谁重复出了实验,我暂不方便透露 日语

韩春雨:谁重复成功了实验 暂不方便透露
来源:新京报
作者:信娜
原标题:13名学者实名质疑韩春雨实验结果
韩春雨在实验室。近日,13名国内学者实名质疑韩春雨实验结果,呼吁第三方介入调查。 资料图片
  新京报讯 (记者信娜)河北科技大学副教授韩春雨将NgAgo基因编辑技术论文发表在《自然-生物技术》已逾五个多月。这期间,多名国外科学家曾声明无法重复实验。近日,13名中国科学家也公开实名质疑,他们仍没重复出实验结果,并呼吁有关方面组织第三方介入调查。《自然-生物技术》杂志昨日回应,正在继续调查,现在没有进一步结论。
  韩春雨昨日接受媒体采访称,他依然认为(实验失败)细胞污染的可能性最大,至于谁重复成功了实验,他暂不方便透露。截至记者发稿前,河北科技大学未对此作出回应。
  13名学者实名表示无法重复实验
  韩春雨论文发表一个月后,便“风波不断”。曾有多个国际学者实名声明无法重复其实验结果,并建议《自然-生物科技》杂志介入,要求韩春雨公开原始数据。
  这之后,中国学者无法重复实验结果的声音也不绝于耳。直到近日,包括北京大学生命科学学院研究员魏文胜、中科院动物所研究员王皓毅在内的13名学者实名发表声明,称多次实验但均未成功,并期望第三方介入调查。
  浙江大学生命科学研究院教授王立铭在声明中表示,两个月中,其实验室曾先后测试上百种实验条件,但都未得到预期结果。魏文胜在曾在采访中说,几个月内,他的学生也曾做过多次、不同的尝试,但均未能成功重复实验。
  为何选择此时实名声明,中科院生物化学与细胞生物学研究所研究员李劲松解释,目的是希望以科学的态度对待科学的问题,希望韩春雨能够和我们一起将实验重复出来。我们已经表明了我们的态度,现在等待韩的回复,并希望能有第三方介入调查。
  《自然-生物技术》杂志称仍在调查
  8月2日,《自然-生物技术》启动针对韩春雨文章的调查。昨日,《自然-生物技术》所在出版集团的媒体官员回应记者,称《自然-生物技术》杂志正在继续调查这一情况,现在没有进一步的结论。
  此前,上述杂志新闻发言人曾回应,将按照既定流程调查。根据流程,作者须将材料、数据、代码和相关的实验流程及时向读者提供,不能加以不当限制。
  面对数月以来愈演愈烈的质疑,王立铭认为,对于附有监管责任的机构,包括为韩春雨研究提供资助的国家自然科学基金委和河北省发改委,以及其所在的河北科技大学,应该开展客观和全面的调查,检验其中是否存在学术错误乃至学术不端的行为。
  一位不愿具名的学者也认为,这属于科学共同体的自洁机制,如果某一个实验无法重复,应该互相交流谈论,共同解决。这是很严肃的事情,他强调,面对同行的质疑,当事人应该尊重,正面回应。
  新闻回顾
  曾被誉为“诺奖级”成果
  自从日,河北科技大学生物科学与工程学院生命科学系副教授韩春雨在《自然-生物技术》发表论文后,便身陷漩涡。先是被媒体热捧,称其为“三无”教授但有“诺奖级”发现。但一个月后,因为未有实验室成功重复韩春雨实验结果,其所受质疑愈演愈烈。
  8月,数名国外学者实名称多次实验后,仍未能做出结果。并建议《自然-生物技术》介入,要求韩春雨公开原始数据。韩春雨曾回应,质疑不科学,并称已有实验室重复成功。
  此后,不断曝出针对韩春雨实验结果的质疑。这期间,他在接受采访时也曾说明,已有实验室重复成功,但不方便透露具体信息。
  韩春雨曾缺席多个基因编辑领域会议也被视为反常之举。一位学者告诉记者,一般情况下,发表成果后,当事人应该与同行交流,并积极希望获得认可。但他却缺席几次重要的学术会议,如9月末举行的以“基因组编辑新技术的兴起将带来的冲击”为主题的“中国科协第114期新观点新学说学术沙龙”等。
  【焦点1】
  学者称污染很容易发现并纠正
  面对实验结果无法重复,韩春雨曾多次接受采访时表示,已有实验室重复成功,但不方便透露对方姓名。在中国科学院遗传与发育生物学研究所高级工程师姜韬看来,这种情况似乎有些反常。
  他告诉记者,一般情况下,如果能够将最新成果重复成功,会愿意分享。“能紧跟最前沿进展是幸运和荣耀的”。
  为何多个实验室无法重复实验结果,韩春雨曾多次在采访中猜测,无法重复实验也许是材料受到污染。其中一位发表实名声明的学者告诉记者,材料是否污染并不能算根本问题。“对实验室而言,采取消毒等措施防止材料污染是很基本的操作,实验中材料受到污染也很容易发现并纠正”。
