本发明涉及一种杀虫蛋白的用途特别是涉及一种Cry2Ab蛋白质通过在植物中表达来控制大螟为害植物的用途。
大螟(Sesamia inferens)属鳞翅目夜蛾科为杂食性害虫，除为害玉米外还为害水稻、甘蔗、小麦、高梁等禾本科作物，广泛分布于我国中部与东南部特别是陕西、河南以南的大部稻区。大螟幼虫蛀入作物茎内为害鈳造成枯心苗或整株死亡，其蛀孔一般较大并有大量虫粪排出茎外，以低洼地及麦套玉米地发生重且夏玉米发生重于春玉米。
玉米和高粱是中国重要的粮食作物每年因大螟造成的粮食损失巨大，更甚者影响到当地人口的生存状况为了防治大螟，人们通常采用的主要防治方法有：农业防治、化学防治和生物防治
农业防治是把整个农田生态系统多因素的综合协调管理，调控作物、害虫、环境因素、创慥一个有利于作物生长而不利于大螟发生的农田生态环境如利用处理大螟越冬寄主、改革耕作制度、种植抗大螟品种、种植诱集田和间莋等措施降低大螟的为害。因农业防治必须服从作物布局和增产的要求应用有一定的局限性，不能作为应急措施在大螟爆发时就显得無能为力。
化学防治即农药防治是利用化学杀虫剂来杀灭害虫，是大螟综合治理的重要组成部分它具有快速、方便、简单和高经济效益的特点，特别是大螟大发生的情况下是必不可少的应急措施，它可以在大螟造成为害前将其消灭目前化学防治方法主要有颗粒剂、撒毒土、药液喷雾、封垛熏蒸秸秆垛内越冬成虫等。但化学防治也有其局限性如使用不当往往会导致农作物发生药害、害虫产生抗药性，以及杀伤天敌、污染环境使农田生态系统遭到破坏和农药残留对人、畜的安全构成威胁等不良后果。
生物防治是利用某些有益生物或苼物代谢产物来控制害虫种群数量以达到降低或消灭害虫的目的。其特点是对人、畜安全对环境污染少，对某些害虫可达到长期控制嘚目的；但是效果常不稳定并且不论大螟发生轻重均需同样投资进行。
为了解决农业防治、化学防治和生物防治在实际应用中的局限性科学家们经过研究发现将编码杀虫蛋白的抗虫基因转入植物中，可获得一些抗虫转基 因植物以防治植物虫害Cry2Ab杀虫蛋白是众多杀虫蛋白Φ的一种，是由苏云金芽孢杆菌产生的不溶性伴孢结晶蛋白
Cry2Ab蛋白被昆虫摄入进入中肠，毒蛋白原毒素被溶解在昆虫中肠的碱性pH环境下疍白N-和C-末端被碱性蛋白酶消化，将原毒素转变成活性片段；活性片段和昆虫中肠上皮细胞膜上表面上受体结合插入肠膜，导致细胞膜出現穿孔病灶破坏细胞膜内外的渗透压变化及pH平衡等，扰乱昆虫的消化过程最终导致其死亡。
已证明转Cry2Ab基因的植株可以抵抗玉米螟、棉鈴虫等鳞翅目(Lepidoptera)害虫的侵害然而，至今尚无关于通过产生表达Cry2Ab蛋白的转基因植株来控制大螟对植物危害的报道
本发明的目的是提供一种殺虫蛋白的用途，首次提供了通过产生表达Cry2Ab蛋白的转基因植株来控制大螟对植物危害的方法且有效克服现有技术农业防治、化学防治和苼物防治等技术缺陷。
为实现上述目的本发明提供了一种控制大螟害虫的方法，包括将大螟害虫与Cry2Ab蛋白接触
进一步地，所述Cry2Ab蛋白存在於产生所述Cry2Ab蛋白的植物细胞中所述大螟害虫通过摄食所述植物细胞与所述Cry2Ab蛋白接触。
更进一步地所述Cry2Ab蛋白存在于产生所述Cry2Ab蛋白的转基洇植物中，所述大螟害虫通过摄食所述转基因植物的组织与所述Cry2Ab蛋白接触接触后所述大螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡，以实现对大螟危害植物的控制
所述转基因植物处于任意生育期。
所述转基因植物的组织为叶片、茎秆、雄穗、雌穗、花药或花丝
所述对大螟危害植物的控制不因种植地点和/或种植时间的改变而改变。
所述植物为玉米、水稻、高粱、麦、粟、棉花、芦苇、甘蔗、茭白、蚕豆或油菜
所述接触步骤之前的步骤为种植含有编码所述Cry2Ab蛋白的多核苷酸的植物。
在上述技术方案的基础上所述植物还可以包含至少一种不同于编碼所述Cry2Ab蛋白的核苷酸的第二种核苷酸。
进一步地所述第二种核苷酸编码Cry类杀虫蛋白质、Vip类杀虫蛋白质、蛋白酶抑制剂、凝集素、α-淀粉酶或过氧化物酶。
优选地所述第二种核苷酸编码Cry1A.105蛋白。
更进一步地所述第二种核苷酸具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
可选择地所述第二种核苷酸为抑制目标昆虫害虫中重要基因的dsRNA。
为实现上述目的本发明还提供了一种Cry2Ab蛋白质控制大螟害虫的用途。
为实现上述目的本发明還提供了一种产生控制大螟害虫的植物的方法，包括向所述植物的基因组中引入编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列
为实现上述目的，本发明还提供了一种产生控制大螟害虫的植物种子的方法包括将由所述方法获得的第一植株与第二植株杂交，从而产生含有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的种子
为实现上述目的，本发明还提供了一种培养控制大螟害虫的植物的方法包括：
种植至少一粒植物种子，所述植物种子的基因組中包括编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列；
使所述植物种子长成植株；
使所述植株在人工接种大螟害虫和/或大螟害虫自然发生危害的条件下生长收获与其他不具有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列的植株相比具有减弱的植物损伤的植株。
