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酵母菌的ADH1启动子和ADH2启动子有什么区别吗？
两个启动子的表达量有区别吗？你为什么要选用用ADH2不用ADH1呢？
各种启动子有什么区别嘛？是启动不同的基因，还是说在不同的载体里起作用（就是载体菌株）
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【求助】有做酵母异源蛋白表达的大神吗？急求！！！
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这个帖子发布于2年零20天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我最近在做一个真菌基因的酵母表达，用的做酵母双杂的一个载体，检测不到蛋白表达。载体上边是ADH1启动子和终止子。看类似的文献都是用的ADH2启动子和终止子。有大神知道这两个启动子有什么区别吗？表达量都怎么样？需不需要诱导条件啊？
不知道邀请谁？试试他们
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没有人知道吗？还是我发错地方了
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Could you show yeast expression constructs you have cloned? How did you test the transgene expression in budding yeast?
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mpark Could you show yeast expression constructs you have cloned? How did you test the transgene expression in budding yeast? 我用的是Hind III酶切后的pGADT7质粒，导入后，营养缺陷筛选，PCR验证基因，然后wetern blot检测蛋白上的his标签，没有结果。是不是ADH1启动子的表达量不够啊？
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Have you done mapping for your contruct? How big is insert? What the MCS are?Do you know if you add the insert at Hind III sites in this vector, you may damage expression cassette?
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pAAV-LacZ质粒图谱，序列，大小，抗性
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mpark Have you done mapping for your contruct? How big is insert? What the MCS are?Do you know if you add the insert at Hind III sites in this vector, you may damage expression cassette? 插入基因大概12kb，由于这是用于酵母双杂交的载体，表达盒里有一些不需要的基因，Hind III可以都切掉，详细的图谱里Hind III不会切掉终止子。还有我想问：ADH1和ADH2启动子的表达量有区别吗？该怎么选用？
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If you clone the transgene at Hind III, ADH1 promoter would be no function. I don't think promoter ADH1 and ADH2 would cause big difference in driving the transgene expression.
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mpark If you clone the transgene at Hind III, ADH1 promoter would be no function. I don't think promoter ADH1 and ADH2 would cause big difference in driving the transgene expression.这是详细的标注，蓝色部分为ADH1启动子，我在克隆时保留了酶切位点，这样会导致ADH1启动子失效吗？
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If ADH1 promoter is functional, try to run RT-PCR to examine transgene transcription in LEU2 positive yeast cells (grow LEU2 positive colonies in SD-minus LEU /raffinose medium and induction with glactose).
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mpark If ADH1 promoter is functional, try to run RT-PCR to examine transgene transcription in LEU2 positive yeast cells (grow LEU2 positive colonies in SD-minus LEU /raffinose medium and induction with glactose). 谢谢你一直耐心的回答！我做了点杂交，结果基本正确吧。但是我用Ni-NTA提取的蛋白感觉跑出的条带比预计要小很多，所以我想问一下，按我如上的进行克隆不影响ADH1启动子的功能吧。
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ADH1 promoter does nothing for the size of transgene product. Why don't you run RT-PCR and Northern blot to examine the transgene transcription first? The other issue is there is no His-tag in transgene expressing cassette, how could Ni-NTA be working in transgene product purification? Moreover, how did you analyze the transgene expression? Could you describe it step by step?
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mpark ADH1 promoter does nothing for the size of transgene product. Why don't you run RT-PCR and Northern blot to examine the transgene transcription first? The other issue is there is no His-tag in transgene expressing cassette, how could Ni-NTA be working in transgene product purification? Moreover, how did you analyze the transgene expression? Could you describe it step by step? 在克隆基因时我在基因前端添加了His标签。southern-blot和RT-PCR比较繁琐，而且实验室也不具备所有条件。我并没有分析蛋白的表达，用Ni-NTA提取之后做了个蛋白点杂交。
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Protein dot blot results may show some signals, but how specific the signal would be is an issue that you need to verify, and you have said that the Ni-NTA purified protein was smaller than what it should be expected in molecular size, indicating the protein you have purified is not specific one, or not a transgene product. Have you detected the transgene using antibody specifically against the protein?The non-specific detection has nothing to do with ADH1 promoter activity. To determine whether ADH1 promoter is functional or not, you need grow yeast cell in SD medium minus amino acid lucine and make RNA for RT-PCR.