  中科院动物所研究员王皓毅在接受采访时曾说,多位老师都按照韩春雨论文的描述,使用同样的细胞系,同样的gDNA,针对同样的目标基因进行编辑,但仍没有得到阳性结果。
  韩春雨此前在接受媒体采访时曾提到,实验重复失败的科学家要是愿意实名出来,我们就让重复实验成功的人实名出来。如今,已有13名科学家实名发表声明,但已重复成功的实验室仍“讳莫如深”。
  【焦点2】
  几百家商业公司未能重复成功
  多位实名发声的学者在表达无法重复实验过程的基础上,大多期望由第三方介入,尽快将事情调查清楚。昨日,《自然-生物技术》相关负责人回应,正在继续调查。
  根据《自然-生物技术》的既定流程,作为在自然科研旗下期刊发表论文的条件之一,作者须将材料、数据、代码和相关的实验流程及时向读者提供,不可加以不当限制。但上述不愿透露姓名的科研工作者表示,直到目前,其仍未公布更核心的实验数据。
  他还透露,目前,几百家基因编辑的商业公司也在以更高效的方式重复实验。但据他了解,这些公司也尚未重复成功。“至少几百家吧,而且他们的重复效率更高”。
  如果当事人仍未正面回应,上述学者认为,应该呼吁有关管理方,借助外部第三方力量展开调查。王立铭也认为,对于负有监管责任的机构,包括为韩教授研究提供资助的国家自然科学基金委和河北省发改委,以及韩教授工作所在的河北科技大学,应该开展客观和全面的调查。
  【焦点3】
  质疑未澄清 韩春雨已荣誉等身
  除质疑研究结果本身,多位学者也对学术争议未定前,便对韩春雨给予学术荣誉及支持提出质疑。王立铭声明,我不赞成在相关调查尚未开展并得出结论之前,轻率地判定韩教授的工作是否存在问题。而与此同时,我也非常反对在目前就给予韩教授过多的学术荣誉和支持。
  另一位不愿具名的科研工作者也赞同,在学术争议本身没有结果之前,过多的荣誉会加剧风险。他认为,学术荣誉本身应建立在研究结果受到认可的基础上。
  根据报道,文章发表五个月内,韩春雨已收获多份荣誉与资助。7月,韩春雨被选举为河北省科协第九届委员会副主席,并被学校推荐为“长江学者”候选人;8月,被评为“河北省最美教师”;9月,成为国家“中青年科技创新领军人才”候选人之一;10月,河北科技大学的生物工程(基因编辑)被纳入河北省高校“双一流”建设中的“世界一流学科建设项目”,并获得河北发改委超过2亿元拨款,建设河北科技大学基因编辑技术研究中心。
  但在多位学者看来,这样的嘉奖似乎来得过快。王立铭声明,在学术界内部仍存争议的情况下,急急忙忙给予的赞誉和支持,显然忽视了学术研究自身的规律和行为标准。
(责任编辑:刘盛钱 UN649)
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中国人哪来这么多钱?[]
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《自然·生物技术》:已获有关韩春雨实验可重复性新数据
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英刊:已获有关韩春雨实验可重复性新数据
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新华社伦敦1月19日电(记者张家伟)就广受关注的韩春雨基因编辑论文争议,期刊《自然·生物技术》19日给新华社记者发来一份声明说,期刊已获得与韩春雨实验所用NgAgo系统可重复性相关的新数据,调查还在进行中。
河北科技大学科研人员韩春雨及其团队<span STYLE="FonT-FAMiLY: V mso-fareast-font-family: 仿宋_GB年5月在全球著名学术刊物《自然》的子刊《自然·生物技术》上报告说,他们发明了一种新的基因编辑技术NgAgo-gDNA。根据论文,与当前基因编辑领域内的主流技术CRISPR-Cas9相比,这种新技术在一些方面具有优势。但随后以及国外都有学者公开表示,无法重复论文中描述的实验。这项研究成果遭到多方质疑。
《自然·生物技术》随后在去年11月就这一争议发表了“编辑部关注”以及一篇国际研究人员关于不能重复相关技术的文章,并表示将在<span STYLE="FonT-FAMiLY: V mso-fareast-font-family: 仿宋_GB年1月完成相关调查。
