Serratia marcescens SYBC 08的筛选、鉴定及其发酵产过氧化氢酶的研究--《江南大学》2011年博士论文
Serratia marcescens SYBC 08的筛选、鉴定及其发酵产过氧化氢酶的研究
【摘要】：过氧化氢酶(Catalase, CAT)通过催化一对电子的转移最终将H_2O_2分解为H2O和O2。其广泛应用于食品、纺织、造纸、环保等行业。因此,研究微生物发酵生产CAT具有一定的理论价值和潜在的应用前景。
论文研究了产CAT菌株的筛选,经透射电镜观察、脂肪酸等生理生化观测和16S rRNA基因序列分析鉴定了一株高产CAT的细菌。考察了其发酵产酶条件,研究了发酵产酶调控方法、产酶生理、进行了酶的纯化与性质研究,克隆了该酶基因并进行了序列分析,取得了如下主要结果:
分别采用H_2O_2富集生长法和H_2O_2起泡检测法,从37份土壤和污泥样品中,共筛选获得141株潜在的CAT高产菌。用H_2O_2起泡检测法从纺织厂漂洗车间含H_2O_2污泥中筛选获得一株CAT产量最高的菌株。在LB培养基平板培养48 h后,菌落为紫红色、圆形、光滑、湿润,表面隆起呈金属光泽,边缘整齐或不整齐,有轻微异味,色素不扩散到培养基中。该菌株有丙酮酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶,无精氨酸双水解酶。菌株能利用蔗糖、木糖、阿拉伯糖、乳糖、山梨醇,但不能利用L-鼠李糖、纤维二糖、蜜二糖。经透射电镜观察,这株菌能产圆形或棒形芽孢。主要的脂肪酸含量为C17:0 CYCLO (17.3 %),C_(16:0) (14.8 %),C_(10:0)3OH (10.0 %),C_(17:0) CYCLO (17.3 %),C_(14:0) (6.0 %)。经16S rRNA基因序列鉴定,将菌株命名为粘质沙雷菌(Serratia marcescens SYBC08)。研究还发现该菌株在碳源利用、主要脂肪酸含量等生理生化特征和其它的粘质沙雷菌有差异。该菌株CAT比活力较高,是生长于无H_2O_2环境S. marcescens SYBC-01的10.6倍。高的CAT比活力和产芽孢可能是其能够生长在H_2O_2胁迫环境的机制。通过对硫酸铵沉淀得到了粗CAT,进行主要应用酶学性质的研究表明,初步纯化的CAT在高温强碱和低温条件有一定的应用潜力。
研究了S. marcescens SYBC08摇瓶发酵产CAT的最佳条件。以合成NADH主要途径TCA循环的中间产物柠檬酸为碳源发酵产CAT,较其它碳源提高了产量。推测CAT产量的提高与NADH的合成有密切的关系。再经响应面方法对发酵条件进一步优化。优化后的发酵条件:柠檬酸30 g/L、玉米浆33.8 g/L、初始pH 5.91、接种量4 % (v/v)、装液量50 mL/250 mL、转速250 r/min、温度32.8℃、培养36 h。酶产量从1470 U/mL提高到12165 U/mL,提高了7.27倍。
在5 L小型发酵罐下,以摇瓶发酵的最佳培养基为发酵罐条件下的发酵培养基,研究了S. marcescens SYBC08产CAT的分批发酵条件。最佳的培养条件:通气量1.5 vvm、pH 7.0、转速400 r/min、相对溶氧控制在5 %、发酵时间22 h。在此条件下,CAT最高产量为22422 U/mL。进一步添加100 mg/L的烟酸以调控NADH的合成,CAT产量提高了15.1 %,达到26442 U/mL。
分别以葡萄糖和柠檬酸为发酵碳源,研究了S. marcesces SYBC08产CAT过程的生理特征,分析了柠檬酸促进CAT产量的机制。CAT产量提高的过程中,AhpC活力及胞内VC含量提高较明显,MDA含量下降明显。发现两种碳源发酵的CAT产量均与抗氧化指标有显著或极显著的相关性,说明CAT产量的提高与氧化胁迫有关,柠檬酸为发酵碳源较葡萄糖为发酵碳源有更高的CAT产量,是增强了氧化胁迫。
