心肌特异性高表达Hsp27对阿霉素所致小鼠心力衰竭的保护作用--《第七届海峡两岸心血管科学研讨会论文集》2009年
心肌特异性高表达Hsp27对阿霉素所致小鼠心力衰竭的保护作用
【摘要】：正背景:氧化应激及其引起的心肌细胞凋亡在充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF)发生发展中有十分重要的作用。我们曾报道热休克蛋白27(Heat shock protein 27,Hsp27)对体外培养大鼠心肌细胞的氧化应激性损伤、细胞凋亡有显著抑制作用,但还不清楚Hsp27能否通过抑制氧化应激和细胞凋亡而改善心力衰竭。目的:阐明Hsp27高表达对阿霉素所致心力衰竭的影响。方法和结果心肌特异性高表达Hsp27转基因鼠(TG)和一窝所生野生型对照小鼠(WT)被腹腔注射阿霉素(25 mg/kg,IP)诱导CHF。5 d后与WT比较,TG鼠心功能不全程度显著被减轻、生存率显著提高、心脏重量丢失也显著被抑制。同时,阿霉素诱导的心肌组织活性氧自由基生成、蛋白质羰基化修饰、心肌细胞凋亡、线粒体形态学异常改变在WT鼠中非常明显,但与之相比,这些改变在TG鼠中得到显著改善。不仅如此,与WT比较,TG鼠心肌组织中热休克蛋白70和热休克蛋白32表达水平均显著上调。结论:上述结果提示,Hsp27可增加小鼠对阿霉素所致充血性心力衰竭的耐受性。
【作者单位】：
【分类号】：R541.6【正文快照】：
背景:氧化应激及其引起的心肌细胞凋亡在充血性心力衰竭(congestive heart failure，cHF)发生发展中有十分重要的作用。我们曾报道热休克蛋白27(Heat shock protein27，Hs夕7)对体外培养大鼠心肌细胞的氧化应激性损伤、细胞凋亡有显著抑制作用，但还不清楚Hsp27能否通过抑制
欢迎：、、)
支持CAJ、PDF文件格式，仅支持PDF格式
【相似文献】
中国期刊全文数据库
洪四名;陈珂;李元海;;[J];中医药临床杂志;2011年10期
刘莉,张小进,姜苏蓉,高翔,丁国宪,程蕴琳;[J];中华老年医学杂志;2004年12期
;[J];红领巾(A版);2011年10期
伊冰;[J];国外医学.卫生学分册;1978年04期
;[J];哈尔滨医科大学学报;1986年02期
陈锦荣;[J];国际生物制品学杂志;1990年02期
张雪岩,张劲松,张涤;[J];眼科研究;2005年02期
王万银;[J];国外医学.生理.病理科学与临床分册;2001年06期
俞永旦;[J];国外医学.卫生学分册;1975年04期
倪晓;[J];国外医学.皮肤性病学分册;1995年05期
中国重要会议论文全文数据库
郑奕;;[A];中国环境科学学会2009年学术年会论文集（第四卷）[C];2009年
陈勤;李磊珂;;[A];中华中医药学会中药实验药理分会第六届学术会议论文汇编[C];2006年
石进峰;张博爱;贾延劼;;[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年
刘学文;胥向红;杨锐;贾玉洁;;[A];中华医学会第十三次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2010年
朱元贵;陈晓春;陈丽敏;方芳;周宜灿;赵朝辉;;[A];第四次全国中西医结合中青年学术研讨会论文集[C];2002年
冯国清;宋丽杰;付润芳;王振基;;[A];第八届全国生化药理学术讨论会暨第七届Servier奖颁奖大会会议摘要集[C];2003年
唐春红;李鑫;;[A];首届中国西部营养与健康、亚健康学术会议论文集[C];2005年
陈勤;李磊珂;;[A];2006第六届中国药学会学术年会论文集[C];2006年
许东航;胡巧红;梁文权;袁银松;;[A];浙江省药剂学术会议论文集[C];2006年
梁智星;杨志刚;梁法禹;杨新卫;;[A];中华医学会第七次全国胸心血管外科学术会议暨2007中华医学会胸心血管外科青年医师论坛论文集心血管外科分册[C];2007年
中国重要报纸全文数据库
张超群；左秀花；范晓莉;[N];中国医药报;2005年
保健时报实习记者
王朝;[N];保健时报;2007年
衣晓峰;[N];中国医药报;2008年
;[N];中国中医药报;2005年
杨嘉珍?欧阳作宪;[N];中国中医药报;2008年
张中桥;[N];中国中医药报;2006年
;[N];中国中医药报;2007年