韩春雨回应专利申请逾期:选择申请国际专利
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&作者:中青在线
原标题:韩春雨沈啸发声明回应专利申请“被视为撤回”
  中青在线石家庄1月12日电(中国青年报·中青在线记者
樊江涛) 1月12日,韩春雨和沈啸通过河北科技大学有关部门向媒体发出了《关于以Argonaute为核心的基因编辑技术相关专利申请问题的声明》。记者注意到,近日媒体报道以河北科技大学副教授韩春雨、浙江大学基础医学院研究员沈啸为发明人的专利——以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术,因申请人未在规定期限内答复国家知识产权的第一次审查意见通知书,该专利的申请被视为撤回。<span STYLE="FonT-FAMiLY: V mso-fareast-font-family: 仿宋_GB年1月9日,国家知识产权局发布该专利申请的“视为撤回通知书”。
  韩春雨和沈啸二人在1月12日“声明”中称:“关于以Argonaute为核心的基因编辑技术相关专利申请,我们已经聘请了具有丰富工作经验的国际一流专利代理机构来进行专利保护的全球化布局。从知识产权保护策略的角度,我们选择采取国际专利向中国递交的方式来保护中国国内专利。第一个专利的PCT文本已于<span STYLE="FonT-FAMiLY: V mso-fareast-font-family: 仿宋_GB年提交,并已包括原申请的中国专利内容。”
  <span STYLE="FonT-FAMiLY: V mso-fareast-font-family: 仿宋_GB年5月2日,韩春雨、沈啸等人在国际期刊《自然·生物技术》(Nature
Biotechnology)杂志上在线发表了研究论文《NgAgo DNA单链引导的基因编辑工具》,引起社会广泛关注和强烈反响。但随后一些国内外实验室则表示,未能根据韩春雨提供的数据和方法重复该实验,而受到不断质疑。
韩春雨回应“13课题组重复失败”:谁重复出了实验,我暂不便透露&&
08:02:04&&
来源:科技日报等
数月以来,韩春雨的NgAgo技术遭到了越来越多的质疑。因大面积无法重复实验,韩春雨领衔的NgAgo基因编辑技术的重复工作已经遇冷。8日,韩春雨接受《科技日报》采访时表示,如果重复失败的科学家愿意公开实名,就也让重复实验成功的人实名出来。10日晚,来自中科院等的。韩春雨对此仍表示,暂不方便透露重复成功的科研人员名字,并解释称细胞污染导致失败的可能性最大。
据《科技日报》12日报道,10日晚,来自中国科学院、北京大学、浙江大学、上海交通大学、华东师范大学、哈尔滨工业大学、温州医科大学等科研院所的13位课题组负责人实名公开表示,无法重复韩春雨今年5月2日发表在《自然-生物技术》上有关NgAgo的实验,让几个月来广受关注的韩春雨事件再添波澜。
11日,身处舆论中心的河北科技大学副教授韩春雨再次接受科技日报采访,并对此作出回应。对于13个科研人员实名公布无法重复实验,他依然认为细胞污染的可能性最大。至于谁重复出了实验,他暂不方便透露。“请求大家再有一点耐心。我还是之前的说法,很快将会有新的消息。”韩春雨说。
他表示,此前他也考虑过假阳性的可能,但目前来就他掌握的信息基本可以排除这种可能。
他同时表示,科学是渐进的。“目前关于Ago的基础研究太少了,它是广泛存在于微生物的一种防御机制,很多机制不明可能是重复性差的主要原因。中国科学界应该致力于解决这些问题,使它变得更好,这是我特别想说明的。希望实名公布的科学家一起参与解决这些问题。”
对于有科学家建议他公开重复实验过程和数据的要求,他表示,愿意和前来沟通的科学家交流。
此前报道:
韩春雨:我为什么要自证清白
《科技日报》8日报道,10月8日,在河北科技大学那间实验室里再见到韩春雨时,虽然身处“论文造假”“多人重复实验失败”的争议旋涡,但他看起来十分平静,依然侃侃而谈,并不时反问记者:“你觉得我要是造假了,我还能这么淡定?”他说,有人在网上说,韩春雨现在怎么睡得着?“我告诉你,我睡得很好”。
当日下午,科技日报记者在石家庄对韩春雨进行了独家专访,以下为采访实录:
科技日报:现在有一些实验室表示无法重复您的实验,您怎么看这个问题?