S. marcescens SYBC08的粗酶液经过硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析纯化得到纯的CAT。该过程的纯化倍数为13.8,回收率为22 %。CAT的分子量为230 kDa,由4个分子量为58 kDa同源亚基组成。该酶的比活力(199584 U/mg蛋白)是Halomonas sp. Sk1的3.44倍。该酶在405 nm和280 nm有吸收峰,A405/A280比值为0.42。K_m和V_(max)分别为78 mmol/L和188212 U/mg。1.0 mmol/L的Mg~(2+)和Ca~(2+)对CAT活力有显著的激活作用,Mn~(2+)、EDTA和邻苯二酚对CAT活力有显著的抑制作用。CAT有较宽的pH最佳活力(pH 7.0-9.0)和pH稳定性范围(pH 5.0-11.0)。最适的温度大约为20℃,在0℃依然有78.5 %的活力,这个结果证明其为常温菌产的低温单功能CAT。经LC-MS/MS氨基酸序列分析,该酶与S. proteamaculans 568的CAT氨基酸序列(gi| )最为匹配。由S. proteamaculans 568 CAT的基因序列设计引物并获得该CAT基因。该酶基因长度为1437 bp,Genbank上的登录号为HM068611。经该基因推导的氨基酸序列与相关的23个CAT比对并构建系统进化树。结果表明,虽然大部分具有重要功能的位点在24个相关的CAT中是相当保守,S. marcescens SYBC08 CAT推导的氨基酸序列残基(M53、S93、H341、H284和F194)在相关CAT中并不完全保守,说明不同CAT之间的催化行为有一定的多样性。该高比活CAT在肠杆菌科中具有最高的相似性,说明一些肠杆菌科微生物中的该类酶在抵御H_2O_2对细胞的伤害中发挥了重要的生理功能。该基因推导的氨基酸序列预测的二级、三级结构表明,二级结构中含的螺旋结构、折叠片状结构、环形及其它结构含量分别为27.8 %、16.7 %和55.4 %,预测的NORS区在343-423。预测的酶亚基三维结构与已知的1e93A(2.00 ?)有85.169 %的相似度。
【关键词】：
【学位授予单位】：江南大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2011【分类号】：TQ925【目录】：
摘要3-5Abstract5-7缩略词对照表7-12第一章 绪论12-21 1.1 微生物CAT 的研究进展12-19
1.1.1 CAT 在工业领域中的应用12-13
1.1.2 CAT 在微生物的分布13
1.1.3 CAT 高产菌株的筛选研究13-14
1.1.4 微生物CAT 基因表达调控及微生物H_2O_2 形成途径的研究14
1.1.5 CAT 发酵调控的研究14-15
1.1.6 CAT的纯化、性质、分类及冷适应CAT的研究15-17
1.1.7 单功能CAT 基因的克隆、结构和功能17-19 1.2 论文的立题依据和主要研究内容19-21
1.2.1 立题依据和研究意义19-20
1.2.2 研究内容20-21第二章 CAT高产菌的筛选、鉴定及其应用酶学性质21-30 2.1 引言21 2.2 材料与方法21-24
2.2.1 材料21
2.2.2 主要仪器21
2.2.3 主要试剂21
2.2.4 培养基21-22
2.2.5 方法22-24
2.2.6 数据处理24 2.3 结果24-27
2.3.1 CAT 产生菌的初筛与复筛24-25
2.3.2 菌株 SYBC08 的形态观察25
2.3.3 菌株SYBC08 生理生化鉴定25
2.3.4 菌株 SYBC08 的 16S rRNA 基因序列及其进化树分析25-26
2.3.5 菌株 SYBC08 的脂肪酸组成和含量26
2.3.6 粗酶的最适pH 及pH 稳定性26-27
2.3.7 粗酶的最适温度及热稳定性27 2.4 讨论27-30第三章 S. marcescens SYBC08摇瓶发酵产CAT条件的优化30-43 3.1 引言30 3.2 材料与方法30-32
