：骨髓来源的巨噬细胞的体外诱導培养方法

本发明涉及生物技术领域特别涉及细胞的培养方法。

巨噬细胞广泛分布于全身各器官、组织在保持内环境稳定、机体防御、炎症调控、促进组织损伤修复方面起着重要作用。巨噬细胞在不同微环境下具有不同的表型使巨噬细胞处于不同的功能状态。这些功能状态迥异的巨噬细胞在不同生理及病理条件下发挥不同的生理功能；与肿瘤、代谢综合症、糖尿病等严重疾病的发生、发展都有密切的聯系静息巨噬细胞在不同刺激条件下可激活分化为表型和功能迥异的两大类型M1型和M2型。Ml型巨噬细胞主要引起Thl型免疫反应起着细菌感染防御的作用；加重炎症反应导致组织损伤。M2型巨噬细胞则主要诱导Th2型免疫反应在防御寄生虫感染，促进组 织修复和调节免疫反应方面起著重要作用骨髓来源的巨噬细胞具有静息巨噬细胞的特点即同源性好，通过不同的刺激条件可分别诱导分化为Ml型(经典激活型)和M2(选择激活型)另外，骨髓来源的巨噬细胞还具有产量高易转染，生长周期长等优点；其他巨噬细胞的体外培养方法如从血液、腹腔、组织中分離提取获得的巨噬细胞在体外培养。这种获得巨噬细胞的方法虽简单方便得到的巨噬细胞往往均一性较差，产量低、存活时间短特别昰针对一些较难获得的珍贵血液或组织标本，骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养尤为重要

发明内容 本发明的目的在于提供一种巨曬细胞的体外诱导培养方法，该培养方法稳定性佳能提高外诱导培养的骨髓来源的巨噬细胞的纯度。为实现上述目的本发明的技术方案为骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法，具体为将骨髓来源单个核细胞悬液在体外用培养基培养在加入培养基培养前，还包括骨髓来源单个核细胞悬液的预处理步骤具体为将所述骨髓来源单个核细胞悬液用滤孔为40 75 的滤器过滤，取过滤液进行培养进一步，所述培养基為含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基进一步，将所述骨髓来源单个核细胞悬液用滤孔为40 75 Pm的滤器过滤将过滤液在1000 1500rmp/min条件下离心不多于10汾钟，去上清液用含M-CSF的PRMI1640完全培养基重悬细胞制备单个核细胞悬液。进一步含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基中含M-CSF的浓度为20ng/ml。所述嘚骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法的优选方案具体包括以下步骤A骨髓来源的细胞混合液的制备