韩春雨:我现在也在研究别人为什么会重复实验失败,但还没有科学的结论,我私底下可以说一些猜测的原因,比如可能是材料污染,但是科学的结论还要等一段时间。
科技日报:您自己重复过这个实验吗?
韩春雨:当然,论文发表之前按要求重复过实验,论文发表后也重复过。
科技日报:那为什么不架起<span STYLE="FonT-FAMiLY: V mso-fareast-font-family: 仿宋_GB度摄像头,在监控环境下将实验重复一遍呢?
韩春雨:这是有罪推论,我觉得没必要。日本的小保方晴子是没有一家实验室重复出来,而我这个实验已经有人重复出来,连《自然》的记者David都调查过了,我为什么要自证清白,自己有病吗?
(注:《自然》杂志亚太通讯员David Cyranoski于今年8月采写报道,文章称:采访了三位匿名的中国科研人员,其中一位表示在好几个细胞系检测了NgAgo系统,而且结果显示NgAgo能够在预期的位点诱导遗传突变,但NgAgo系统的效率并没有比CRISPR-Cas9高,可能还要后续调整改进。另有两名要求匿名的科学家称有了一些初步的试验结果显示NgAgo是有效的,但是仍然需要进一步测序去确认。但事后,《自然》及David本人均表示该报道不能作为韩春雨实验可重复的证据。)
科技日报:《自然》后来发过声明,说记者报道不能代表杂志的调查结果,另外《自然》的报道里提到的3个人都是匿名,您觉得能作为实验可重复的证据吗?
韩春雨:你要是说报道不能作为证据,那些质疑我的报道为什么被人们作为我造假的证据。《自然》的记者David是非常专业的,我提供了一份5个人的名单给他,最后他采访到其中3个人,但是对方要求匿名。David的报道为我正名了为什么大家置若罔闻,一味地追捧那些质疑我的报道,老是说“多人无法重复”。
科技日报:您的意思是您已经明确知道有人已经重复出来了是吗?方便告诉我们具体是谁么?是国内科学家还是国外科学家?
韩春雨:是的,我当然知道,但不能告诉你,说出来了那些人就会受到骚扰。那些说不能重复的人不也都是匿名么?
科技日报:现在有重复失败的科学家向我们表示愿意实名。
韩春雨:那就让他们实名说呗,他们要是愿意实名出来,我们就让重复实验成功的人实名出来。
科技日报:迄今《自然》和河北科技大学对您提出了调查要求么?
韩春雨:没有。《自然》的报道已经写得很清楚了,除此之外我没有收到来自《自然》杂志别的要求。学校方面很信任我、支持我,我没必要也没打算自证清白。
科技日报:外界的质疑影响您了么?
韩春雨:当然会有影响,特别是一开始的时间很不适应。之前会有很多人给我发骚扰短信,半夜打骚扰电话,有的还打电话来谩骂。
科技日报:那您希望这一事件未来的走向是什么?