3.2.1 材料30
3.2.2 主要仪器30
3.2.3 主要试剂30
3.2.4 培养基30
3.2.5 方法30-32
3.2.6 数据处理32 3.3 结果32-41
3.3.1 种子的生长曲线32
3.3.2 碳源对菌株生长和酶活力的影响32-33
3.3.3 不同氮源对菌体生长和酶活力的影响33-34
3.3.4 不同金属离子对菌体生长和酶活力的影响34
3.3.5 初始pH 对菌体生长和酶活力的影响34-35
3.3.6 正交试验35-36
3.3.7 装液量对菌体生长和酶活力的影响36
3.3.8 接种量对菌体生长和酶活力的影响36
3.3.9 温度对菌体生长和酶活力的影响36
3.3.10 摇床转速对菌体生长和酶活力的影响36-37
3.3.11 产酶过程曲线37
3.3.12 响应面法优化产CAT 的发酵条件37-41 3.4 讨论41-43第四章 S. marcescens SYBC08分批发酵的条件和调控NADH 对CAT产量的影响43-52 4.1 引言43 4.2 材料与方法43-45
4.2.1 材料43
4.2.2 主要仪器43
4.2.3 主要化学试剂43
4.2.4 培养基43
4.2.5 方法43-45
4.2.6 数据处理45 4.3 结果45-50
4.3.1 pH 控制对CAT 合成、菌体生长及柠檬酸含量的影响45
4.3.2 搅拌转速对CAT的合成、菌体生长及柠檬酸含量的影响45-47
4.3.3 溶解氧对CAT 合成、菌体生长及柠檬酸含量的影响47-49
4.3.4 相对溶氧与添加烟酸对CAT合成、菌体生长及柠檬酸含量的影响49-50 4.4 讨论50-52第五章 S. marcesces SYBC08 利用柠檬酸和葡萄糖 产CAT的生理特征52-64 5.1 引言52 5.2 材料与方法52-54
5.2.1 材料52
5.2.2 主要仪器52
5.2.3 主要化学试剂52
5.2.4 培养基52-53
5.2.5 方法53-54
5.2.6 数据处理54 5.3 结果54-62
5.3.1 胞内蛋白含量的变化54-55
5.3.2 胞内CAT 产量的变化55
5.3.3 胞内SOD 比活力的变化55-56
5.3.4 胞内AhpC 和CCP 比活力的变化56
5.3.5 胞内NOX 比活力的变化56
5.3.6 胞内T-AOC 的变化56-57
5.3.7 胞内和胞外V_C 含量的变化57-58
5.3.8 胞内H_2O_2 含量的变化58
5.3.9 胞内MDA 含量的变化58
5.3.10 胞内代谢产物的变化58-59
5.3.11 CAT 产量与其它指标的相关性分析59-62 5.4 讨论62-64第六章 S. marcescens SYBC08的CAT分离、纯化及基因研究64-82 6.1 引言64 6.2 材料与方法64-69
6.2.1 材料64
6.2.2 主要仪器64-65
6.2.3 主要试剂65
6.2.4 培养基65
6.2.5 方法65-69
6.2.6 数据处理69 6.3 结果69-78
6.3.1 硫酸铵沉淀69
6.3.2 DEAE-cellulose 离子交换层析69-70
6.3.3 SephacrylTmS-200 凝胶过滤层析70
6.3.4 纯化结果70-71
6.3.5 CAT 的亚基分子量与酶的分子量71
6.3.6 CAT 的氨基酸序列的质谱分析71
6.3.7 CAT 紫外和可见吸收光谱特征71-72
6.3.8 最适反应pH 和pH 稳定性72
6.3.9 最适反应温度和温度稳定性72-73
6.3.10 CAT 动力学研究73-74
6.3.11 金属离子及有机溶剂对CAT 活力的影响74
6.3.12 抑制剂及表面活性剂对酶活力的影响74
6.3.13 基因克隆74-75