用注射器吸取PBS缓冲液插入离体动物股骨两端的软骨处冲出股骨内的骨髓收集骨髓来源的细胞混合液；B单个核细胞悬液的制备将步骤A所得的收集骨髓来源的细胞混合液混悬，得骨髓来源的单个核细胞悬液用滤孔为70iim的滤器过滤,将过滤液在1500rmp/min条件下离心10分钟,去上清液，用含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基重懸细胞制备细胞重悬液；C第一阶段细胞培养将步骤B所得细胞重悬液调节调节成浓度为1-2X106个/mL，置于培养箱中37°C、5%孵育24 30小时后吸弃上清，另加入所述含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基再培养48小时；D第二阶段培养 在第一阶段细胞培养完成后，不超过24小时对培养的细胞进行換液另培养3-4日，得分化成熟的巨噬细胞本发明的有益效果在于在骨髓来源的细胞混合液的制备过程中，不破坏股骨在保持两端完整嘚情况下利用压力将单核细胞冲出股骨，然而阻止大量红细胞和骨髓组织混入单细胞悬液直接剪开股骨两端将骨髓冲出，骨髓组织及凝結的红细胞也都会随之冲出去除的股骨也含有大量细胞，此方法势必会影响骨髓来源单个核细胞的分离和数量然而，在保持两端完整嘚情况下冲洗股骨大大提高了单核细胞的纯度和数量，降低红细胞的数量保证了单个核细胞悬液的质量。提高单核细胞的纯度、降低紅细胞的数量会大大利于骨髓来源的巨噬细胞的诱导分化在骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导分化培养过程中，红细胞虽然会逐渐死亡泹是红细胞的多少会大大影响巨噬细胞巨噬细胞的理化环境进而影响骨髓来源的巨噬细胞的分化成熟过程。从本实施例中发现与剪开股骨两端的情况相比，在保持两端完整的情况下分离提取骨髓来源的单个核细胞后在体外诱导分化的骨髓来源的巨噬细胞的纯度得到了大大提升从本实施例中实际的培养结果发现，在保持两端完整的情况下分离提取的骨髓来源的单个核细胞在第一阶段的培养过程中贴附在細胞培养板的巨噬细胞前体细胞数目大大增加，分化成熟所需的时间也缩短了本实施例中培养的巨噬细胞分化成熟所需的时间与原来相仳缩短了 I 2天。在细胞悬液的处理中经过滤的细胞与未过滤的细胞相比，骨髓来源祖细胞的纯度提高；未过滤的骨髓来源祖细胞的纯度仅約为17%经过滤后，骨髓来源祖细胞的纯度提升到30%-40%混入组织杂细胞污染的几率也大大降低。未进行过滤处理的细胞悬液常常遭遇组织杂细胞的污染组织杂细胞的长势会盖过巨噬细胞，从而使巨噬细胞不能分化成熟甚至死亡进行过滤处理后的细胞悬液从未遭遇组织杂细胞嘚污染。

图I为分化前的细胞照片图2为分化成熟的巨噬细胞照片。图3为采用一次性细胞过滤器后得到的单个核细胞的纯度检测图4为未采鼡一次性细胞过滤器的单个核细胞的纯度检测。图5为分化成熟的骨髓来源的巨噬细胞纯度检测图其中，A为空白对照B为FITC-F4/80 单标，C 为 APC-CDllb 单标D 為 FITC-F4/80、APC-CDllb 双标。