韩春雨:我就是希望你们都不要报道这些事情,我能安静地做科研。
科技日报:您觉得什么时候您能有进展,让这场争议有个了结。
韩春雨:这我没法跟你说,科学的事情没法预测。地心说和日心说争论了多少年?日心说的坚持者还被烧死了呢!我只能跟你说最近我会有新的进展,大家不要受一时一事的干扰。
13个课题组实名声明:无法重复韩春雨实验&
<span STYLE="FonT-FAMiLY: V mso-fareast-font-family: 仿宋_GB-10-20 11:18 &文章来源:
“现在有重复失败的科学家向我们表示愿意实名。”“那就让他们实名说呗,他们要是愿意实名出来,我们就让重复实验成功的人实名出来。”这是近日(<span STYLE="FonT-FAMiLY: V mso-fareast-font-family: 仿宋_GB年10月10日)《科技日报》备受关注的一则报道。
就在当天,来自中国科学院、北京大学、浙江大学、上海交通大学、华东师范大学、哈尔滨工业大学、温州医科大学等科研院所的13位课题组负责人实名公开表示,无法重复韩春雨今年5月2日发表在《自然-生物技术》上有关NgAgo的实验。这些科学家表示,这次声明是想提醒韩春雨和河北科大:作为同行,大家都在很认真地重复实验、验证技术,生怕因误解而给出的负面判断累及新技术发展。但同样作为科学共同体一员的韩春雨,也应尽快认真回应目前的科学质疑,完成作为论文通讯作者的责任和义务。
  13个课题组同时发出声明
这次愿意站出来发表公开声明的13位学者分别是:北京大学生命科学学院教授魏文胜,北京大学生命科学学院研究员孙育杰,北京大学分子医学研究所教授熊敬维,中科院动物研究所研究员王皓毅、李伟,中科院生物物理研究所研究员王晓群,中科院生物化学与细胞生物学研究所研究员李劲松,中科院上海生科院神经科学研究所研究员杨辉,浙江大学生命科学研究院教授王立铭,上海交通大学教授吴强,华东师范大学生命科学学院研究员李大力,哈尔滨工业大学教授黄志伟,温州医科大学教授谷峰。
“不能再拖了,必须要发声,要让国际科学界看到我们这个领域(即基因编辑)中国科学家的态度。”这是13位学者的共同态度。
魏文胜说,在过去几个月内,他所在实验室的四五名学生,根据韩春雨论文里所提到的实验方法,做了多次、不同的尝试,但实验结果均没有发现基因组序列的改变,即“实验方法得不到重复的验证”。
中科院动物所研究员王皓毅的实验也得到类似的结果。针对韩春雨文章中“效率较高的三条gDNA”,他的两名学生,分别独立进行内源基因的编辑,却都无法检测到目标基因的突变。王皓毅说:“我们也尝试了二次转染gDNA,延长培养时间等,但都没有阳性结果。”
这可以说是大家最普遍的经历。吴强说,他们用PCR检测DNA片段DELETION,这个只要在体DNA片段编辑后,应该就能检测出,哪怕效率再低,但即使是这样也不行。李劲松说,有的同行甚至解析了NgAgo的结构,想找到它的功能位点,结果也没如愿。
王立铭说,虽然大家经历了种种失败,但这仍然只是一个学术争议,无论发生在中国、美国,还是日本,都应当有标准的学术规矩来处理。
谁有权有责对质疑进行调查?
