化体的筛选第48
页 　　　　2．5．5 转化体的鉴定第48-51
页 3 结果与分析第51-87
页 　　3．1 甜菊钙调蛋白基因的克隆、结构分析及表达第51-67
页 　　　　3．1．1 甜菊钙调蛋白基因的RT-PCR扩增第51
页 　　　　3．1．2 PCR扩增产物的克隆和重组子的鉴定第51-53
页 　　　　3．1．3 甜菊钙调蛋白的基因序列及相应的氨基酸序列比较分析第53-54
页 　　　　3．1．4 RCaM-1原核表达载体PLC的构建第54-55
页 　　　　3．1．5 甜菊CaM在大肠杆菌中的诱导表达第55-60
页 　　　　3．1．6 讨论第60-67
页 　　3．2 盐胁迫对甜菊钙离子浓度的影响第67-73
页 　　　　3．2．1 原生质体存活率的测定第67
页 　　　　3．2．2 不同条件对Fluo-3／AM导入甜菊愈伤组织原生质体的影响第67-68
页 　　　　3．2．3 不同浓度NaCl对甜菊愈伤组织原生质体[Ca~（2+）]_（cyt）变化的影响第68-69
页 　　　　3．2．4 LiCl和肌醇预处理对NaCl诱导[Ca~（2+）]_（cyt）改变的影响第69
页 　　　　3．2．5 原生质体外无Ca~（2+）时NaCl对[Ca~（2+）]_（cyt）的影响第69-70
页 　　　　3．2．6 讨论第70-73
页 　　3．3 绿色荧光蛋白植物双元表达载体的构建第73-75
页 　　　　3．3．1 GFP-mut2的PCR扩增第73
页 　　　　3．3．2 中间载体pBΩG的构建第73
页 　　　　3．3．3 植物双元表达载体1301pBΩG的构建第73-74
页 　　　　3．3．4 双元质粒载体转化农杆菌第74
页 　　　　3．3．5 讨论第74-75
页 　　3．4 绿色荧光蛋白基因转化甜菊愈伤组织第75-87
页 　　　　3．4．1 甜菊再生系统的建立及优化第75-76
页 　　　　3．4．2 筛选剂的选择和基础抗性的测定第76-77
页 　　　　3．4．3 农杆菌转化条件的优化第77-79
页 　　　　3．4．4 转化体的筛选第79-80
页 　　　　3．4．5 外源基因整合及表达检测结果第80-83
页 　　　　3．4．6 讨论第83-87
页 4 结论及展望第87-88
页 参考文献第88-99
页 附录第99-100
页 英文摘要第100-102
页 致谢第102页
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