吴一福;[N];中国医药报;2006年
梅琳;[N];医药养生保健报;2008年
赵倩;[N];中国旅游报;2000年
中国博士学位论文全文数据库
唐正国;[D];中南大学;2010年
董文鹏;[D];第四军医大学;2011年
张爽;[D];吉林大学;2011年
杨丽娟;[D];中南大学;2012年
付云锐;[D];重庆医科大学;2012年
杨玉波;[D];吉林大学;2003年
张淑敏;[D];中国海洋大学;2011年
刘现立;[D];吉林大学;2006年
黄仁彬;[D];广西医科大学;2010年
任舒文;[D];中国海洋大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库
蔡婕;[D];南京师范大学;2011年
钟孝正;[D];南京医科大学;2010年
赖晓晶;[D];华中科技大学;2009年
赖晓晶;[D];华中科技大学;2009年
宁爱丽;[D];南华大学;2012年
田卓华;[D];兰州大学;2010年
侯聪敏;[D];河北农业大学;2011年
茅东升;[D];浙江工业大学;2011年
吕红彬;[D];昆明医学院;2003年
李静;[D];河北大学;2011年
&快捷付款方式
&订购知网充值卡
400-819-9993探讨MicroＲNA－7基因敲减小鼠模型的鉴定
　　微小RNA - 7( microRNA - 7，miR - 7) 是新近研究报道的miRNA 家族成员之一，定位于第15 号染色体，已有大量文献报道其在细胞和组织器官发育以及多种肿瘤的发生和生长中发挥着重要调控作用。如Liu 等研究发现，miR - 7 可靶向作用于RAF1 蛋白，抑制血管内皮细胞的增殖; Meza- Sosa 等研究发现，miR - 7 通过抑制肿瘤蛋白KLF4 的表达，进而促进上皮细胞的转化; Pollock等研究发现，miR - 7 可通过调控P53 信号途径抑制大脑皮层的发育。由于miR - 7 在不同细胞以及组织器官中的靶分子不同，因此其调控机体细胞发育和组织器官功能的确切机制仍待大量研究阐明。我们课题组在前期实验中利用miRNAsponge( 海绵体) 技术原理，成功构建了miR - 7 的真核表达载体pEGFP - C2 - miR - 7 - sponge，其可以有效下调人肺癌细胞中miR - 7 成熟体的表达，并利用此载体构建了miR - 7 基因敲减小鼠模型。本研究中，我们常规剪取了miR - 7 基因敲减小鼠的脚趾和尾巴，分别提取其基因组DNA 和总RNA，利用PCR 技术扩增目的基因&增强型绿色荧光蛋白( enhanced green fluorescent protein，EGFP)片段; 利用Real - time 探针法检测两组小鼠7个不同组织器官中miR - 7 成熟体的相对表达水平，以鉴定miR - 7 基因敲减小鼠模型; 并初步观察模型小鼠中心脏、肺脏等组织器官的形态学结构改变，以期为后续深入研究miR - 7 分子在不同细胞以及组织器官发育中的生物学功能提供前期的实验基础。
　　1 材料与方法
　　1. 1 材料
　　6 ～ 8 周SPF 级FVB 小鼠和第5 代miR - 7KD 的FVB 小鼠[广州赛业生物科技有限公司，许可证号: SYXK( 苏2010 - 0003) ]; PremixEx TaqVersion2. 0、RNAisoTM Plus、2xSYBR ( r )PremixExTaq TM( TaKaRa) ; T RevertAid First StrandcDNA Synthesis Kit( Fermentas) ; miR - 7 的Real -time PCR 探针( MBI 公司) ; IANamp Genomic DNAKit( 天根公司) ; HE 染色液( 泰康医疗) ; 分析纯级三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇( 重庆川东化工) ;C1000TMThermal cycler 荧光定量PCR 仪、S1000TMThermal cycler PCR 仪( Bio - Rad 公司) ; LEGENDMICRO21R 型低温离心机( Thermo) 。
　　1. 2 方法