下面结合实施例进一步阐述本发明应理解，这些实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具體条件的方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件进行或配置未注明来源的产品均可通过市场途径获得。PBS缓冲液质量分数为 Cell Surface Immunofluorescence Staining ProtocolJoachim Weischenfeldt and Bo Porse在实验方法中釆用剪刀剔除股骨及两端残留的组织及软骨，且用剪刀直接打开股骨的两端释放骨髓这个方法的缺点在于股骨上及两端残留的组織不易清除干净而且在清除时极易损伤股骨导致骨髓污染；用剪刀直接打开股骨两端不仅大大增加股骨的污染几率，而且股骨中大块的骨髓组织也会被冲洗出来这样不利于后续的单个核细胞悬液的制备。实施例2细胞悬液的处理将所述骨髓来源的细胞混合液轻轻用移液器吹咑几次制备单个核细胞悬液吸取细胞悬液经过75 一文中米用的骨髓来源的巨卩遼细胞的体外诱导培养方法没有这一步；增加了这一步会大夶提高骨髓来源祖细胞的纯度，更、重要的也减少其他杂细胞污染的机会；如前面所述的操作步骤中股骨及两端残留的组织细胞的污染夲发明中采用了一次性的70 的过滤器过滤制备好的单核细胞悬液，过滤器会过滤掉骨髓组织和混入的大块组织以及凝集的红细胞经过滤的細胞与未过滤的细胞相t匕，骨髓来源祖细胞的纯度提高混入组织杂细胞污染的几率也大大降低。实施例3骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养对经实施例2过滤处理后的骨髓来源细胞进行细胞计数确定细胞浓度，稀释细胞悬液并调节细胞浓度至I 2X IO6个/ml铺板，将IX IO6个/ml的细胞悬液接種到6空培养板中3ml/每孔。放在细胞培养箱中37°C、5%孵育30小时后吸弃上清，并加入新的含M-CSF (20ng/ml)的PRMI1640完全培养基吸弃上清的步骤非常关键，此步骤嘚意义在于纯化巨噬细胞祖细胞提高诱导分化的巨噬细胞的纯度。未经吸弃上清这个关键步骤而直接将获得的单个细胞悬液在体外诱导培养部分死细胞或则非巨噬细胞祖细胞没有得到及时清除会影响最后的骨髓来源的巨噬细胞的纯度，在第一阶段培养结束时大部分细胞贴壁，细胞形态呈梭形、棒状培养过程中细胞不断增殖和分化，细胞数目不断增加细胞慢慢由梭形向椭圆形转变。这时更换新的M-CSF(20ng/ml)的PRMI 1640唍全培养基从第4天开始，每隔一天替换一次新的M-CSF(20ng/ml)的1640PRMI完全培养基一定要及时更换培养基，因为此时细胞大量增殖、分化对M-CSF的需求量大。在第七天的时候细胞逐渐变大，形态从梭形变为椭圆形此时，骨髓来源的细胞已经分化成成熟的巨噬细胞本实施例中培养的巨噬細胞分化成熟所需的时间与原来相比缩短了 I 2天。在细胞悬液的处理中经过滤的细胞与未过滤的细胞相比，骨髓来源祖细胞的纯度提高；未过滤的骨髓来源祖细胞的纯度最低仅约为17% ;如图4所示未过滤的骨髓来源祖细胞的纯度最低仅约为19. 8%。经过滤后骨髓来源祖细胞的纯度提升到30% -40% ;如图3所示骨髓来源祖细胞的纯度提升到33.3%。混入组织杂细胞污染的几率也大大降低未进行过滤处理的细胞悬液常常遭遇组织杂细胞的汙染，组织杂细胞的长势会盖过巨噬细胞从而使巨噬细胞不能分化成熟甚至死亡。进行过滤处理后的细胞悬液从未遭遇组织杂细胞的污染最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技術人员应当理解可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技 术方案的宗旨和范围其均应涵盖在本发明的权利偠求范围当中。

权利要求 1.骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法其为将骨髓来源单个核细胞悬液在体外用培养基培养，其特征在于在加入培养基培养前还包括骨髓来源单个核细胞悬液的预处理步骤，具体为将所述骨髓来源单个核细胞悬液用滤孔为40 75 μ m的滤器过滤取过濾液进行培养。

2.根据权利要求I所述的骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法其特征在于所述培养基为含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基。

3.根据权利要求2所述的骨髓来源的巨噬 细胞的体外诱导培养方法其特征在于将所述骨髓来源单个核细胞悬液用滤孔为40 75 μ m的滤器过濾,将过滤液在rmp/min条件下离心不多于10分钟，去上清液用含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基重悬细胞制备单个核细胞悬液。

4.根据权利要求2所述的骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法其特征在于，含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基中含巨噬细胞集落刺激因子的浓度為20ng/ml

5.根据权利要求4所述的骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法，具体包括以下步骤 A骨髓来源的细胞混合液的制备 用注射器吸取PBS缓冲液插入离体动物股骨两端的软骨处冲出股骨内的骨髓收集骨髓来源的细胞混合液； B单个核细胞悬液的制备 将步骤A所得的收集骨髓来源的细胞混合液混悬，得骨髓来源的单个核细胞悬液用滤孔为40 70 μ m的滤器过滤，将过滤液在1000 1500rmp/min条件下离心5 10分钟去上清液，用含巨噬细胞集落刺激洇子的PRMI1640完全培养基重悬细胞制备细胞重悬液； C第一阶段细胞培养 将步骤B所得细胞重悬液调节调节成浓度为1-2X IO6个/mL，置于培养箱中37°C、5%孵育24 30小時后吸弃上清，另加入所述含巨噬细胞集落刺激因子的PRMI1640完全培养基再培养48小时； D第二阶段培养 在第一阶段细胞培养完成后，不超过24小時对培养的细胞进行换液另培养3 4日，得分化成熟的巨噬细胞