今年5月2日,《自然-生物技术》发表了韩春雨有关利用NgAgo进行基因编辑技术的论文,称这是一种新的基因编辑工具,与目前实验室最为流行的基因编辑工具CRISPR-Cas9各具优势。论文发表之后立刻引来全球同行的广泛关注。很多国内同行都纷纷联系韩春雨,希望重复并跟进他的工作。可不久之后,各种无法重复实验的质疑声开始汇聚,最终引起《自然-生物技术》杂志的重视,发表声明要求韩春雨课题组“须将材料、数据、代码和相关的实验流程及时向读者提供,不可加以不当限制”。
8月3日,河北科技大学在接受《人民日报》记者采访时承诺,在一个月内,韩春雨将采取适当形式公开验证,届时将有权威第三方作证。然而迄今为止,《自然-生物技术》还没有进一步评论,杂志发言人称正在继续调查。
这是怎么回事?一位国际知名学术期刊主编告诉笔者,实际上,学术期刊一般没有权力、能力,也没兴趣对科学家的科研成果进行调查,除非论文遭到同行的高度质疑。比如,有的杂志会委托第三方进行重复,而更多的则是让科研机构自己来处理。
“其实,真正有责任和权力对成果开展调查的,是作者所在的单位,以及为课题提供经费的资助者。”他说,国际上通行的做法是,当某个成果引起较大争议时,首先考虑解决科学问题。一般情况下,作者所在科研机构或资助者会指定领域内公信度高的几个课题组,对实验进行重复。在此过程中,受质疑课题组应配合指导完成实验,如果不配合,就必须接受调查。如果指定课题组重复出实验,则同行认可该成果,继续向前推进;如果无法重复,至少从科学上给同行一个明确信号,避免大家无谓的投入——至于其中原因,留给机构和资助者去仔细调查,并妥善处理。
“这么做很有必要,不然会浪费更多纳税人的钱。”上海交通大学系统生物医学研究院教授吴强说,重复实验需要经费,如果韩春雨可以早点解开同行的谜团,也可以少浪费国家宝贵的科研经费。
浙江大学生命科学研究院教授王立铭在其个人微信公众号近日发表的文章《关于基于NgAgo的基因编辑技术的个人声明》中评论说:对于负有监管责任的机构,包括为韩教授研究提供资助的国家自然科学基金委和河北省发改委,以及韩教授工作所在的河北科技大学,应该开展客观和全面的调查,检验其中是否存在学术错误乃至学术不端的行为。在这一点上,在著名的STAP干细胞造假事件中,日本RIKEN的态度可以借鉴。在该事件中,面对国际同行无法重复其实验结果的质疑,论文主要作者小保方晴子工作所在的RIKEN在几周内迅速开始调查,发现其博士论文和实验记录存在疑点后,第一时间宣布撤回学术论文,有效消除了不良影响。此后RIKEN又进行了耐心细致的调查,包括安排小保方在摄像头监督下重复试验、利用基因测序方法验证其论文使用的实验材料等等,最终给出了存在学术不端的结论,并严肃处理了相关责任人。事实上,只有这样深入全面的调查可以最终给韩教授清白,或最终确定韩教授的研究存在错误乃至不端。而实际上,找出真相并解决问题的过程不仅无损相关机构的声誉,反而能够更好地净化学术环境,维护学术共同体的信用。
值得注意的是,在河北科大的网站近日刚刚公布的“万人计划”候选人公示名单中,韩春雨被推荐为“中青年科技创新领军人才”。
呼吁公布重复实验成功者名单
刚看到韩春雨的论文时,王立铭非常开心和激动,他的实验室迅速索取了材料,并想推广到自己的研究中。可在此后的两个月内,他们先后测试了多达上百种实验条件,还根据韩春雨更新后的方法反复实验,可都没有观察到NgAgo方法对果蝇基因组的编辑活性。
他在上述声明中提出,从逻辑上说,NgAgo在果蝇胚胎中没有基因编辑活性,并不能证明NgAgo方法存在错误,更不能简单推导出韩教授团队存在学术不端。因为严格来说,他的课题组是在新系统中试图推广NgAgo方法的应用,而非简单地重复韩论文的结果。而更重要的是,判断学术错误乃至学术不端,需要更详细的信息和调查。但尽管如此,科学研究的成果,既然发表,就必须保证其真实无误可重复,公司的技术秘密可以讳莫如深,但一项公开发表的学术成果无法被同行顺利重复,非但没有价值,还会动摇整个学术共同体的生存基础——默认对方是诚信的、对方的研究成果是真实无误的。
中科院上海生科院生化与细胞所研究员李劲松也表达了同样的看法,他的课题组也绞尽脑汁,考虑了各种情况来重复实验,却得不到阳性结果。如果每项成果都要自己去验证之后才能采信,整个科研体系的效率将会低下得难以容忍。“科研本来就是容许试错的,但碰到问题大家可以一起讨论、探索,以提高整体科研效率。”他说,不少国际同行已经不再关注NgAgo技术——不浪费资源,要么等一篇系统否认该技术的论文出现,要么等有人确认技术可行。
但由于韩春雨一直没对质疑给出令同行满意的回应,有不少学者反映,近两三个月来,一些著名学术期刊要求中国科学家提供最原始实验数据的事件变得更加频繁。比对RIKEN对小保方晴子的严格调查,河北科技大学对韩春雨的信任给得少了些原则:连同行质疑都可以置若罔闻——世界同行将会怎样看待中国的科研诚信?
