盘点检验丹参原料pcr所用试剂的仪器和试剂

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-06-09 21:30 标签： pcr所用试剂

丹参脱毒种苗RT-PCR快速检测研究 吴志奣1谢晓亮‘，温春秀彭卫欣。 (河北省农林科学院经济作物研究所河北石家庄050051) 摘要黄瓜花叶病毒(CMV)是引起丹参退化的主要病原，我们将其命名为CMV丹参株系 (CMV-DS)根据其外壳蛋白(CP)基因前后保守区序列，设计合成了一对CMVCP基因特异 引物采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法扩增了810bp的含全长外壳蛋白(CP)基因 的cDNA序列，与理论设计的扩增片段大小一致．本试验建立了快速、灵敏、简便的CMV检 测方法并进行了脱毒种苗的检测，获得了┅批脱除CMV的丹参无病毒种苗为丹参脱毒种 苗的快速繁育推广奠定了基础． 关键词 丹参脱毒苗； 黄瓜花叶病毒； 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) railtiorrhiza 丹參(Salvia Bge．)为唇形科(1abiataeJuss)鼠尾草属(国．fvia￡) 多年生草本药用植物，为常用大宗中药材主治心血管系统疾病。具有活血祛瘀、消肿止痛、 养血安神的功能川．近年来研究表明丹参能有效地抑制体外肿瘤细胞的增殖，能高效拮抗 乙肝病毒核心抗原(HBeAg)有较好的抗艾滋病毒(HIV)作用12’。我国药用丼参资源丰富 主要看根部颜色，色红着可入药一系列对重大疾病有疗效的丹参新约的研制开发，致使丹 参用量不断增加种植面积不斷扩大，已成为国际市场重要的药材之一．近年来河北安国中 药材基地发现丹参上一种退化病十分严重由于长期的无性繁殖，病害积累┿分严重导致 该病田问发病率很高，有的田块高达60％"-80％表现为花叶、斑驳、卷叶、黄化、矮化 等典型病毒病症状，感病植株根系细小药用成分含量降低，严重影响了丹参的产量和品质 我们通过系统的生物学、电镜观察、血清学方法和基冈序列测定等方法对病原进行叻研究， mosaic 发现黄瓜花叶病毒(CucumbervirusCMv)与该病害密切相关，并将病害命名为黄 瓜花叶病毒丹参株系(CMV-DS)D劓为此我们采用茎尖培养结合热处理对丹参进荇了脱病 毒技术研究。获得了一批经过脱毒处理的种苗为了确定这些种笛是否真正脱除了病毒，有 必要进行CMV检测．为其快速繁育和推广提供技术支持和依据 建立快速、灵敏和特异的病毒检测方法是无病毒种苗生产的关键环。1了目前CMV的检测 的主要方法为指示植物法和酶聯免疫吸附测定(ELISA)法等，但是指示植物法不太可靠 也难以区分病毒种类，所需的时间长ELISA虽然提高了CMV检测的灵敏度和特异性。但是 受病毒忼血清条件的限制因此限制了其应用。随着分子生物学检测技术的发展应j{j特别 chain 是聚合酶链式反应(Polymerasereaction，PCR)已在植物病毒的检测上得到迅速推 廣应采用PCR法可检测出植物组织中含麓极低的病毒RNA，由丁．PCR检测植物病毒具有快 速、灵敏、准确、简便等优点被认为是病毒检测技术的┅次革命。本文报道了应用PCR 法检测C州的研究结果 l材料与方法 1．1材料 1．1．1供试材料丹参田间感病株采自安国中药材种植基地。表现为花叶、斑驳和褪率等 症状现保存于河北省农林科学院药用植物研究中心种质资源圃。待检测的丹参种苗为我中 心进行热处理和茎尖培养获得嘚脱病毒种苗 Pfu DNA聚合酶、dNTP等购自鼎国生物技术有限 M-MLV反转录酶购自Progmega公司，Taq 公司抗生素氮苄青霉素及X-gal、IPTG等购自华美生物工程公司。引物由北京奏百盛公司 合成其它各种化学试剂购自北京化学试剂公司。 1．2方法 1．2．1植物总RNA的提取取丹参叶片O．59迅速在液氮中研磨成粉末。加入等体积的LiCl Tri 提取缓冲液(50mmol／L0．596sDS，5mmol／LEDTAlOOmmol／LS·Cl，1％B一疏基乙醇)研 磨成匀浆组织，加入等体积的水饱和酚室温悬浮30min后移入1．5mL微量离心管中， 12000r／min4℃离心lOmin(以下同)，上清转移至微蟹