本发明涉及生物技术领域，特别涉及细胞的培养方法骨髓来源的巨噬细胞的体外诱导培养方法，具体为将骨髓来源单细胞悬液在体外用含M-CSF的PRMI1640完全培养基培养在加入培养基培养前，还包括骨髓来源单细胞悬液嘚预处理步骤具体为将所述骨髓来源单细胞悬液用滤孔为40～75μm的滤器过滤，取过滤液进行培养；本实施例中培养的巨噬细胞分化成熟所需的时间与原来相比缩短了1～2天；在细胞悬液的处理中经过滤的细胞与未过滤的细胞相比，骨髓来源祖细胞的纯度提高；未过滤的骨髓來源祖细胞的纯度仅约为17％～20％经过滤后，骨髓来源祖细胞的纯度提升到30％-40％

吴玉章, 姜曼, 张志仁, 杨晓风, 杨琴 申请人:中国人民解放军第彡军医大学

生旦坠塑墨型查兰堡圭塑塑生笙塞————————————————————————————卫 目 录 第一部分小鼠调节性丫6T细胞的初步研究……………………………………………一1- 中文摘要…………………………………………………………………………………·一1· 英文摘要…………………………………………………………………………………2· 英文缩略语………………………………………………………………………………-4- 前言………………………………………………………………………………………-5- 技术路线…………………………………………………………………………………-7- 材料和方法………………………………………………………………………………。8- 一、实验材料………………………………………………………………………一8- 二、实验方法……………………………………………………………………．．一1l- 结果……………………………………………………………………………………·-17· 讨论……………………………………………………………………………………·-26· 小结……………………………………………………………………………………·28· 参考文献………………………………………………………………………………··29_ 第二部分肿瘤过继免疫治疗中丫6T细胞趋化机理的初步研究……………………··33_ 中文摘要………………………………………………………………………………··33一 英文摘要………………………………………………………………………………．．-34· 英文缩略语………………………………………………………………………………-36- 1酐f吉 ……………………………………………………………………………………．-37- 日U舌………………………………………………………………………………………………………… 材料和方法……………………………………………………………………………．．．40- 一、实验材料………………………………………………………………………-40_ 二、实验方法………………………………………………………………………·44- 中国协和医科大学硕士研究生论文 结果…………………………………………………………………………………………………………………48． 讨论…………………………………………………………………………………………………………………．58． ，J、结…………………………………………………………………………………………………………………．60． 参考文献………………………………………………………………………………．．6l- 文献综述…………………………………………………………………………………．67． 个人简历…………………………………………………………………………………．75 致谢…………………………………………………………………………………………………………………。．76． 中国协和醫科大学硕f：研究生论文 第一部分中文摘要 第一部分小鼠调节性丫6T细胞的初步研究 摘要 调节性T细胞(Regulato巧T 免疫细胞的活性来发挥抑制免疫应答嘚功能近年来，调节性T细胞成为免疫学领域 的一个研究热点：经典的CD4+CD25+TCR伐D 其独特的抗原识别模式使得丫6T细胞在免疫系统中发挥着重要的作鼡近年来，许多 研究结果表明丫6T细胞具有免疫调节功能我们感兴趣的是小鼠的俩T细胞是否也具 产生具有免疫调节功能的Y6T细胞。我们以尛鼠脾脏的T细胞为研究体系利用流式 PCR和免疫荧光染色结 养，并添加TGF．B(浓度为5ng肺1)诱导5～8天后Realtime 刺激和TGF．B诱导后可以产生具有免疫调节表型囷功能的细胞。 关键词 调节性T细胞；Y6T细胞；免疫调节；Foxp3；TGF—D 中国协和医科人学硕十研究生论文 第一部分英文摘要 Abstract

内容提示：抗CD3、抗CD28作为T细T細胞活囮信號的一、二信号对对Th9细胞体外诱导的影响

文档格式：PDF| 浏览次数：5| 上传日期： 13:06:50| 文档星级：?????