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mpark Protein dot blot results may show some signals, but how specific the signal would be is an issue that you need to verify, and you have said that the Ni-NTA purified protein was smaller than what it should be expected in molecular size, indicating the protein you have purified is not specific one, or not a transgene product. Have you detected the transgene using antibody specifically against the protein?The non-specific detection has nothing to do with ADH1 promoter activity. To determine whether ADH1 promoter is functional or not, you need grow yeast cell in SD medium minus amino acid lucine and make RNA for RT-PCR. 恩，好的。谢谢你！
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战友，看了一下你的帖子，你用这个酵母载体是用于单纯的基因表达吗？还是做酵母杂交验证蛋白相互作用。我想用这个载体用于单纯的基因在酵母的表达，不知道能不能这样做。求解。谢谢。
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关于丁香园酿酒酵母中表达内切葡聚糖酶基因和共表达纤维素酶基因的研究-技术前沿-新闻中心-国家标准物质网
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酿酒酵母中表达内切葡聚糖酶基因和共表达纤维素酶基因的研究
【来源/作者】长安大学——李霞 【更新日期】 9:12:10
酿酒酵母长期与酒精饮料和烘焙工业相关联，它在燃料乙醇生产和益生动物饲料（单细胞蛋白）生产中也至关重要。此外，它作为重组产品的有效表达宿主及作为解密生物化学和基因过程的真核模式生物，酿酒酵母对基础研究和生物技术开发都提供了重大的贡献。酿酒酵母是工业发酵生产乙醇的最适生物，它能在厌氧和低pH条件下发酵葡萄糖、甘露糖、果糖和半乳糖。酿酒酵母和其他用于生产乙醇的微生物相比，它具有如下优势：从己糖生产乙醇的产量高，接近于理论得率（0.51 g乙醇/g葡萄糖）；渗透压和乙醇耐受力高；对木质纤维素酸水解物中抑制成分的耐受力高；在工业过程中具有天然的健壮性；遗传操作技术简单成熟；是GRAS生物等，但是它缺乏纤维素降解酶系统，不能在自然界中存在最为广泛的多糖—纤维素上生长。
一、酿酒酵母表达系统
在遗传学上构建能利用纤维素作碳源生产乙醇的主要障碍是缺乏成功表达多个基因的表达系统。酿酒酵母作为CBP过程的候选菌株之一，其表达系统在纤维素产醇中广泛使用。要使酿酒酵母菌株能具有水解纤维素的能力，就必须保证在胞外分泌足够量并且有活性的纤维素酶。在酿酒酵母中外源蛋白的表达水平受很多因素的影响，主要可分为以下几种类型：
1.外源基因特性
