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【求助】蛋白提取时,TCA和丙酮的作用是什么?
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丙酮好象还可以破坏蛋白表面的水化膜,降低蛋白质水溶液的介电常数,从而沉淀蛋白． 　　　　　　　　　　莫非只是用来抽提tca　　 　　　　　　　　　　　　疑惑ing
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TCA-丙酮沉淀法蛋白提取
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你可能喜欢一种稻瘟病菌菌丝体全蛋白双向电泳样品的制备方法
本发明公开了一种稻瘟病菌菌丝体全蛋白双向电泳样品的制备方法，选取TCA-丙酮法提取稻瘟病菌菌丝体蛋白，通过使用含DTT的预冷丙酮溶液漂洗沉淀并用4倍体积的预冷丙酮溶液沉淀溶于裂解液的样品蛋白，利用丙酮在水化液中对蛋白质样品进行二次沉淀，及加大TCA-丙酮试剂用量、延长处理时间，有效去除蛋白质样品中的杂质，获得纯净的样品蛋白沉淀，最后加入裂解液制备出适合双向电泳的高质量样品。本发明制备氮胁迫条件下稻瘟病菌菌丝体蛋白双向电泳样品的方法快速可靠、简单易行，可获得较高质量且重复性较好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，具有较大的实际应用价值。
专利类型：
申请（专利）号：
申请日期：
公开(公告)日：
公开(公告)号：
主分类号：
G01N1/28,G01N1/00,G,G01,G01N,G01N1
G01N1/28,G01N1/00,G01N1/30,G01N1/00,G,G01,G01N,G01N1,G01N1/28,G01N1/00,G01N1/30,G01N1/00
申请（专利权）人：
云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所
发明（设计）人：
周晓罡,余萍,姚春馨,董超,丁玉梅,陶南
主申请人地址：
650223 云南省昆明市五华区莲华办事处学云路9号
专利代理机构：
国别省市代码：
一种稻瘟病菌菌丝体全蛋白双向电泳样品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将稻瘟病菌菌株由试管转接到固体培养基上，所述固体培养基为葡萄糖15.0g.L?1，酵母粉5.0g.L?1，琼脂粉12.0g.L?1，H2O1.0L，28℃暗培养7d，菌落直径长达4?6cm时，切取大小为0.5cm×0.5cm的菌丝3?5块，转接到50mL稻瘟病菌全营养液体培养基上，其成分为NaNO36g，KCl0.52g，MgSO4.7H2O0.52g，KH2PO41.52g，葡萄糖10g，微量元素2mL，蛋白胨2g，酵母粉1g，酪蛋白氨基酸1g，H2O1.0L，上述微量元素的配方为ZnSO4.7H2O2.20g，H3BO310.00g，MnCl2.4H2O0.50g，FeSO4.7H2O0.50g，CoCl2.6H2O0.16g，CuSO4.5H2O0.16g，(NH4)6MoO24?4H2O0.11g，Na2?EDTA5g，用超纯水定容至1000mL，28℃下150r.min?1摇床振荡培养3d，菌丝经双层纱布过滤后用无菌水清洗除去培养基；2)称取5g的湿菌丝转接到新配制的含KCl0.52g，MgSO4.7H2O0.52g，KH2PO41.52g，葡萄糖10g，步骤1)所述微量元素2mL，H2O1.0L的氮饥饿液体培养基或者全营养液体培养基，28℃下150r.min?1摇床振荡培养48h，将培养物用纱布进行过滤，菌丝经双层纱布过滤后用无菌水清洗除去培养基，干净的菌丝用抽滤瓶将水分抽干，将干燥后菌丝置于?80℃冰箱中保存备用；3)称取1g的菌丝体，用研钵在液氮中研磨后将其悬浮于30ml含0.1％DTT、1％PMSF和10％TCA的丙酮溶液中，?20℃过夜，低温高速离心收集沉淀，向沉淀中加入30ml含0.1％DTT的80％丙酮水溶液，清洗沉淀，?20℃静置2h，4℃下15000r.min?1离心20min，弃上清，重复3次，真空干燥蛋白沉淀30min，至丙酮完全挥发；4)将步骤3)中制得的蛋白沉淀加入1ml样品水化液，室温下充分溶解，离心取上清液，向此上清液中加入4倍体积预冷的含0.1％DTT的丙酮溶液，混匀，?20℃静置2h，4℃下15000r.min?1离心20min，收集沉淀；5)将步骤4)中制得的蛋白沉淀加入300ul样品水化液，室温下充分溶解，离心取上清液，此上清液即为氮胁迫条件下稻瘟病菌菌丝体蛋白双向电泳样品，所述水化液组成为样品水化液为7mol.L?1尿素、2mol.L?1硫脲、4％CHAPS、65mmol.L?1DTT、0.3％IPGbuffer；6)蛋白质定量：采用Bradford法测定其蛋白浓度；7)第一向等点聚焦电泳：按上样量500ug，上样体积500ul，对已定量好的蛋白样品进行稀释，采用pH4?7，24cm?IPG胶条，被动水化，室温泡涨法对IPG胶条进