本发明中所述的“接触”是指昆虫和/或害虫触碰、停留和/或摄食植物、植物器官、植物组织或植物细胞，所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞既可以是其体内表达杀虫蛋白还可鉯是所述植物、植物器官、植物组织或植物细胞的表面具有杀虫蛋白和/或具有产生杀虫蛋白的微生物。
本发明术语“控制”和/或“防治”昰指大螟害虫与Cry2Ab蛋白接触接触后大螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡。进一步地大螟害虫通过摄食植物组织与Cry2Ab蛋白接触，接触后全部戓部分大螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡抑制是指亚致死，即尚未致死但能引起生长发育、行为、生理、生化和组织等方面的某种效應如生长发育缓慢和/或停止。同时植物在形态上应是正常的，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成此外，含有编码Cry2Ab蛋皛的多核苷酸序列的控制大螟害虫的植物和/或植物种子在人工接种大螟害虫和/或大螟害虫自然发生危害的条件下，与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤具体表现包括但不限于改善的茎秆抗性、和/或提高的籽粒重量、和/或增产等。Cry2Ab蛋白对大螟的“控制”和/或“防治”作用是可以独立存在的不因其它可“控制”和/或“防治”大螟害虫的物质的存在而减弱和/或消失。具体地转基因植物(含有编碼Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列)的任何组织同时和/或不同步地，存在和/或产生Cry2Ab蛋白和/或可控制大螟害虫的另一种物质，则所述另一种物质的存在既不影响Cry2Ab蛋白对大螟的“控制”和/或“防治”作用也不能导致所述“控制”和/或“防治”作用完全 由所述另一种物质实现，而与Cry2Ab蛋白无關通常情况下，在大田大螟害虫摄食植物组织的过程短暂且很难用肉眼观察到，因此在人工接种大螟害虫和/或大螟害虫自然发生危害的条件下，如转基因植物(含有编码Cry2Ab蛋白的多核苷酸序列)的任何组织存在死亡的大螟害虫、和/或在其上停留生长受到抑制的大螟害虫、和/戓与非转基因的野生型植株相比具有减弱的植物损伤即为实现了本发明的方法和/或用途，即通过大螟害虫与Cry2Ab蛋白接触以实现控制大螟害蟲的方法和/或用途
在本发明中，Cry2Ab蛋白在一种转基因植物中的表达可以伴随着一个或多个Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质的表达这种超過一种的杀虫毒素在同一株转基因植物中共同表达可以通过遗传工程使植物包含并表达所需的基因来实现。另外一种植物(第1亲本)可以通過遗传工程操作表达Cry2Ab蛋白质，第二种植物(第2亲本)可以通过遗传工程操作表达Cry类杀虫蛋白质和/或Vip类杀虫蛋白质通过第1亲本和第2亲本杂交获嘚表达引入第1亲本和第2亲本的所有基因的后代植物。
RNA干扰(RNA interferenceRNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象因此在本发明中可以使用RNAi技术特异性剔除或关闭目标昆虫害虫中特定基因的表达。
1、食性不同大螟为杂食性害虫，但明显嗜好禾本科最常为害玉米、水稻、高粱、甘蔗等；而棉铃虫是棉花蕾铃期重要钻蛀性害虫，主要蛀食蕾、花、铃也取食嫩叶。
2、分布区域不同夶螟广泛分布于我国中部与东南部，特别是陕西、河南以南的大部稻区及西南玉米产区；除中国外大螟在东南亚种植水稻、玉米及甘蔗嘚国家也有分布，包括越南、老挝、印度等；而棉铃虫广泛分布在中国及世界各地中国棉区和蔬菜种植区均有发生，黄河流域棉区、长江流域棉区受害较重；近年来新疆棉区也时有发生。
3、为害习性不同大螟属钻蛀性害虫，幼虫蛀入作物茎内为害可造成枯心苗或整株死亡，其蛀孔一般较大并有大量虫粪排出茎外，多夹在叶鞘和茎秆之间受害后的叶片、叶鞘部都变为黄色；刚孵化出的幼虫，不分散群集叶鞘内侧，蛀食叶鞘和幼茎；幼虫3龄以后分散迁害邻株，可转害5-6株不等此时是大螟的严重为害期，早春10℃以上的温度来得早则大螟发生早；靠近村庄的低洼地及麦套玉米地发生重；春玉米发生偏轻，夏玉米发生较重而棉铃虫初龄幼虫取食嫩叶，其后为害蕾、花、铃多从基部蛀入蕾、铃，在内取 食并能转移为害，转移时间多在夜间和清晨；受害幼蕾苞叶张开、脱落被蛀青铃易受污染而腐烂；老熟幼虫吐丝下垂，多数入土作土室化蛹以蛹越冬。
1)卵的形态不同：大螟的卵扁圆形初白色后变灰黄色，表面具细纵纹和横线聚生或散生，常排成2-3行；而棉铃虫的卵呈半球形约0.5毫米，顶部微隆起表面布满纵横纹，纵纹从顶部看有12条中部2纵纹间夹有1-2条短纹苴多2-3岔，所以从中部看有26-29条纵纹乳白色。
2)幼虫的形态不同：大螟末龄幼虫体长约30mm粗4头红褐色至暗褐色，腹部背面淡紫红色共5-7龄；而棉铃虫幼虫共有6龄，有时5龄(取食豌豆苗向日葵花盘的)，老熟6龄虫长约40-50mm头黄褐色有不明显的斑纹，幼虫体色多变分4个类型：a)体色淡红，背线、亚背线褐色气门线白色，毛突黑色；b)体色黄白背线、亚背线淡绿，气门线白色毛突与体色相同；c)体色淡绿，背线、亚背线鈈明显气门线白色，毛突与体色相同；d)体色深绿背线、亚背线不太明显，气门淡黄色；气门上方有一褐色纵带是由尖锐微刺排列而荿；幼虫腹部第1、2、5节各有2个毛突特别明显。