　　1. 2. 1 小鼠脚趾基因组DNA 和尾巴总RNA 的提取常规剪取7 只miR - 7KD 小鼠的脚趾和尾巴，分别用来提取其基因组DNA 和总RNA; 剪取1 只WT 小鼠的尾巴，提取其总RNA。基因组DNA 的提取方法和反应体系均按照TIANamp GenomicDNA Kit 试剂盒说明书操作。RNA 提取操作如下:每50 ～ 100 mg 组织中加入RNAisoPlus 1mL，匀浆器研磨，每毫升匀浆液加入200 &L 三氯甲烷，剧烈震荡15 s，室温静置5 min， 10 000 rmp 低温离心10min，将离心后得到的上清液移入新的离心管中，随后加入500 &L 异丙醇，室温静置10 min，12 000rmp 低温离心10 min，可见管底RNA 絮状沉淀，弃上清， 75%乙醇1mL 洗涤RNA 沉淀，7300 rpm 低温离心5 min，弃上清，干燥RNA 沉淀，加入60&LRNAse free water 溶解该RNA 沉淀。
　　1. 2. 2 小鼠7 个不同组织器官总RNA 提取常规解剖获取WT 和miR -7KD 小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺和胰腺各70mg，用来提取总RNA，提取操作方法见1. 2. 1; 同时，两组小鼠心脏、肺脏、结肠分别置于4%甲醛中，为HE 染色切片备用。
　　1. 2. 3 总RNA 逆转录成cDNA 内参基因GAPDH按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书操作，RNA 7. 5 &L，oligo ( dT) 18primer 1 &L，DEPC treated water 3. 5 &L，65 ℃5 min，立即取出冰浴2 min 以上; 5x reaction buffer4 &L，RibolockRnase inhibiter 1 &L，Revert Aid ReverseTranscriptase 1 &L，10 mM dNTP mix 2 &L，42 ℃1 h，70 ℃10 min，4 ℃保存。miR - 7 逆转录反应体系及条件: 10 mM dNTP mix 1. 5 &L，RevertAid Reverse Transcriptase 0. 25 &L，5 & reaction buffer3 &L，RibolockRnase inhibiter 0. 19 &L，RNA5 &L，5 & Abion Primer 3 &L，DEPC treated water2. 06 &L，总体系为15 &L。反应条件: 16 ℃ 30min， 42 ℃30 min， 85 ℃30 min，降至4 ℃。
　　1. 2. 4 检测两组小鼠7 个不同组织器官中miR -7 成熟体的相对表达水平利用Real - time PCR技术对组织器官中miR - 7 表达水平进行检测和比较分析。内参基因GAPDH 的上游引物为: 5&-GAGCCAAACGGGTCATCATCT - 3&，下游引物为:5&- GAGGGGCCATCCACAGTCTT - 3&。内参基因Real - Time PCR 反应体系: 2 &SYBR( r) PremixExTaq TM 10 &L，DEPC treated water7 &L，cDNA 2 &L，PCR Forward Primer( 10 M)0. 5 &L，PCR Reverse Primer( 10 M) 0. 5 &L，总体系为20 &L。反应条件: 95 ℃ 预变性30 s，95 ℃&583&6 期朱顺飞等&MicroRNA - 7 基因敲减小鼠模型的鉴定15s，60 ℃ 60s，40 个循环，获取荧光信号温度为84℃，以排除引物二聚体的干扰; miR - 7 的上游引物为: 5&- CACTCCAGCTGG TCGTC GTGAGTAAT -3&，下游引物为: 5&- TGGTGTCGTGGAGGAGTC -3&。miR - 7 Real - Time PCR 反应体系: 2 & SYBR( r) PremixExTaq TM 10 &L，cDNA 1 &L，DEPCtreated water 8 &L，Taqman miR - 7 Probe 1 &L，总体系为20 &L。反应条件: 95 ℃预变性30 s， 95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 个循环，获取荧光信号温度为60 ℃。随后对扩增产物在2% 的琼脂糖凝胶上进行电泳分析，确定扩增产物的特异性和灵敏度。miR - 7 的表达量以GAPDH 为内参，采取2 -△△Ct 方法计算。