中科院院士、北京生命科学研究所学术副所长邵峰认为,这本来是学术界最常见的事情,已有非常成熟的处理方式,没有必要因为处理不当,而引发更多波澜。
出于上述种种理由,业内呼吁韩春雨公布重复实验成功者名单,让事件回归到简单而纯净的学术探讨。
附:目前公开声明未能重复实验的部分课题组名单
1.北京大学生命科学学院魏文胜课题组
我们使用了文章中报道的高效ssDNA,同时自己设计了其他2条针对体内其他基因位点的ssDNA,与NgAgo表达质粒共转HEK293T细胞与HeLa细胞,2天及5天后,用T7E1检测切割效率,这三条针对2个不同基因的ssDNA,在HEK293T和HeLa两个细胞系中,无论转染一次还是在8到12小时后再转染一次ssDNA,都没有检测到切割。
针对敲除后能使细胞有表型变化的某特定基因,我们设计了ssDNA,与NgAgo表达质粒共转HeLa细胞5天后,发现细胞表现出了一定的对应表型,但是把这部分细胞收集起来提取基因组,对靶位点测序,没有发现基因组序列的任何改变。
我们针对某特定基因设计了6种ssDNA,用特异的荧光报告系统检测是否有靶点DSB产生,结果显示所有实验组均没有检测到对靶位点DNA序列的切割活性。
2.中科院动物研究所王皓毅课题组
我们在<span STYLE="FonT-FAMiLY: V mso-fareast-font-family: 仿宋_GBT细胞中表达带有Flag标签的NgAgo
,在不同时间点检测NgAgo蛋白表达。发现转染6小时后开始检测到目的蛋白,随着时间的延长蛋白量增加。在人类<span STYLE="FonT-FAMiLY: V mso-fareast-font-family: 仿宋_GBT细胞系中重复原文章中Figure 4b中NgAgo对DYRK1A和GATA4两个位点的基因编辑,使用文章中发表的guide DNA
(gDNA)。具体实验方法为NgAgo分别与相应的gDNA共转染细胞,6h、12h后进行相应gDNA的再次转染。转染后<span STYLE="FonT-FAMiLY: V mso-fareast-font-family: 仿宋_GB天收集细胞进行Surveyor assay,未检测到目标位点目的条带的切割,
测序也未发现突变。结果未能重复Figure 4b。
我们也进行了原文章里的Figure 3切割GFP质粒的实验,使用文章中的eGFP gDNA G3,转染2天后,观察荧光表达和进行流式检测,
NgAgo+gDNA G3,NgAgo+
靶向其他位点的gDNA
,pUC19+G3,
pUC19+5’端没有磷酸化修饰的gDNA,以及单独转染gDNA
都能够明显降低eGFP表达。针对质粒目标位点的genotyping(Surveyor assay,PCR以及测序),未检测出任何突变。结果未能重复Figure 3
我们所使用的细胞定期进行支原体检测,未发现任何细胞污染。
3.中科院上海生科院生化与细胞所李劲松课题组
我们主要做了两方面的实验:一个是在Oct4-EGFP的小鼠受精卵中进行NgAgo mRNA和gDNA的注射,尝试了不同的浓度组合,在囊胚的时候也有看到不亮或者发光很弱的情况,但是测序发现序列并没有突变;另一个是在细胞水平,我们最初是在Oct4-EGFP的单倍体细胞共转NgAgo和gDNA载体,分选双阳性的细胞直接测序或者培养后测序,均没有突变。我们开始怀疑NgAgo的表达窗口比较窄,就改造载体建立了稳定表达Ago的细胞系,依然没有突变。后面我们就完全按照NBT文章里的实验,在<span STYLE="FonT-FAMiLY: V mso-fareast-font-family: 仿宋_GBT细胞中打靶hDYRK1基因,gDNA的长度位置都和文章一样,还是没有能突变。
4.浙江大学声明科学研究院王立铭课题组
我们实验室在韩春雨论文发表一周内就索取了NgAgo的DNA载体,并立刻计划了对NgAgo方法的测试。在两个月多达上百次的实验中,在我们测试的所有条件中,我们都没有观察到NgAgo方法对果蝇基因组的编辑活性。
5.北京大学生命科学学院孙育杰课题组