6.3.14 氨基酸序列及氨基酸序列分析75-78 6.4 讨论78-82主要结论与展望82-85参考文献85-96论文创新点96-97附录1 16S rRNA 基因序列97-98附录2 脂肪酸鉴定图谱98-99附录3 纯化的CAT一级质谱鉴定图谱99-100附录4 克隆的CAT基因核苷酸序列100-101作者在攻读博士学位期间的成果101-103致谢103
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京公网安备75号鲍鱼脏器粗多糖的提取工艺及降血脂活性研究--《福建农林大学》2012年硕士论文
鲍鱼脏器粗多糖的提取工艺及降血脂活性研究
【摘要】：我国海洋生物资源丰富，其中鲍鱼产量逐年增加，在鲍鱼深加工中产生的大量鲍鱼内脏由于没有合适的加工处理方法被废弃，造成资源的浪费和环境的污染。鲍鱼内脏占鲍鱼体重的20-30%，含有丰富的营养成分。本论文以鲍鱼内脏为原料，采用高压脉冲电场技术和酶法结合提取鲍鱼脏器粗多糖，探讨最佳提取工艺，对所得到的鲍鱼脏器粗多糖进行理化分析，并设计动物实验研究鲍鱼脏器粗多糖的降血脂功能。本研究内容和结果如下：
（1）研究了电场强度、脉冲数对PEF提取鲍鱼脏器粗多糖的影响。实验结果表明，电场强度控制在30kV/cm，脉冲数控制在12个时，鲍鱼脏器粗多糖提取效果最佳。
（2）研究了酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶的鲍鱼脏器粗多糖提取效果，结果表明中性蛋白酶提取效果最好。中性蛋白酶提取多糖过程中各因素的关键性从高到低依次为：时间、料液比、温度、加酶量。各提取因素对多糖提取影响显著。最佳提取条件为：时间2.5h、料液比1:6、加酶量2.4×10~4U/g、温度55℃。
（3）对鲍鱼脏器粗多糖进行初步理化分析。经冷冻干燥后的鲍鱼脏器粗多糖呈浅黄色粉末，可溶于水，不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，有粘性。该多糖粉末中主要成分包括：多糖60.39%，蛋白质17.88%，脂质6.02%，水分10.94%。本实验所提取的鲍鱼脏器粗多糖是一种附着蛋白的粘多糖。
（4）采用原子吸收法对鲍鱼脏器粗多糖粉末中重金属镉含量进行测定。冷冻干燥后的鲍鱼脏器粗多糖粉末中重金属镉含量为0.4mg/kg。
（5）通过小鼠实验研究鲍鱼脏器粗多糖的降血脂效果。实验结果表明，鲍鱼脏器粗多糖对小鼠生长无不良影响。鲍鱼脏器粗多糖各剂量组能有效降低血清中的TG、TC、LDL-C含量以及升高HDL-C含量，说明鲍鱼脏器粗多糖能够有效地抑制TG、TC、LDL-C水平的升高和HDL-C含量的降低。多糖各剂量组的AI值也显著低于高脂组，说明鲍鱼脏器粗多糖能够降低动脉粥样硬化的危险性。以上结果说明鲍鱼脏器粗多糖可有效抑制因高脂饮食所导致的小鼠血脂升高，从而预防小鼠得高血脂症。
（6）对各组小鼠测试MDA和SOD水平，衡量鲍鱼脏器粗多糖对小鼠脂质氧化的影响。中、高剂量的鲍鱼脏器粗多糖能有效降低MDA水平，但低剂量还不能使小鼠MDA含量恢复到正常水平。各剂量的鲍鱼脏器粗多糖都能明显升高血清中SOD水平，提高SOD的活性，但高剂量效果较差。以上分析说明一定剂量的鲍鱼脏器粗多糖能够显著降低MDA含量，提高SOD活性，从而减少血清中自由基的产生，减少动脉粥样硬化的危险性。
（7）对小鼠肝组织的病理学观察显示，鲍鱼脏器粗多糖可以使高脂小鼠肝脏内脂肪沉积程度减轻，有助于动脉粥样硬化的预防和治疗。
【关键词】：
【学位授予单位】：福建农林大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：TS254.9【目录】：
摘要9-11Abstract11-13第一章 绪论13-22 1.1 海洋食品深加工废弃物利用的研究进展13-14
1.1.1 海洋食品深加工废弃物利用研究的意义13
1.1.2 鲍鱼内脏的研究进展13-14 1.2 海洋动物多糖研究进展14-17
1.2.1 海洋动物多糖生物活性研究进展15-16
1.2.2 海洋生物多糖提取方法16-17 1.3 高压脉冲电场提取技术的研究进展17-18