　　1. 2. 5 HE 染色观察小鼠心脏、肺脏以及结肠的形态学结构将备用的组织器官做切片并进行HE 染色，在显微镜下分别观察心脏、肺脏以及结肠的形态学结构。
　　1. 2. 6 数据分析实验数据采用均数& 标准差( x& s) 表示。所有实验均重复3 次以上，数据采用SPSS 18. 0 进行统计分析，两组间均数比较采用t检验，以P & 0. 05 为差异具有统计学意义。
　　2 结果
　　2. 1 miR - 7KD 小鼠DNA 中EGFP 表达的检测
　　分别提取7 只miR - 7KD 小鼠脚趾的基因组DNA， 0. 8%琼脂糖凝胶上进行水平板微型电泳显示其完整性好。随后以基因组DNA 为模板，用pEGFP - C2 - miR - 7 - spong 真核表达载体特异性引物PCR 扩增目的片段EGFP，2. 5% 琼脂糖凝胶电泳，可观察到约440bp 大小的目的条带，这提示7 只miR - 7KD 小鼠均为转基因小鼠。
　　2. 2 miR - 7 KD 小鼠鼠尾EGFP 表达的检测
　　分别常规剪取两组小鼠的鼠尾，提取其总RNA，逆转录成cDNA，同样利用特异性引物PCR技术扩增目的片段，2. 5%琼脂糖凝胶电泳后显示，除WT 小鼠外，miR - 7KD 的7 只小鼠均可观察到约440bp 大小的目的条带，这提示pEGFP- C2 - miR - 7 - spong 真核表达载体能够在miR - 7KD 小鼠体内稳定表达。
　　2. 3 两组小鼠7 个不同组织器官总RNA 的纯度鉴定
　　分别提取WT 小鼠和miR - 7KD 小鼠的心脏、肝脏和脾脏等7 个不同组织器官的总RNA，0. 8%琼脂糖凝胶电泳，结果显示提取的RNA 质量完好，无明显的降解，测得OD260 /280 值均为1. 86 ～ 2. 03。
　　2. 4 两组小鼠7 个不同组织器官miR -7 成熟体相对表达水平检测
　　我们进一步利用Real - time PCR探针法分别检测了WT 小鼠和miR - 7KD 小鼠7 个不同组织器官中miR - 7 成熟体的相对表达水平。结果显示，miR - 7 成熟体在miR - 7KD 小鼠心脏、肝脏和脾脏等组织器官中的表达水平较WT 小鼠均显著下调，具有统计学意义。
　　2. 5 miR - 7KD 小鼠心脏、肺脏以及结肠形态学结构改变WT 小鼠和miR - 7KD 小鼠心脏、肺脏以及结肠HE 染色。结果显示，miR -7KD 小鼠中心肌细胞发生明显坏死，数量减少，伴间质大片出血; 肺脏间质小血管充血伴炎性细胞浸润，部分区域可见肺泡腔塌陷; 结肠黏膜显著变薄，腺体数量减少、萎缩。
　　目前，随着对miRNA 研究的不断深入，已知miRNA 的数量与日俱增。不过，大部分miRNA 的生物学功能仍然未知。在基因功能研究中，最有效的方法是利用基因敲出/敲减或过表达技术来改变特定基因的表达，进而分析其生物学功能。因此，对于miRNAs 分子来说，基因敲出/敲减或过表达技术也是深入探讨其生物学功能的重要手段之一。已有的研究显示，与miRNA 互补的反义寡核苷酸可作为mRNA 结合的竞争性抑制剂来研究特定miRNAs 分子的生物学功能，但是此技术抑制效能时间短，只能做短期分析。miRNA 海绵体技术则是目前使用最多的高效miRNA 抑制剂，不仅其设计简单，且抑制效力和持续时间均显著优于反义寡核苷酸。因此，利用此技术使得构建特定miRNA 分子敲出/敲减的转基因小鼠模型变得相对容易。本研究中，我们在之前应用miRNA 海绵体技术成功构建的miR - 7 真核表达载体pEGFP- C2 - miR - 7 - sponge 基础之上，进一步鉴定基于该载体构建的miR - 7 基因敲减小鼠模型。PCR 结果显示，第五代模型小鼠脚趾基因组DNA和鼠尾总RNA 中仍能扩增出目的片段EGFP。这提示，我们利用pEGFP - C2 - miR - 7 - spong 载体不仅成功构建了miR - 7 基因敲减小鼠模型，且pEGFP - C2 - miR - 7 - sponge 真核表达载体能够在小鼠基因组中稳定遗传表达。我们随后利用RT- PCR 技术检测了miR - 7KD 小鼠较WT 小鼠心脏、肝脏以及脾脏等7 个重要组织器官中miR - 7成熟体的相对表达水平。结果发现，miR - 7KD 小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺以及胰腺的miR - 7 成熟体的表达水平较WT 小鼠均显著下调，这表明miRNA sponge 技术可在体内长效抑制miRNA 的表达。