我们使用了原始菌里来源的和人工合成的密码子优化的NgAgo,尝试了公司合成的磷酸化gDNA和自己使用PnK磷酸化的gDNA切割MDA_MB-231细胞中的laminB1和LBR基因,每个基因五条gDNA,通过T7 assay均未见切割。同时,我们切割整合在基因组的gfp基因,使用韩春雨文章所用的gDNA,流式检测也无gfp荧光的下降。我们还将NgAgo融合了荧光蛋白,使用靶向telomere的gDNA,使用高倍荧光显微镜没有发现NgAgo在telomere处的富集。
6.中科院动物研究所李伟课题组
我们在哺乳动物细胞和胚胎水平进行了基于NgAgo的基因组靶向突变实验,采用了包括韩文章中报道的<span STYLE="FonT-FAMiLY: V mso-fareast-font-family: 仿宋_GB细胞和4个完全相同的guide序列和,结果均为阴性,均没有检测到靶向DNA突变产生。具体进行的实验包括:1、利用体外原核表达纯化的NgAgo和韩文章中报道的4个guide序列进行37°单链DNA切割,结果:37°没有检测到DNA切割。2、哺乳动物细胞实验。按照文章附件中的方法,在<span STYLE="FonT-FAMiLY: V mso-fareast-font-family: 仿宋_GB细胞分别转染韩文章中的
G5,G10,G27,G28和自己设计的Mecp2基因guide序列,T7EI酶切检测没有检测到靶位点突变。进行guide-DNA连续转染实验,在转染后8h,12h
补充转染guide
依然没有检测到靶位点的突变。3、小鼠胚胎实验:选取Mecp2和stella
位点分别设计若干guide序列,连同NgAgo mRNA一起进行细胞质注射,收取囊胚检测,T7EI和测序分析均没有检测到靶位点突变。
7.中科院上海生科院神经科学研究所研究员杨辉课题组
我们针对小鼠胚胎的GFP基因、Tyr基因分别设计了四个gDNA(在三家公司都试过合成了),NgAgo用了三种不同版本(密码子优化或者NLS在N端、C端),操作几百个胚胎,生了三百多只小鼠,都没有检测到敲除。之后我们又在细胞水平针对猴的Tyr基因、<span STYLE="FonT-FAMiLY: V mso-fareast-font-family: 仿宋_GB的GFP基因、N2A的Tyr基因进行操作,也没有检测到任何基因编辑。最后我们完全按照韩文章中fig4的DYRKIA基因进行操作,也完全没有效果。
8.上海交通大学吴强课题组
TtAgo被发现在高温下可以在体外通过gDNA指引内切单链DNA,PfAgo在高盐条件下可以切DNA单链,NgAgo可能是一种嗜盐碱古杆菌中含有类似RNaseH结构域的单链RNA内切酶,但也可能内切DNA单链。我们利用密码子优化后合成的NgAgo做了以下体内编辑实验,我们没有做体外实验:
1&单位点:不管是人工合成的5‘端磷酸化gDNA,还是利用T4 PNK磷酸激酶磷酸化5’端羟基得到的gDNA,在小鼠胚胎、小鼠N2A细胞、人HEC-1B细胞中均没检测到活性。
2&双位点:三个学生花的力气最大。至少做了三个不同的DNA片段,做了不同温度、盐离子浓度、多次转染、先体外合成NgAgo蛋白再转染、不同的Tag或核定位序列,也试了不同的细胞系。我们是用PCR检测DNA大片段敲除,这个方法很灵敏(用CRISPR/Cas9很容易做出来),因为只有在片段敲除的情况下才能扩增出PCR产物,哪怕效率很低也应该能检测出来。PCR产物经过克隆再测序,但从没有检测出片段敲除的正确结果。
9.温州医科大学谷峰课题组
我们利用携带GFP的人类细胞,同时导入磷酸化的gRNA和NgAgo表达质粒(做了多个不同浓度梯度和重复),希望特异的看GFP敲除,以CRISPR/Cas9做阳性对照,但是NgAgo组我们没有能够检测到GFP的失活。这个实验我们后面又重复了,但是仍然没有看到切割。所以此时,我们高度怀疑NgAgo的活性,该项目就先停了。
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