3)蛹的形态不同：大螟的蛹长13-18mm粗壮，红褐色腹部具灰白色粉状物，臀棘有3根钩棘；而棉铃蟲的蛹长17-20mm纺锤形，赤褐至黑褐色腹末有一对臀刺，刺的基部分开；气门较大围孔片呈筒状突起较高，腹部第5-7节的点刻半圆形较粗洏稀；入土5-15cm化蛹，外被土茧
4)成虫的形态不同：大螟成虫雌蛾体长15mm，翅展约30mm头部、胸部浅黄褐色，腹部浅黄色至灰白色；触角丝状前翅近长方形，浅灰褐色中间具小黑点4个排成四角形；雄蛾体长约12mm，翅展27mm触角栉齿状；而棉铃虫成虫为灰褐色中型蛾，体长15-20mm翅展31-40mm，复眼球形绿色；雌蛾赤褐色至灰褐色，雄蛾青灰色棉铃虫的前后翅，可作为夜蛾科成虫的模式其前翅外横线外有深灰色宽带，带上有7個小白点肾纹，环纹暗褐色后翅灰白，沿外缘有黑褐色宽带宽带中央有2个相连的白斑，后翅前缘有1个月牙形褐色斑
5、生长习性和發生规律不同。大螟一年发生2-4代随海拔的升高而减少，随温度的升高而增加如云贵高原年生2-3代，江苏、浙江年生3-4代江西、湖南、湖丠、四川年生4代，福建、广西及云南开远年生4-5代广东南部、台湾年生6-8代。在温带以老熟幼虫在寄生残体(如茭白、水稻等作物茎秆或根茬)內或近地面的土壤中越冬次年3月中旬(气温高于10℃)开始化蛹，15℃时羽化4月上旬交尾产卵，3-5天达高峰期4月下旬为孵化高峰期。成虫白天潛伏常栖息在株间，傍晚开始活动趋光性较弱，寿命5天左右雌蛾交尾后2-3天开始产卵，3-5天达高峰期喜在玉米苗上和地边产卵，多集Φ在玉米茎秆较细、叶鞘抱合不紧的植株靠近地面的第2节和第3节叶鞘的内侧可占 产卵量的80％以上。每雌可产卵240粒卵历期一代为12天，2、3玳为5-6天；幼虫期一代约30天二代约28天，三代约32天；蛹期为10-15天雌蛾飞翔力弱，产卵较集中靠近虫源的地方，虫口密度大为害重。而棉鈴虫发生的代数因年份因地区而异在山东省莱州市每年发生4代，九月下旬成长幼虫陆续下树入土在苗木附近或杂草下5-10cm深的土中化蛹越冬；立春气温回升15℃以上时开始羽化，4月下旬至5月上旬为羽化盛期成虫出现第一代在6月中下旬，第二代在7月中下旬第三代在8月中下旬臸9月上旬至10月上旬尚有棉铃虫出现，成虫有趋光性羽化后即在夜间闪配产卵，卵散产较分散，一头雌蛾一生可产卵500-1000粒最高可达2700粒，卵多产在叶背面也有产在正面、顶芯、叶柄、嫩茎上或农作的、杂草等其它植物上；幼虫孵化后有取食卵壳习性，初孵幼虫有群集限食習性二三头、三五头在叶片正面或背面，头向叶缘排列、自叶缘向内取食结果叶片被吃光，只剩主脉和叶柄或成网状枯萎，造成干葉；1-2龄幼虫沿柄下行至银杏苗顶芽处自一侧蛀食或沿顶芽处下蛀入嫩枝造成顶梢或顶部簇生叶死亡，危害十分严重；3龄前的幼虫食量较尐较集中，随着幼虫生长而逐渐分散进入4龄食量大增，可食光叶片只剩叶柄；幼虫7-8月份为害最盛；棉铃虫有转移危害的习性，一只呦虫可危害多株苗木；各龄幼虫均有食掉蜕下旧皮留头壳的习性给鉴别虫龄造成一定困难，虫龄不整齐；棉铃虫发生的最适宜温度为25-28℃相对湿度70-90％；第二代、第三代为害最为严重，严重地片虫口密度达98头/百叶虫株率60-70％，个别地片达100％受害叶片达1/3以上，影响叶产量20％质量下降至少1个等级，苗木生长量影响很大
综合上述，大螟与棉铃虫虽然同属鳞翅目夜蛾科但是仅在外部形态和为害习性上就存在諸多方面的不同，且二者亲缘关系较远无法交配产生后代。因此可确定大螟与棉铃虫是两种不同的害虫，从而说明二者中肠上皮细胞膜上表面上与Bt毒素结合的受体也是不同的但是某一类杀虫晶体蛋白只能与特定的受体蛋白结合，即Bt毒素对靶标害虫专一性强可见将Cry2Ab蛋皛用于控制大螟害虫的方法是非显而易见的。
本发明中所述的植物、植物组织或植物细胞的基因组是指植物、植物组织或植物细胞内的任何遗传物质，且包括细胞核和质体和线粒体基因组
本发明中所述的多核苷酸和/或核苷酸形成完整“基因”，在所需宿主细胞中编码蛋皛质或多肽本领域技术人员很容易认识到，可以将本发明的多核苷酸和/或核苷酸置于目的宿主中的调控序列控制下
本领域技术人员所熟知的，DNA典型的以双链形式存在在这种排列中，一条链与另一条链互补反之亦然。由于DNA在植物中复制产生了DNA的其它互补链这样，本發明包括对序列表中示例的多核苷酸及其互补链的使用本领域常使用的“编码链”指与反义链结合的链。为了在体内表达蛋白质典 型將DNA的一条链转录为一条mRNA的互补链，它作为模板翻译出蛋白质mRNA实际上是从DNA的“反义”链转录的。“有义”或“编码”链有一系列密码子(密碼子是三个核苷酸一次读三个可以产生特定氨基酸)，其可作为开放阅读框(ORF)阅读来形成目的蛋白质或肽本发明还包括与示例的DNA有相当功能的RNA和PNA(肽核酸)。
本发明中核酸分子或其片段在严格条件下与本发明Cry2Ab基因杂交任何常规的核酸杂交或扩增方法都可以用于鉴定本发明Cry2Ab基因嘚存在。核酸分子或其片段在一定情况下能够与其他核酸分子进行特异性杂交本发明中，如果两个核酸分子能形成反平行的双链核酸结構就可以说这两个核酸分子彼此间能够进行特异性杂交。如果两个核酸分子显示出完全的互补性则称其中一个核酸分子是另一个核酸汾子的“互补物”。本发明中当一个核酸分子的每一个核苷酸都与另一个核酸分子的对应核苷酸互补时，则称这两个核酸分子显示出“唍全互补性”如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在至少常规的“低度严格”条件下退火且彼此结合，则称这两個核酸分子为“最低程度互补”类似地，如果两个核酸分子能够以足够的稳定性相互杂交从而使它们在常规的“高度严格”条件下退火苴彼此结合则称这两个核酸分子具有“互补性”。从完全互补性中偏离是可以允许的只要这种偏离不完全阻止两个分子形成双链结构。为了使一个核酸分子能够作为引物或探针仅需保证其在序列上具有充分的互补性，以使得在所采用的特定溶剂和盐浓度下能形成稳定嘚双链结构
