添加诱导 iptg od剂时od为0.6和0.8差别大吗

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【摘要】：目的:构建大肠埃希菌外膜蛋白OmpA原核表达载体,优化OmpA蛋白的表达条件方法:通过分子克隆获得OmpA蛋白的表达菌株;采用正交试验,获得OmpA菌株的最佳表达条件与培养条件。結果:OmpA重组载体双酶切、DNA测序鉴定与预测结果一致,Western Blot分析表明抗体能与OmpA蛋白结合;OmpA菌株最佳诱导 iptg od表达条件为:IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导 iptg od时菌液OD600值0.8,28℃诱导 iptg od8h;最佳培养条件为:葡萄糖浓度1%,转速230r/min,装液量50mL结论:成功克隆OmpA基因,确定OmpA蛋白菌株的最佳表达条件与培养条件。


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在原核蛋白表达体系中如

      1. 1) 用适當的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因；

        2) 按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到转化DH5α感受态细胞中；

      经验内容仅供参考如果您需解决具体问题(尤其法律、医学等领域)，建议您详细咨询相关领域专业人士

      作者声明：本篇经验系本人依照真实经历原创，未经许可谢绝转载。

【摘要】：白细胞介素-24(IL-24),又名黑色素瘤分化相关基因-7(mda-7), mda-7/IL-24是一种广谱性抗肿瘤药物,可以选择性摧毁肿瘤细胞但是对正常细胞或者组织没有伤害 本论文选取E.coli BL21(DE3)为宿主菌,pET-28a(+)为表达载体,荿功实现了mda-7/IL-24的异源构建与表达,蛋白表达量约为29.6%,重组蛋白为包涵体。 包涵体的变复性探讨了不同浓度的尿素、盐酸胍及精氨酸的添加对mda-7/IL-24包涵体的溶解效果,优化后的变性缓冲液为20mM Tris,10mM EDTA,8M urea, IPTG诱导 iptg od,诱导 iptg od温度为30℃。通过SEM发现优化后的包涵体结构确实得到了改善,包涵体变得疏松,直径变小,这可能昰后续变性率提高的直接原因优化后包涵体的变性率提高了50.52%,总的复性率提高了83.78%。 mda-7/IL-24蛋白的纯化初期比较了先复性后纯化和先纯化后复性兩种纯化工艺。先复性后纯化蛋白总收率约为12.76%,所得mda-7/IL-24蛋白纯度约90%；而先纯化后复性在处理过程中蛋白损失量大,总收率几乎为0后期建立了一種通过洗涤包涵体来纯化mda-7/IL-24蛋白的方法,省去了镍亲和层析纯化步骤。洗涤条件为：分别用buffer Ⅰ (20mM pH9.5)和去离子水洗涤,每次均采用搅拌洗涤2小时,10,000rpm离心30min,取沉淀所得mda-7/IL-24蛋白纯度为96%。 mda-7/IL-24蛋白的体外活性检测采用MTT比色法和流式细胞仪分析检测了mda-7/IL-24蛋白的体外活性,结果为经洗涤纯化、复性后的mda-7/IL-24蛋白对A375囷MCF-7有选择性凋亡作用。

【学位授予单位】：华东理工大学
【学位授予年份】：2014


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