当外源基因在酿酒酵母中表达时，其本身的特性就是表达水平的一个重要影响因素。不同基因组使用密码子具有选择性，即具有密码子偏爱性。当外源基因mRNA的主密码子和宿主细胞基因组的主密码子相近或相同时，该外源基因在宿主中的表达效率就高；相反，如果外源基因含有较多的罕用密码子，那么它在宿主中的表达效率就很低。因此，由于外源基因的密码子不一定符合酿酒酵母的密码子偏爱性，其表达水平就会受到影响。
2.基因拷贝数
外源基因在酿酒酵母中存在的拷贝数的多少也是影响其表达水平的因素之一。理论上讲，外源基因拷贝数增加能够提高外源蛋白的表达水平，但是这一理论并不是总是能成立。由于外源蛋白的产生要经过转录、翻译、分泌后加工等一系列步骤，任何一个步骤出错都会影响它的表达水平。因此，外源基因拷贝数对蛋白表达水平的影响还需要考虑细胞所处的生理状态（不同的工艺调控）。
在常规的重组酵母技术中，YEp型多拷贝质粒载体广泛的用于外源基因表达。但是在无选择性工业培养基中，这种YEp型载体在有丝分裂中基因的稳定性严重降低。另一个常规酵母载体，YCp型在有丝分裂中非常稳定，然而，质粒的拷贝数是1，因此表达水平也很低。染色体整合是克服这种有丝分裂不稳定性的好方法。虽然YIp型酵母整合载体能通过同源重组将外源基因整合到染色体的特定位点，但是整合拷贝数不超过五，因此表达水平也不能达到预期的量。
为了加强有丝分裂稳定性和整合基因的拷贝数，近来开发了一些新技术。一种方法是用rDNA作同源重组的目标位点。因为rDNA在单倍体酵母染色体上作为串联式重复序列存在200多个拷贝，使异源基因的整合数高达100个拷贝。另一种方法是用酿酒酵母Ty1转座子侧面的δ（delta）序列作整合位点。因为在单倍体酵母染色体中存在约30个拷贝的Ty1和425个拷贝的单独的δ序列，所以δ整合系统就可能比其他常规的整合系统将更多的外源基因整合到酵母的染色体上。
外源基因的起始转录是基因表达的关键，因此启动子就成为了重要的调控元件。选择可调控的启动子和相关的调控序列进而成为构建一个表达系统首先要考虑的问题。酵母的启动子可分为诱导型启动子和组成型启动子两种。为了实现外源基因在酿酒酵母中的高效表达，通常使用组成型的强启动子。
4.分泌信号
具有纤维素降解能力的酿酒酵母工程菌株在纤维素降解过程中，考虑到其底物的特殊性—分布不均匀并且不可能进入到细胞内部，往往要将外源纤维素酶进行分泌表达。信号肽是蛋白分泌的必要因素，可以使用外源蛋白自身的信号肽，也可以使用酿酒酵母α因子的前导序列。一般来说，应用酿酒酵母特有的分泌信号较能使外源基因表达成功。另外，外源蛋白被酿酒酵母中蛋白酶降解也是一个影响有效分泌的因素。在分泌过程中，蛋白质糖基化是酿酒酵母中最主要的翻译后修饰加工过程，包括O-糖基化和N-糖基化两种形式，虽然糖基化对某些外源蛋白的活性没有较大的影响，但是也有不利的一面。
5.细胞表面展示
细胞表面工程作为一种重要的表达外源蛋白的途径越来越受到人们的重视。它也是影响外源蛋白有效表达的因素之一。细胞表面是细胞内部和细胞外部之间的一个功能性的界面。一些表面蛋白延伸穿过细胞膜，一些通过共价或非共价结合力结合到细胞表面组分上。细胞具有锚定表面特异性蛋白和将蛋白固定在细胞表面的特定区域的系统。近年来细胞表面工程的主要应用包括分离生产的多肽，生产微生物的生物催化剂、全细胞吸附剂和活体疫苗，以及筛选改造过的或新型的蛋白。