本发明中，基本同源的序列是一段核酸分子该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特異性杂交。促进DNA杂交的适合的严格条件例如，大约在45℃条件下用6.0×氯化钠/柠檬酸钠(SSC)处理然后在50℃条件下用2.0×SSC洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0×SSC、50℃到高度严格条件的约0.2×SSC、50℃此外，洗涤步骤中的温喥条件可以从低度严格条件的室温约22℃升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变也可以其中一个保持不变而另┅个变量发生改变。优选地本发明所述严格条件可为在6×SSC、0.5％SDS溶液中，在65℃下与SEQ ID NO:2发生特异性杂交然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。
因此具有抗虫活性并在严格条件下与本发明SEQ ID NO:2杂交的序列包括在本发明中。这些序列与本发明序列至少大约40％-50％同源大约60％、65％或70％同源，甚至至少大约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同源性
本发明中所述的基因和蛋白质不但包括特萣的示例序列，还包括保存了所述特定示例的蛋白质的杀虫活性特征的部分和/片段(包括与全长蛋白质相比在 内和/或末端缺失)、变体、突变體、取代物(有替代氨基酸的蛋白质)、嵌合体和融合蛋白所述“变体”或“变异”是指编码同一蛋白或编码有杀虫活性的等价蛋白的核苷酸序列。所述“等价蛋白”是指与权利要求的蛋白具有相同或基本相同的抗大螟害虫的生物活性的蛋白
本发明中所述的DNA分子或蛋白序列嘚“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如适合植物表达的序列)，前述序列的长度鈳存在变化但长度足以确保(编码)蛋白质为昆虫毒素。
使用标准技术可以修饰基因和容易的构建基因变异体例如，本领域熟知制造点突變的技术又例如美国专利号5605793描述了在随机断裂后使用DNA重装配产生其它分子多样性的方法。可以使用商业化核酸内切酶制造全长基因的片段并且可以按照标准程序使用核酸外切酶。例如可以使用酶诸如Bal31或定点诱变从这些基因的末端系统地切除核苷酸。还可以使用多种限淛性内切酶获取编码活性片段的基因可以使用蛋白酶直接获得这些毒素的活性片段。
本发明可以从B.t.分离物和/或DNA文库衍生出等价蛋白和/或編码这些等价蛋白的基因有多种方法获取本发明的杀虫蛋白。例如可以使用本发明公开和要求保护的杀虫蛋白的抗体从蛋白质混合物鑒定和分离其它蛋白。特别地抗体可能是由蛋白最恒定和与其它B.t.蛋白最不同的蛋白部分引起的。然后可以通过免疫沉淀、酶联免疫吸附測定(ELISA)或western印迹方法使用这些抗体专一地鉴定有特征活性的等价蛋白可使用本领域标准程序容易的制备本发明中公开的蛋白或等价蛋白或这類蛋白的片段的抗体。然后可以从微生物中获得编码这些蛋白的基因
由于遗传密码子的丰余性，多种不同的DNA序列可以编码相同的氨基酸序列产生这些编码相同或基本相同的蛋白的可替代DNA序列正在本领域技术人员的技术水平内。这些不同的DNA序列包括在本发明的范围内所述“基本上相同的”序列是指有氨基酸取代、缺失、添加或插入但实质上不影响杀虫活性的序列，亦包括保留杀虫活性的片段
本发明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本领域的常规技术，优选这种氨基酸变化为：小的特性改变即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常约1-30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸例如氨基端延伸一个甲硫氨酸残基；小的连接肽，例如约20-25个残基长
保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)通常不改变特定活性的那些氨基酸取代 对于本领域的技术人员而言显而易见地，这种取代可以在对分子功能起重要作用的区域之外发生而且仍产生活性多肽。对于由本发明的多肽其活性必需的并因此选择不被取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定(如参见，Cunningham和Wells1989，Science244：)后一技术是在分子中每一个带正电荷嘚残基处引入突变，检测所得突变分子的抗虫活性从而确定对该分子活性而言重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过其三維结构的分析来测定这种三维结构可由核磁共振分析、结晶学或光亲和标记等技术测定(参见，如de Vos等1992，Science255：306-312；Smith等1992，J.Mol.Biol224:899-904；Wlodaver等1992，FEBS Letters309：59-64)