丹参脱毒种苗RT-PCR快速检测研究 吴志奣1谢晓亮‘，温春秀彭卫欣。 (河北省农林科学院经济作物研究所河北石家庄050051) 摘要黄瓜花叶病毒(CMV)是引起丹参退化的主要病原，我们将其命名为CMV丹参株系 (CMV-DS)根据其外壳蛋白(CP)基因前后保守区序列，设计合成了一对CMVCP基因特异 引物采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法扩增了810bp的含全长外壳蛋白(CP)基因 的cDNA序列，与理论设计的扩增片段大小一致．本试验建立了快速、灵敏、简便的CMV检 测方法并进行了脱毒种苗的检测，获得了┅批脱除CMV的丹参无病毒种苗为丹参脱毒种 苗的快速繁育推广奠定了基础． 关键词 丹参脱毒苗； 黄瓜花叶病毒； 反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) railtiorrhiza 丹參(Salvia Bge．)为唇形科(1abiataeJuss)鼠尾草属(国．fvia￡) 多年生草本药用植物，为常用大宗中药材主治心血管系统疾病。具有活血祛瘀、消肿止痛、 养血安神的功能川．近年来研究表明丹参能有效地抑制体外肿瘤细胞的增殖，能高效拮抗 乙肝病毒核心抗原(HBeAg)有较好的抗艾滋病毒(HIV)作用12’。我国药用丼参资源丰富 主要看根部颜色，色红着可入药一系列对重大疾病有疗效的丹参新约的研制开发，致使丹 参用量不断增加种植面积不斷扩大，已成为国际市场重要的药材之一．近年来河北安国中 药材基地发现丹参上一种退化病十分严重由于长期的无性繁殖，病害积累┿分严重导致 该病田问发病率很高，有的田块高达60％"-80％表现为花叶、斑驳、卷叶、黄化、矮化 等典型病毒病症状，感病植株根系细小药用成分含量降低，严重影响了丹参的产量和品质 我们通过系统的生物学、电镜观察、血清学方法和基冈序列测定等方法对病原进行叻研究， mosaic 发现黄瓜花叶病毒(CucumbervirusCMv)与该病害密切相关，并将病害命名为黄 瓜花叶病毒丹参株系(CMV-DS)D劓为此我们采用茎尖培养结合热处理对丹参进荇了脱病 毒技术研究。获得了一批经过脱毒处理的种苗为了确定这些种笛是否真正脱除了病毒，有 必要进行CMV检测．为其快速繁育和推广提供技术支持和依据 建立快速、灵敏和特异的病毒检测方法是无病毒种苗生产的关键环。1了目前CMV的检测 的主要方法为指示植物法和酶聯免疫吸附测定(ELISA)法等，但是指示植物法不太可靠 也难以区分病毒种类，所需的时间长ELISA虽然提高了CMV检测的灵敏度和特异性。但是 受病毒忼血清条件的限制因此限制了其应用。随着分子生物学检测技术的发展应j{j特别 chain 是聚合酶链式反应(Polymerasereaction，PCR)已在植物病毒的检测上得到迅速推 廣应采用PCR法可检测出植物组织中含麓极低的病毒RNA，由丁．PCR检测植物病毒具有快 速、灵敏、准确、简便等优点被认为是病毒检测技术的┅次革命。本文报道了应用PCR 法检测C州的研究结果 l材料与方法 1．1材料 1．1．1供试材料丹参田间感病株采自安国中药材种植基地。表现为花叶、斑驳和褪率等 症状现保存于河北省农林科学院药用植物研究中心种质资源圃。待检测的丹参种苗为我中 心进行热处理和茎尖培养获得嘚脱病毒种苗 Pfu DNA聚合酶、dNTP等购自鼎国生物技术有限 M-MLV反转录酶购自Progmega公司，Taq 公司抗生素氮苄青霉素及X-gal、IPTG等购自华美生物工程公司。引物由北京奏百盛公司 合成其它各种化学试剂购自北京化学试剂公司。 1．2方法 1．2．1植物总RNA的提取取丹参叶片O．59迅速在液氮中研磨成粉末。加入等体积的LiCl Tri 提取缓冲液(50mmol／L0．596sDS，5mmol／LEDTAlOOmmol／LS·Cl，1％B一疏基乙醇)研 磨成匀浆组织，加入等体积的水饱和酚室温悬浮30min后移入1．5mL微量离心管中， 12000r／min4℃离心lOmin(以下同)，上清转移至微蟹

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