行泡涨，室温下水平静置13h后将胶条取出，将胶条放入聚焦盘进行等点聚焦；8)胶条平衡：将聚焦好后的固相pH梯度IPG胶条进行平衡I、II，每次平衡时间为20min，平衡缓冲液配制如下：胶条平衡缓冲液母液：尿素6M，50mmol／L的1.5M?pH8.8的Tris?HCl，30％甘油，2％SDS，溶剂为水；胶条平衡缓冲液I：每10ml胶条平衡缓冲液母液加入0.1gDTT；胶条平衡缓冲液II：每10ml胶条平衡缓冲液母液加入0.25g碘乙酰胺；9)第二向SDS?PAGE电泳：将平衡好的IPG胶条转移至浓度为12.5％的分离胶的界面上，加入含0.001％溴酚蓝的1％琼脂糖封顶，16℃恒温下，恒电流电泳，10mA／胶电泳2h后，改用30mA／胶电泳至结束；10)采用考马斯亮蓝法对凝胶进行染色。
法律状态：
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&&8:00-11:30,13:00-17:00(工作日)TCA-丙酮蛋白浓缩；TCAproteinprecipitationp；StockSolutions:100%(w/v)；recipe:dissolve500gTCA(a；PrecipitationProtocol:；1.Add1volumeofTCAstockto；i.e.in1.5mltubewithmaxim；3.Spintubeinmicrocent
TCA-丙酮蛋白浓缩 TCA protein precipitation protocol Stock Solutions: 100% (w/v) Trichloroacetic acid (TCA) recipe: dissolve 500g TCA (as shipped) into 350 ml dH2O, store at RT.
Precipitation Protocol: 1. Add 1 volume of TCA stock to 4 volumes of protein sample. i.e. in 1.5ml tube with maximum vol., add 250μl TCA to 1.0ml sample. 2. Incubate 10 min at 4°C. 3. Spin tube in microcentrifuge at 14K rpm, 5 min. 4. Remove supernatant, leaving protein pellet intact. Pellet should be formed from whitish,fluffy ppt. 5. Wash pellet with 200μl cold acetone. 6. Spin tune in microfuge at 14K rpm, 5min. 7. Repeat steps 4-6 for a total of 2 acetone washes. 8. Dry pellet by placing tube in 95°C heat block for 5-10 min to drive off acetone. 9. For SDS-PAGE, add 2X or 4X sample buffer (with or without bME) and boil smaple for 10 min in 95°C herat block before loading smaple onto polyacrylamide gel.
TCA蛋白浓缩步骤： 储存液：100%（W/V）三氯乙酸（TCA） 配制：将500g TCA溶解到350ml dH2O中，室温储存。
浓缩步骤： 1. 加1倍体积的TCA储存液到4倍体积的蛋白样品中。如：在1.5ml的离心管中，1ml样品中加入250ul的TCA。 2. 4度孵育10min。 3. 14 000rpm 离心5 min。 4. 弃上清 5. 加入200ul预冷的丙酮洗涤沉淀。 6. 14 000rpm 离心5 min。 7. 重复步骤4-6两次。 8. 95度5-10 min，晾干沉淀以彻底出去丙酮。 9. 加入2X或4X样品buffer，煮沸样品10 min，SDS-PAGE
改进版： TCA蛋白浓缩步骤： 储存液：100%（W/V）三氯乙酸（TCA） 配制：将500g TCA溶解到350ml dH2O中，室温储存。
浓缩步骤： 10. TCA储存液加到样品蛋白中，终浓度为10%，TCA缓慢滴入蛋白样品中；蛋白样品不易过多，2ml左右即可，使用10ml离心管。 11. 冰浴30-60min，时间久一点。 12. 14 000rpm 离心5 min。 13. 弃上清 14. 加入400ul预冷的丙酮洗涤沉淀，（丙酮事先放入-30℃冰箱内冷冻至少半个小时以上）。 15. 14 000rpm 离心5 min。 16. 重复步骤4-6两次。 17. 室温晾干沉淀，不易过干10-15min。 18. 加入水溶解，若有结块或不溶可用8M尿素溶解； 19. 区样品做跑胶样品处理，跑SDS胶。
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