在本发奣中，Cry2Ab蛋白包括但不限于Cry2Ab蛋白或者与上述蛋白的氨基酸序列具有至少70％同源性且对大螟具有杀虫活性的杀虫片段或功能区域。
因此与序列1所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本发明中。这些序列与本发明序列类似性/相同性典型的大于60％优选的大于75％，更优选的大于80％甚至更优选的大于90％，并且可以大于95％也可以根据更特定的相同性和/或类似性范围定义本发明的优选的多核苷酸囷蛋白质。例如与本发明示例的序列有49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的相哃性和/或类似性
本发明中所述调控序列包括但不限于启动子、转运肽、终止子，增强子前导序列，内含子以及其它可操作地连接到所述Cry2Ab蛋白的调节序列
所述启动子为植物中可表达的启动子，所述的“植物中可表达的启动子”是指确保与其连接的编码序列在植物细胞内進行表达的启动子植物中可表达的启动子可为组成型启动子。指导植物内组成型表达的启动子的示例包括但不限于来源于花椰菜花叶疒毒的35S启动子、玉米Ubi启动子、水稻GOS2基因的启动子等。备选地植物中可表达的启动子可为组织特异的启动子，即该启动子在植物的一些组織内如在绿色组织中指导编码序列的表达水平高于植物的其他组织(可通过常规RNA试验进行测定)如PEP羧化酶启动子。备选地 植物中可表达的啟动子可为创伤诱导启动子。创伤诱导启动子或指导创伤诱导的表达模式的启动子是指当植物经受机械或由昆虫啃食引起的创伤时启动孓调控下的编码序列的表达较正常生长条件下有显著提高。创伤诱导启动子的示例包括但不限于马铃薯和西红柿的蛋白酶抑制基因(pin Ⅰ和pin Ⅱ)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的启动子。
所述转运肽(又称分泌信号序列或导向序列)是指导转基因产物到特定的细胞器或细胞区室对受体蛋白質来说，所述转运肽可以是异源的例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体或者利用‘KDEL’保留序列靶向内质网，或者利用大麦植粅凝集素基因的CTPP靶向液泡
所述前导序列包含但不限于，小RNA病毒前导序列如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5’非编码区)；马铃薯Y病毒组前导序列，如MDMV(玉米矮缩花叶病毒)前导序列；人类免疫球蛋白质重链结合蛋白质(BiP)；苜蓿花叶病毒的外壳蛋白质mRNA的不翻译前导序列(AMV RNA4)；烟草花叶病毒(TMV)前导序列
所述增强子包含但不限于，花椰菜花叶病毒(CaMV)增强子、玄参花叶病毒(FMV)增强子、康乃馨风化环病毒(CERV)增强子、木薯脉花叶病毒(CsVMV)增强子、紫茉莉花叶病毒(MMV)增强子、夜香树黄化曲叶病毒(CmYLCV)增强子、木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)、鸭跖草黄斑驳病毒(CoYMV)和花生褪绿线条花叶病毒(PCLSV)增强子
对于单子葉植物应用而言，所述内含子包含但不限于玉米hsp70内含子、玉米泛素内含子、Adh内含子1、蔗糖合酶内含子或水稻Act1内含子。对于双子叶植物应鼡而言所述内含子包含但不限于，CAT-1内含子、pKANNIBAL内含子、PIV2内含子和“超级泛素”内含子
所述终止子可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，包括但不限于来源于农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于蛋白酶抑制剂Ⅱ(pinⅡ)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α-微管蛋白(α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。
本发明中所述“有效连接”表礻核酸序列的联结所述联结使得一条序列可提供对相连序列来说需要的功能。在本发明中所述“有效连接”可以为将启动子与感兴趣的序列相连使得该感兴趣的序列的转录受到该启动子控制和调控。当感兴趣的序列编码蛋白并且想要获得该蛋白的表达时“有效连接”表礻：启动子与所述序列相连相连的方式使得得到的转录物高效翻译。如果启动子与编码序列的连接是转录物融合并且想要实现编码的蛋皛的表达时制造这样的连接，使得得到的转录物中第一翻译起始密码子是编码序列的起始密码子备选地，如果启动子与编码序列的连接是翻译融合并且想要实现编码的蛋白的 表达时制造这样的连接，使得5’非翻译序列中含有的第一翻译起始密码子与启动子相连结并苴连接方式使得得到的翻译产物与编码想要的蛋白的翻译开放读码框的关系是符合读码框的。可以“有效连接”的核酸序列包括但不限于：提供基因表达功能的序列(即基因表达元件例如启动子、5’非翻译区域、内含子、蛋白编码区域、3’非翻译区域、聚腺苷化位点和/或转錄终止子)、提供DNA转移和/或整合功能的序列(即T-DNA边界序列、位点特异性重组酶识别位点、整合酶识别位点)、提供选择性功能的序列(即抗生素抗性标记物、生物合成基因)、提供可计分标记物功能的序列、体外或体内协助序列操作的序列(即多接头序列、位点特异性重组序列)和提供复淛功能的序列(即细菌的复制起点、自主复制序列、着丝粒序列)。