表面表达系统最初是将多肽融合到丝状噬菌体的pIII蛋白上而不影响它感染大肠杆菌的能力，这引起了噬菌体展示体统的发展。然而和噬菌体主要外壳蛋白融合的大分子多肽混合物很难与噬菌体结合在一起，而细菌表面更适合展示大 量的蛋白质，并且已经在革兰氏阴性和阳性细菌中成功实现了异源蛋白的细胞表面展示。酿酒酵母具有各方面的优势，因此发展它的细胞表面表达系统也是非常有用的。在酵母细胞表面展示中GPI（糖基磷脂酰肌醇）锚蛋白起着重要的作用，我们所熟知的α-凝集素及cwp2均含有GPI锚定位点。大量的分子量在0.93-136 kDa的异源蛋白已经成功的在酵母细胞表面进行了展示，在许多情况下，每个细胞展示104-105个分子。酵母细胞表面展示在生物技术中具有广泛的应用，例如：展示在细胞表面的酶对生物转化很有效，展示的抗体和蛋白受体有助于分析方面的应用及生物分离。细胞表面工程可用于随机或组合突变的蛋白质文库的高通量筛选，因此也是蛋白质工程的一种创新分子工具。目前酵母细胞表面展示系统广泛应用于新药筛选、生物吸附、酶的固定化、分子识别等。在纤维素产乙醇的工业中，酿酒酵母的细胞表面展示也被成功地应用，然而，关于锚定肽对酵母表达外源纤维素酶水平的影响却没有一个统一的观点，有的学者认为，锚定肽可能会影响酶的分泌效率和稳定性，导致对酶活性的不同程度的影响，并且融合蛋白在锚定细胞壁的过程中的过表达或者会造成细胞的代谢压力，或者阻碍水解底物在细胞壁上的扩散。
二、酿酒酵母中表达外源内切葡聚糖酶基因的研究进展
为考察酿酒酵母表达纤维素酶基因的能力以及直接利用纤维素产醇的可能性，人们在酿酒酵母中单个表达或共表达了多个不同来源、不同组分的纤维素酶基因，加深了对在酿酒酵母中表达纤维素酶基因规律和潜力的认识。
2003年，唐晓英等将瑞氏木霉EGI的cDNA序列插入到乙醇脱氢酶ADH启动子和终止子区域之间，构建了在酵母中分泌表达EGI的整合质粒pA15-PET。质粒包含酵母的rDNA序列，作为整合的同源部分。将EGI cDNA 转化工程酿酒酵母BE9711（含有α-乙酰乳酸脱羧酶（α-ALDC）编码基因）菌株，通过共转化pA15-PET和含有 G418抗性的YEP型质粒pA15TXR将目的基因整合上酵母染色体DNA的rDNA序列上，得到能同时表达胞内α-ALDC和胞外EGI的稳定工程酿酒酵母。
2010年，van Wyk等将温和嗜热放线菌Thermobifida fusca的内切葡聚糖酶Cel9A在酿酒酵母中成功地表达。重组Cel9A对可溶性（羟甲基化纤维素）和不可溶性（微晶粉末纤维素）纤维素底物都显示了活性，证实了它的内切葡聚糖酶活性。高效阴离子交换色谱对从微晶粉末纤维素释放的可溶性糖进行分析，结果显示纤维二糖与葡萄糖的比率为2.5±0.1。由于从纤维素链上切下足够的葡萄糖，因此重组菌株能在非结晶纤维素上生长。这是第一篇关于只表达一个重组基因的酿酒酵母在纤维素底物上生长的报道。另外，为了提高酿酒酵母的纤维素水解能力和研究重组菌株产生的纤维素酶之间协同作用的水平，进一步将Cel9A基因和瑞氏木霉的四个纤维素酶编码基因进行了共表达：两个内切葡聚糖酶Cel5A（EGII）和Cel7B（EGI），两个纤维二糖水解酶Cel6A（CBHII）和Cel7A（CBHI）。结果表明协同作用，特别是Cel9A和两个纤维二糖水解酶的，导致了重组宿主具有较高的纤维素水解能力。
酿酒酵母中共表达纤维素酶基因的研究进展
2009年，Jeon等为了实现纤维素的同步糖化发酵，在酿酒酵母YPH499菌株中共表达了纤维梭菌内切葡聚糖酶D（EngD）和扣囊复膜孢酵母β-葡萄糖苷酶（Bgl1）基因，使用的表达元件有α杂交因子基因的分泌信号序列，ADH1终止子，Gal1/Gal10启动子。重组酵母通过在胞外产生足够的内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶来生产乙醇。当用共表达重组菌株发酵20g/lβ-葡聚糖时，在发酵50 h后乙醇浓度达到9.15 g/l，转化率是理论值的80.3%，发酵20 g/l CMC时，40 h后产生11.03g/l乙醇。 2009年，Jeon等在酵母YPH294菌株中通过将内切葡聚糖酶E（热纤梭菌）和β-葡萄糖苷酶1（扣囊复膜孢酵母）与α因子信号肽融合实现了这两种酶的分泌表达。结果表明：共表达重组酵母菌株能从20 g/lβ-葡聚糖产9.67g/l乙醇，得率为0.48g/g；从20g/l CMC产8.56g/l乙醇，得率为0.43g/g；从10g/l酸膨胀纤维素产7.16g/l乙醇，得率为0.72g/g。