1.3.1 高压脉冲电场提取技术的研究概况17-18
1.3.2 高压脉冲电场提取技术的作用机理18 1.4 活性多糖与降血脂研究现状18-21
1.4.1 动脉粥样硬化18-19
1.4.2 多糖对脂代谢的影响19-20
1.4.3 多糖影响脂质代谢的机理20
1.4.4 降血脂功效的评价方法20-21 1.5 本论文立题意义和研究内容21-22
1.5.1 本论文立题意义21
1.5.2 本论文的研究内容21-22第二章 鲍鱼脏器粗多糖的提取22-34 前言22 2.1 实验材料与仪器设备22-23
2.1.1 材料22
2.1.2 仪器设备22-23
2.1.3 试剂23 2.2 实验方法23-25
2.2.1 鲍鱼脏器粗多糖提取工艺23
2.2.2 提取过程中对高压脉冲电场关键技术的研究23-24
2.2.3 鲍鱼脏器粗多糖酶法提取的选择24-25
2.2.4 酶法提取单因素实验25
2.2.5 鲍鱼脏器粗多糖提取的正交实验25 2.3 结果与讨论25-33
2.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制25-26
2.3.2 提取过程中电场强度的控制26-27
2.3.3 提取过程中脉冲数的控制27-28
2.3.4 鲍鱼脏器粗多糖酶法提取的选择28-29
2.3.5 时间对鲍鱼脏器粗多糖提取的影响29
2.3.6 料液比对鲍鱼脏器粗多糖提取的影响29-30
2.3.7 加酶量对鲍鱼脏器粗多糖提取的影响30-31
2.3.8 温度对鲍鱼脏器粗多糖提取的影响31-32
2.3.9 鲍鱼脏器粗多糖提取的正交实验32-33 2.4 小结33-34第三章 鲍鱼脏器粗多糖的成分分析34-40 前言34 3.1 实验材料与设备34-35
3.1.1 原料与试剂34
3.1.2 仪器设备34-35 3.2 实验方法35-37
3.2.1 鲍鱼脏器粗多糖中多糖含量的测定35
3.2.2 鲍鱼脏器粗多糖中蛋白质含量的测定35-36
3.2.3 鲍鱼脏器粗多糖中脂质含量的测定36
3.2.4 鲍鱼脏器粗多糖中水分含量的测定36-37
3.2.5 鲍鱼脏器粗多糖中重金属镉含量的测定37 3.3 结果与讨论37-39
3.3.1 鲍鱼脏器粗多糖中多糖含量的测定37
3.3.2 鲍鱼脏器粗多糖中蛋白质含量的测定37-38
3.3.3 鲍鱼脏器粗多糖中脂质含量的测定38
3.3.4 鲍鱼脏器粗多糖中水分含量的测定38
3.3.5 鲍鱼脏器粗多糖中重金属镉含量的测定38-39 3.4 小结39-40第四章 鲍鱼脏器粗多糖的降血脂活性研究40-53 前言40 4.1 材料与仪器40-41
4.1.1 原料40
4.1.2 试剂40-41
4.1.3 主要仪器41
4.1.4 实验动物41 4.2 实验方法41-42
4.2.1 动物分组41-42
4.2.2 甘油三酯（TG）含量测定42
4.2.3 总胆固醇（TC）含量测定42
4.2.4 高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量测定42
4.2.5 低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量测定42
4.2.6 动脉粥样硬化指数（AI）42
4.2.7 鲍鱼脏器粗多糖对高脂小鼠脂质氧化的影响42
4.2.8 肝组织病理学观察42 4.3 结果与分析42-52
4.3.1 鲍鱼脏器粗多糖对小鼠体重的影响42-43
4.3.2 鲍鱼脏器粗多糖对小鼠血脂的影响43-48
4.3.3 鲍鱼脏器粗多糖对高脂小鼠脂质氧化的影响48-50
4.3.4 肝切片观察50-52 4.4 小结52-53第五章 结论与展望53-55 5.1 结论53-54 5.2 展望54-55参考文献55-60致谢60
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