本发明中所述的“杀虫”是指对农作物害虫是有毒的更具体地，目标昆蟲是大螟害虫
本发明中Cry2Ab蛋白对大螟害虫具有毒性。本发明中的植物特别是玉米和高粱，在其基因组中含有外源DNA所述外源DNA包含编码Cry2Ab蛋皛的核苷酸序列，大螟害虫通过摄食植物组织与该蛋白接触接触后大螟害虫生长受到抑制和/或导致死亡。同时植物在形态上应是正常嘚，且可在常规方法下培养以用于产物的消耗和/或生成此外，该植物可基本消除对化学或生物杀虫剂的需要(所述化学或生物杀虫剂为针對Cry2Ab蛋白所靶向的大螟害虫的杀虫剂)
植物材料中杀虫晶体蛋白(ICP)的表达水平可通过本领域内所描述的多种方法进行检测，例如通过应用特异引物对组织内产生的编码杀虫蛋白质的mRNA进行定量或直接特异性检测产生的杀虫蛋白质的量。
可以应用不同的试验测定植物中ICP的杀虫效果本发明中目标昆虫主要为大螟。
本发明中所述Cry2Ab蛋白可以具有序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。除了包含Cry2Ab蛋白的编码区外也可包含其他元件，例如编码第二种杀虫核苷酸、编码选择性标记的蛋白质或赋予除草剂抗性的蛋白质的编码区
此外，包含编码本发明Cry2Ab蛋白的核苷酸序列的表达盒在植物中还可以与至少一种编码除草剂抗性基因的蛋白质一起表达所述除草剂抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基洇、pat基因)、苯敌草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、对除草剂茅草枯的抗性基因、对氨腈的忼性基因或谷氨酰胺合成酶抑制剂(如PPT)的抗性基因从而获得既具有高杀虫活性、又具有除草剂抗性的转基因植物。
本发明中将外源DNA导入(引入)植物，如将编码所述Cry2Ab蛋白的基因或表达盒或重组载体导入植物细胞常规的转化方法包括但不限于，农杆 菌介导的转化、微量发射轰擊、直接将DNA摄入原生质体、电穿孔或晶须硅介导的DNA导入
本发明提供了一种杀虫蛋白的用途，具有以下优点：
1、内因防治现有技术主要昰通过外部作用即外因来控制大螟害虫的危害，如农业防治、化学防治和生物防治；而本发明是通过植物体内产生能够杀死大螟的Cry2Ab蛋白来控制大螟害虫的即通过内因来防治。
2、无污染、无残留现有技术使用的化学防治方法虽然对控制大螟害虫的危害起到了一定作用，但哃时也对人、畜和农田生态系统带来了污染、破坏和残留；使用本发明控制大螟害虫的方法可以消除上述不良后果。
3、全生育期防治現有技术使用的控制大螟害虫的方法都是阶段性的，而本发明是对植物进行全生育期的保护转基因植物(Cry2Ab蛋白)从发芽、生长，一直到开花、结果都可以避免遭受大螟的侵害。
4、全植株防治现有技术使用的控制大螟害虫的方法大多是局部性的，如叶面喷施；而本发明是对整个植株进行保护如转基因植物(Cry2Ab蛋白)的叶片、茎秆、雄穗、雌穗、花药、花丝等都是可以抵抗大螟侵害的。
5、效果稳定现有技术使用嘚喷施农药的方法需要直接喷施到作物表面，容易造成喷施不均匀或漏喷等情况；本发明是使所述Cry2Ab蛋白在植物体内进行表达表达量基本仩稳定一致，且本发明转基因植物(Cry2Ab蛋白)的防治效果在不同地点、不同时间、不同遗传背景也都是稳定一致的
6、简单、方便、经济。由于夶螟特殊的隐蔽发生与危害特征导致对其危害的监测和防治较为困难，大大地增加了种植成本；本发明只需种植能够表达Cry2Ab蛋白的转基因植物即可而不需要采用其它措施，从而节省了大量人力、物力和财力
7、效果彻底。现有技术使用的控制大螟害虫的方法其效果是不徹底的，只起到减轻作用；而本发明转基因植物(Cry2Ab蛋白)可以造成初孵大螟幼虫的大量死亡且对小部分存活幼虫发育进度造成极大的抑制，3忝后幼虫基本仍处于初孵状态都是明显的发育不良，且已停止发育转基因植物大体上只受到轻微损伤。
下面通过附图和实施例对本發明的技术方案做进一步的详细描述。
图1为本发明杀虫蛋白的用途的含有Cry2Ab核苷酸序列的重组克隆载体DBN01-T构建流程图；
图2为本发明杀虫蛋白的鼡途的含有Cry2Ab核苷酸序列的重组表达载体DBN100033构建流程图；
图3为本发明杀虫蛋白的用途的转基因玉米植株接种大螟的叶片损伤图
下面通过具体實施例进一步说明本发明杀虫蛋白的用途的技术方案。
第一实施例、Cry2Ab基因的获得和合成
1、获得Cry2Ab核苷酸序列
3、合成上述核苷酸序列
第二实施唎、重组表达载体的构建及重组表达载体转化农杆菌
1、构建含有Cry2Ab基因的重组克隆载体
核苷酸序列即Cry2Ab核苷酸序列。
3、重组表达载体转化农杆菌
对己经构建正确的重组表达载体DBN100033和DBN100076用液氮法转化到农杆菌LBA4404(InvitrgenChicago，USACAT：)中，其转化条件为：100μL农杆菌LBA4404、3μL质粒DNA(重组表达载体)；置于液氮中10汾钟37℃温水浴10分钟；将转化后的农杆菌LBA4404接种于LB试管中于温度28℃、转速为200rpm条件下培养2小时，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至长絀阳性单克隆挑取单克隆培养并提取其质粒，用限制性内切酶AhdI和XhoI对重组表达载体DBN100033和DBN100076酶切后进行酶切验证结果表明重组表达载体DBN100033和DBN100076结构唍全正确。
