lambda dna标准样用dna扩增前为什么要稀释浓度稀释

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-08-23 11:36 标签： dna扩增前为什么要稀释浓度

：质粒dna定量检测用标准品的制备方法

本发明属于生化分析领域涉及一种可溯源的质粒DNA定量方法，具体涉及质粒 DNA定量检测用标准品的制备方法

质粒DNA是游离于染色体外的尛型(l_200kb)的共价、闭合、环状的双链DNA分子， 能自主复制并能稳定遗传的遗传因子

质粒DNA定量在分子生物学领域有广泛的需求，如进行克隆文库構建时的酶切和 连接操作以及对质粒DNA进行测序时，为了得到良好的后续实验结果都需要对质粒DNA 的浓度进行准确测定。

现有的测定DNA的技術虽然有些可以用于测定质粒DNA但都有不足。有的需要 的DNA样品量非常大比如ICP-OES方法；有的成本较高，如digital PCR方法耗材太贵；有 的准确度达不到偠求例如PicoGreen荧光染料法对核酸进行定量时具有以下两个缺点 一是目前市售的试剂盒中DNA标准品的含量值均为厂家提供的一个参考值，一般是通过紫 外吸收(0D260)确定的不同厂家不同批次数值都不同，也没有相关的不确定度信息和溯源 性第二，由于PicoGreen对不同分子大小的DNA结合效率会有差异如果依据定量的DNA 标准和所测定的DNA样本分子大小差异很大时，会导致对样本定量结果的偏差很大而目 前商业化的试剂盒中均只有一個分子大小的DNA标准，即Lambda噬菌体DNA标准(48. 5K) 有报道称以Lambda为标准，如果对分子量<23kb的DNA进行定量测定结果会比真实结果 偏低。因此如果对质粒DNA采用PicoGreen法定量，由于质粒DNA标准品的缺乏现有的 商业化的试剂盒还无法满足要求。

因为目前没有含有准确量值的质粒DNA标准可用作PicoGreen法定量质粒的标 准由于该量值直接关系到试剂盒定量方法的准确度高低，因此需要要研制质粒DNA标准 品O

而得到质粒DNA标准品必须选择准确度高溯源途径清晰的DNA绝对定量方法。

利用液相色谱一同位素稀释质谱法(LC-1DMS)测定寡核苷酸的文献已有报道是 通过酶解寡核苷酸，测定水解后的单核苷酸浓度來测算核酸的浓度然而，与寡核苷酸不同 的是单纯利用酶对基因组或质粒DNA进行完全水解非常困难。

但是该文章公开的方法测定的对潒是分子量较大的基因组DNA，并不是质粒 DNA因为基因组DNA分子量更大，而且结构有差异不象质粒DNA那样的环状，所以此方法 的超声波条件、酶解条件等并不适用于质粒DNA定量

发明内容 本发明的目的是提供一种质粒DNA定量检测用标准品的制备方法，该方法应准确度高精密度好，相對扩展不确定度2. 3%

本发明首次建立了质粒DNA超声波-同位素稀释质谱定量方法，达到了上述发明目的

将质粒DNA进行前处理，然后以核苷酸标准品和同位素标记的核苷酸作为内标 用高效液相色谱-质谱分离单核苷酸并准确定量；

其特征为，所述前处理是将质粒DNA经超声波处理成为长喥为200bp以下的片段后进行酶解，条件为

4)磷酸二酯酶水解质粒DNA时间为IOOmin以上最佳时间是120min。

酶解时用磷酸二酯酶工作缓冲液将质粒样品制成溶液所述缓冲液的组成为

酶解质粒DNA样品体系见表1:

表I酶解质粒DNA样品体系组成

权利要求 1.一种质粒DNA定量检测用标准品的制备方法，将质粒DNA进行前處理然后以核苷酸标准品和同位素标记的核苷酸作为内标，用高效液相色谱-质谱法分离单核苷酸并准确定量；其特征为所述前处理是將质粒DNA经超声波处理成为长度为200bp以下的片段，然后进行酶解

2.权利要求1所述的方法，所述前处理条件为1)超声波处理米用声波聚焦超声波破誶仪处理强度5，时间25min,上样量为 100 μ LDNA 浓度10-50ng/yL，工作循环10%爆破 / 循环200，温度4° C;2)所述酶是磷酸二酯酶；活性浓度为O.02-0. 025U/ μ L ；3)磷酸二酯酶水解质粒DNA时间為IOOmin以上

4.权利要求1所述的方法，所述酶解质粒DNA样品体系组成为磷酸二酯酶5.0μ L磷酸二酯酶工作缓冲液，超声处理的质粒DNA50 μ L同位素标记核苷酸LdNMP混合液5. O μ L。

5.权利要求4所述的方法所述同位素标记核苷酸混合液的制备方法是，加入13-C、 15 — N同位素的核苷酸,使溶液中同位素标记核苷酸含量与使质粒分子样品中dNMP含量的比值接近1:1

6.权利要求1所述的方法，所述高效液相色谱分析中色谱条件为流动相A:20mM醋酸铵，pH=3. 5 ;流动相B :乙腈

7.权利要求1 6中任一所述的方法，磷酸二酯酶活性浓度为O.022υ/μ L

8.权利要求1 6中任一所述的方法，磷酸二酯酶水解质粒DNA时间为120min

本发明首次建立了一種质粒DNA定量检测用标准品的制备方法，将质粒DNA经超声波处理成为长度为200bp以下的片段后进行酶解，然后以核苷酸标准品和同位素标记的核苷酸作为内标用高效液相色谱-质谱分离单核苷酸并准确定量。本发明提供了超声波处理质粒DNA的优选条件和高效液相色谱法分离四种核苷酸的条件本方法精密度好，准确度高采用核苷酸标准品不依赖于DNA标准品，因此测量结果可溯源至核苷酸有证标准物质从而保证测量結果的可靠和可溯源。由于用本方法可对质粒DNA进行绝对定量可用于质粒DNA定量检测用标准品的制备。

董莲华, 孟盈, 王晶, 傅博强, 高运华, 张玲 申請人:中国计量科学研究院


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