　　新近研究显示，miR - 7 与肺癌、乳腺癌、肝癌以及胰腺癌等多种肿瘤的发生、发展密切相关。如Okuda 等研究发现，miR - 7 可通过对KLF4信号途径的调控作用抑制乳腺癌脑转移; Ma等研究还发现，在肝癌细胞中，低表达miR - 7可上调Cullin 5 蛋白的表达，进而促进癌细胞由G1期向S 期的转化; Nieto 等[13]研究则显示，miR- 7 在胰腺癌中是显著低表达的，上调其表达可显著抑制胰腺癌细胞的生长和转移侵袭能力。类似地，我们课题组在前期研究中也发现，过表达miR - 7 可显著抑制CGGBP1 蛋白的表达，进而抑制肺癌细胞的体内生长。本研究中，我们进一步发现miR - 7 基因敲减小鼠模型中心脏、肺脏以及结肠均较WT 小鼠形态学结构发生了明显的病理性改变。这些研究结果提示，miR - 7 作为miRNA 家族的重要分子之一，不仅在组织器官肿瘤发生发展中发挥重要作用，而且在机体组织器官的发育中也具有重要的调控功能。因此，后续进一步利用此模型深入探讨miR - 7 调节这些组织器官发育的具体调控机制，不仅对于最终阐明miR - 7 的生物学功能，而且对于探讨特定组织器官的发育学也具有重要意义。总之，本研究中我们发现利用miRNA - sponge技术原理构建的miR - 7 基因敲减小鼠模型中，7个重要组织器官miR - 7 成熟体的表达水平均较WT 小鼠显著下调，这为后续深入研究miR - 7 在组织器官发育中的作用及其相关机制提供了重要的前期实验基础。
我国民间美术的发展历程已经延续了数千年之久，民间美术属于民间传统文化的重要构成部分之一，并备受社会各界的广泛支...
一、引言 公共艺术课程是为培养社会主义现代化建设所需要的高素质人才而设立的限定性选修课程，对于提高审美素养、培...
近年来，以二、三本院校为主的应用型本科教育普遍重视实践教学，强化应用型人才培养，将实践教学作为培养学生实践能力...
散文的定义可从广义和狭义两方面来说，广义上讲，散文是一种与诗歌相对的文学体裁 ;从狭义上来说，是一种与诗歌、小说...
0 前言 对于 CI 设计，有些人还不熟悉，事实上CI对企业品牌的塑造起到积极的推动作用。CI作为企业形象战略，有其不可低估...
色彩在艺术家的手中，不仅是单纯的描绘与填充工具，而是表达艺术家内心世界的重要表现形式。这种心理的表达描述着人们...
摘要 作为法国最具有争议的女作家玛格丽特杜拉斯，无法归类是杜拉斯最为明亮的一个标签，这一标签闪现出了杜拉斯的边...
一、 少数民族宗教艺术的美学表现 (一) 少数民族宗教建筑的美学形式少数民族宗教建筑艺术的美学表现指宗教建筑的形体视...
在我国恢弘、悠久的民族文化中，民间美术以其多姿多彩、种类繁多而占有重要的位置，是一切美术形式的源泉。中国民间美...
极简主义将传统艺术带进了死胡同，艺术家们开始探索艺术新的发展道路，干脆摈弃传统架上绘画的创作材料，直接以身边的...
美术专业教育的重点内容之一即为美术技能。而师范类的美术教育更要突出师范性，培养学生教书育人的能力。全方位兼容技...
师范类美术专业教学是一个独特而又新颖的专业教学。它不同于音乐、 舞蹈等专业教学;音乐和舞蹈的教学伴随着音乐的开始...实验动物心肌肥厚模型_图文_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
实验动物心肌肥厚模型
阅读已结束，下载文档到电脑
想免费下载更多文档？
定制HR最喜欢的简历
下载文档到电脑，方便使用
还剩3页未读，继续阅读
定制HR最喜欢的简历
你可能喜欢君，已阅读到文档的结尾了呢~~
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
心肌锚定重复序列蛋白基因心脏特异敲除小鼠模型构建与鉴定
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='/DocinViewer-4.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口