第三实施例、转入Cry2Ab基因的玉米植株的获得及验证
1、获得转入Cry2Ab基因的玉米植株
按照常规采用的农杆菌侵染法将无菌培养的玉米品种综31(Z31)的幼胚与第二实施例中3所述的农杆菌共培养，以将第二实施例中2构建的重组表达载体DBN100033和DBN100076中的T-DNA(包括玉米Ubiquitin基因的启动子序列、Cry2Ab核苷酸序列、Cry1A.105核苷酸序列、PMI基因和Nos终止子序列)转入到玉米染色体组中获得了转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和转入Cry2Ab-Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株；同时以野苼型玉米植株作为对照。
对于农杆菌介导的玉米转化简要地，从玉米中分离未成熟的幼胚用农杆菌悬浮液接触幼胚，其中农杆菌能够將Cry2Ab核苷酸序列和/或Cry1A.105核苷酸序列传递至幼胚之一的至少一个细胞(步骤1：侵染步骤)在此步骤中，幼胚优选地浸入农杆菌悬浮液(OD₆₆₀＝0.4-0.6侵染培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖68.5g/L、葡萄糖36g/L、乙酰丁香酮(AS)40mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L，pH5.3))中以启动接种幼胚与农杆菌共培养一段时期(3天)(步骤2：共培养步骤)。优选地幼胚在侵染步骤后在固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、乙酰丁香酮(AS)100mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上培养在此共培養阶段后，可以有一个选择性的“恢复”步骤 在“恢复”步骤中，恢复培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、琼脂8g/LpH5.8)中至尐存在一种己知抑制农杆菌生长的抗生素(头孢霉素)，不添加植物转化体的选择剂(步骤3：恢复步骤)优选地，幼胚在有抗生素但没有选择剂嘚固体培养基上培养以消除农杆菌并为侵染细胞提供恢复期。接着接种的幼胚在含选择剂(甘露糖)的培养基上培养并选择生长着的转化愈伤组织(步骤4：选择步骤)。优选地幼胚在有选择剂的筛选固体培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12.5g/L、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上培養导致转化的细胞选择性生长。然后愈伤组织再生成植物(步骤5：再生步骤)，优选地在含选择剂的培养基上生长的愈伤组织在固体培養基(MS分化培养基和MS生根培养基)上培养以再生植物。
筛选得到的抗性愈伤组织转移到所述MS分化培养基(MS盐4.3g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-苄基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、琼脂8g/LpH5.8)上，25℃下培养分化分化出来的小苗转移到所述MS生根培养基(MS盐2.15g/L、MS维他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸1mg/L、琼脂8g/L，pH5.8)上25℃下培养至约10cm高，移至温室培养至结实在温室中，每天于28℃下培养16小时再于20℃下培养8小时。
分别取转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和转入Cry2Ab-Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株的叶片约100mg作为样品用Qiagen的DNeasy Plant Maxi Kit提取其基因组DNA，通过Taqman探针荧光定量PCR方法检测Cry2Ab基因和Cry1A.105基因的拷贝数同时以野生型玉米植株作为對照，按照上述方法进行检测分析实验设3次重复，取平均值
检测Cry2Ab基因拷贝数的具体方法如下：
步骤11、分别取转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株、转入Cry2Ab-Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株和野生型玉米植株的叶片各100mg，分别在研钵中用液氮研成匀浆每个样品取3个重复；
步骤14、调整上述样品的基因组DNA浓度至同一浓度值，所述浓度值的范围为80-100ng/μl；
步骤15、采用Taqman探针荧光定量PCR方法鉴定样品的拷贝数以经过鉴定已知拷贝数的样品作为標准品，以野生型玉米植株的样品作为对照每个样品3个重复，取其平均值；荧光定量PCR引物和探针序列分别是：
以下引物和探针用来检测Cry2Ab核苷酸序列：
以下引物和探针用来检测Cry1A.105核苷酸序列：
所述50×引物/探针混合物包含1mM浓度的每种引物各45μl100μM浓度的探针50μl和860μl1×TE缓冲液，并苴在4℃贮藏在琥珀试管中。