2010年，Yanase等通过利用δ整合技术，将瑞氏木霉的内切葡聚糖酶EGII和棘孢曲霉的β-葡萄糖苷酶BGL1编码基因整合上耐热酵母Kluyveromyces marxianus的染色体上，并在酵母细胞表面共展示，构建了能在高温下生长和发酵产醇的重组菌株。该菌株在48°C下12 h内能将10g/l的β-葡聚糖转化成4.24g/l的乙醇，得率为0.47g/g，是理论得率的92.2%。随温度升高，乙醇产量升高，在48°C最高，并且EG酶活较高的菌株产醇量较高。
2010年，Yanase等利用酿酒酵母δ整合系统，将构建的瑞氏木霉纤维二糖水解酶（CBHII）表达质粒载体及瑞氏木霉内切葡聚糖酶（EGII）和棘孢曲霉的BGL1基因共表达质粒载体转化酿酒酵母MT8-1菌株，并将它们整合到该宿主菌株的染色体上，其中BGL1展示在酵母细胞表面，EGII和CBHII分泌到培养液中或展示在细胞表面，使用的表达元件包括编码米根霉葡糖糖化酶分泌信号，α-凝集素的3’半端锚定肽，PGK启动子。所有的酶以它们的活性形式成功的在细胞表面或培养基上清中表达，并且EG和CBH的共表达使纤维素降解增加了3-5倍。利用EG、CBH和BGL共表达酵母进行了从10g/l磷酸膨胀纤维素的直接乙醇发酵，乙醇得率是2.1g/l，高于EG和CBH分泌酵母（1.6g/l）。结果显示在细胞表面的酶更适合从纤维素进行直接乙醇发酵。
2010年，Yamada等利用混合δ整合，将瑞氏木霉的BGL1、EGII和CBHII的表达盒同时整合到酿酒酵母MT8-1的染色体上，获得了具有高纤维素水解能力的菌株。混合δ整合菌株的总整合基因数目大约是传统δ整合菌株的一半，但是PASC的降解能力（64.9 mU/g湿细胞）比传统菌株的（57.6 mU/g湿细胞）的高。
2011年，Khramtsov等利用酿酒酵母δ整合技术将棘孢曲霉BGL1和瑞氏木霉EGII、CBHII编码基因整合上K1-V1116啤酒酵母菌株染色体上，构建了能从预处理的木质纤维素材料发酵产醇的工业酿酒酵母。该工程纤维素水解酵母能够在无外源酶时通过同步糖化和发酵一步将预处理生物质转化成乙醇。当用10%预处理的干玉米秸秆发酵产醇时，重组菌株在96 h内可发酵63%的纤维素，乙醇滴度达到2.6%（v/v）。
四、酿酒酵母表达纤维素酶基因、利用纤维素底物产醇中存在的问题
目前在酿酒酵母表达纤维素酶基因和利用纤维素底物产醇上已做了大量工作，取得了很大的进展；但这些菌株距离不额外添加纤维素酶而直接利用木质纤维素预处理原料高产乙醇，仍然有相当遥远的路程。分析其中存在如下问题：1）木质纤维素原料多种多样，结构相当复杂，相应地，其天然降解酶系也非常复杂、组分众多，要将此酶系在酿酒酵母中同时完整、高效地表达，又尽可能地不造成细胞过重的负担、不影响到其正常的细胞功能，本身就是极富挑战性的课题；2）就单个纤维素酶基因的表达而言，仍然存在基因来源、拷贝数、启动子、终止子等等因素之间的协调作用问题，其规律还有待人们进一步认识和了解。
参考文献：
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【关键词】酵母；内切葡聚糖酶；纤维素酶；&
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