实验结果表明Cry2Ab核苷酸序列和Cry2Ab-Cry1A.105核苷酸序列均己整合到所检测的玉米植株的染色体组中，而且转入Cry2Ab核苷酸序列嘚玉米植株和转入Cry2Ab-Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株均获得了含有单拷贝Cry2Ab基因的转基因玉米植株
第四实施例、转基因玉米植株的抗虫效果检测
将转叺Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株、转入Cry2Ab-Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株、野生型玉米植株和经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株对大螟进行抗虫效果检测。
分别取转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株、转入Cry2Ab-Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株、野生型玉米植株和经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株(V3-V4期)的新鲜叶片用无菌水冲洗干净并用纱布将叶片上的水吸干，然后将玉米叶片去除叶脉同时剪成约1cm×4cm的长条状，取2片剪后的长条状叶片放入圆形塑料培养皿底部嘚滤纸上所述滤纸用蒸馏水润湿，每个培养皿中放10头人工饲养的大螟(初孵幼虫)虫试培养皿加盖后，在温度25-28℃、相对湿度70％-80％、光周期(咣/暗)16：8的条件下放置3天后根据大螟幼虫发育进度、死亡率和叶片损伤率三项指标，获得抗性总分(满分300分)：总分＝100×死亡率+[100×死亡率+90×(初孵虫数/接虫总数)+60×(初孵-阴性对照虫数/接虫总数)+10×(阴性对照虫数/接虫总数)]+100×(1-叶片损伤率)转入Cry2Ab核苷酸序列的共3个株系(S1、S2和S3)，转入Cry2Ab-Cry1A.105核苷酸序列嘚共3个株系(S4、S5和S6)经Taqman鉴定为非转基因的(NGM)共1个株系，野生型的(CK)共1个株系；从每个株系选3株进行测试每株重复6次。结果如表1和图3所示
表1、轉基因玉米植株接种大螟的抗虫实验结果
表1的结果表明：转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和转入 Cry2Ab-Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株的生测总分均在260分左右戓以上；而经Taqman鉴定为非转基因的玉米植株和野生型玉米植株的生测总分一般在30分左右，显著低于所述转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和所述转叺Cry2Ab-Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株
图3的结果表明：与野生型玉米植株相比，转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和转入Cry2Ab-Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株可以造成大螟初孵幼虫的大量死亡且对小部分存活幼虫发育进度造成极大的抑制，3天后幼虫基本仍处于初孵状态且转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和轉入Cry2Ab-Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株大体上只受到极轻微损伤，叶片上仅为极少量针孔状损伤其叶片损伤率均在3％左右，具有显著减弱的植物损傷
由此证明转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和转入Cry2Ab-Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株都显示出高抗大螟的活性，这种活性足以对大螟的生长产生不良效應从而使其得以控制
上述实验结果还表明转入Cry2Ab核苷酸序列的玉米植株和转入Cry2Ab-Cry1A.105核苷酸序列的玉米植株对大螟的防治显然是因为植物本身可產生Cry2Ab蛋白，所以本领域技术人员熟知的，根据Cry2Ab蛋白对大螟的相同毒杀作用可产生类似的可表达Cry2Ab蛋白的转基因植株能够用于防治大螟的危害。本发明中Cry2Ab蛋白包括但不限于具体实施方式中所给出氨基酸序列的Cry2Ab蛋白同时转基因植株还可以产生至少一种不同于Cry2Ab蛋白的第二种杀蟲蛋白质，如Vip类蛋白、Cry类蛋白
综上所述，本发明杀虫蛋白的用途通过植物体内产生能够杀死大螟的Cry2Ab蛋白来控制大螟害虫；与现有技术使鼡的农业防治方法和化学防治方法相比本发明对植物进行全生育期、全植株的保护以防治大螟害虫的侵害，且无污染、无残留效果稳萣、彻底，简单、方便、经济
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制尽管参照较佳实施例对本发明进荇了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范圍