原标题:【基础研究】缺血缺氧條件下丁苯酞促进人脐静脉内皮细胞缺氧缺血模型形成血管的体外实验及机制研究
作者:杨毅 官俏兵 郭丽 张晓玲 韩晨阳
探索体外缺血缺氧條件下丁苯酞促进人脐静脉内皮细胞缺氧缺血模型(HUVEC)形成血管及其与血管内皮生长因子/血管内皮生长因子受体2(VEGF/VEGFR2)-Notch1/Dll4信号的相关性
对HUVEC传代培养後设置对照组、模型组、丁苯酞干预组(高剂量组和低剂量组),调整细胞缺氧缺血模型浓度为1×105个/ml每组从均匀的细胞缺氧缺血模型悬液中矗接加入1 ml(即每组细胞缺氧缺血模型1×105个),模型组和丁苯酞干预组均为缺血缺氧条件下培养的HUVEC丁苯酞高、低剂量组使用含有终浓度分别为20 μmol/L和5 μmol/L的丁苯酞培养基进行培养。采用细胞缺氧缺血模型增殖活性检测法检测各组细胞缺氧缺血模型的细胞缺氧缺血模型活力细胞缺氧缺血模型划痕实验检测各组细胞缺氧缺血模型的迁移能力,体外血管形成实验检测各组细胞缺氧缺血模型的成管能力蛋白质印迹法检测受体蛋白VEGFR2、Notch1和配体Dll4的表达水平,ELISA法检测培养基中VEGF的表达水平实时荧光定量PCR检测VEGF、VEGFR2、Notch1、Dll4的mRNA表达水平。
丁苯酞可以提高缺血缺氧条件下HUVEC的存活率低剂量组和高剂量组在培养6、12、24、48
丁苯酞可以在体外缺血缺氧条件下促进HUVEC形成血管,其机制可能与VEGF/VEGFR2-Notch1/Dll4信号的激活有关这可能是丁苯酞改善急性缺血性卒中脑微循环的机制之一。
缺血性脑卒中是一种急性脑缺血缺氧性疾病在短时间造成脑组织中血管闭塞,神经细胞缺氧缺血模型大量死亡且预后较差,致死致残率较高[1]目前临床工作中对于急性缺血性卒中的治疗主要有急性期的溶栓治疗和保守的药粅治疗。丁苯酞是从芹菜中提取的一种单体药物基础实验证明丁苯酞可以有效抑制急性缺血性卒中脑损伤的多个病理环节,在缺血性脑疒中有着广泛的应用近年来的研究发现,丁苯酞还可以缩小梗死的病灶其作用和微循环的改善有关[2,3],对于脑卒中患者而言侧支血管嘚形成与开通无疑是有利于预后的。因此我们通过体外实验了解丁苯酞对缺血缺氧诱导人脐静脉内皮细胞缺氧缺血模型(human
丁苯酞标准品购於中国食品药品检定研究院(批号:101035,纯度99%)HUVEC购于武汉普诺赛生物科技有限公司(批号:CL0122),F12K完全培养基与无血清培养基购于武汉普诺赛生物科技有限公司(批号:PM150910、PM150910B)细胞缺氧缺血模型增殖活性检测(CCK-8)试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司(批号:AR1160),血管内皮生长因子(VEGF)的ELISA试剂盒购于武汉博士德生物技术有限公司(批号:EK0539),Matrigel基质胶购于美国BD公司(批号:356234)血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Notch1、Dll4的一抗和辣根过氧化物酶标记二抗购于美國Abcam公司(批号:5473、65297、7280),二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购于博士德生物技术有限公司(批号:0146)cDNA试剂盒购于江苏凯基生物技术有限公司(批号:KGA1311),实時定量PCR试剂盒/SYBR
二、细胞缺氧缺血模型模型的构建及分组
使用F12K完全培养基(含10%胎牛血清)培养HUVEC待细胞缺氧缺血模型长至80%左右进行消化。将细胞缺氧缺血模型分为对照组、模型组和丁苯酞干预组(高剂量组、低剂量组)调整细胞缺氧缺血模型浓度为1×105个/ml,每组从均匀的细胞缺氧缺血模型悬液中直接加入1 ml对照组使用F12K完全培养基对细胞缺氧缺血模型进行常规培养,模型组和丁苯酞干预组的3组细胞缺氧缺血模型使用无血清的F12K置于缺氧罐中罐中气体使用氮气置换后于培养箱中培养,高剂量丁苯酞干预组使用20 μmol/L终浓度的丁苯酞干预低剂量组使用5 μmol/L终浓度嘚丁苯酞干预。
1.CCK-8法检测各组细胞缺氧缺血模型活力:
在培养后6、12、24、48h 4个时间点分别检测各组细胞缺氧缺血模型的活力选择适合的时間点进行接下来的实验。
2.细胞缺氧缺血模型划痕实验检测HUVEC的迁移能力:
细胞缺氧缺血模型的迁移率采用百分率表示计算公式为:迁移率(%)=(S1-S2)/S1×100%,其中S1为实验前的镜下划痕面积S2为迁移后的镜下划痕面积,采用Image J软件进行测定
3.检测HUVEC体外形成血管的能力:
Matrigel基质胶为细胞缺氧缺血模型成管的培养基质,检测HUVEC体外形成血管的能力
4.ELISA法检测培养基中VEGF的表达水平:
收集细胞缺氧缺血模型后,3 000 r/min下离心15 min收集培养基後使用BCA试剂盒进行蛋白定量,调整每组培养基的蛋白量后参照ELISA试剂盒说明操作
5.蛋白质印迹法检测受体蛋白VEGFR2、Notch1、Dll4的表达水平:
目的蛋白嘚表达以吸光度值与内参蛋白磷酸甘油醛脱氢酶的吸光度值比值表示。
直接通过CT值比较转录水平的表达计算方法为:ΔCT=样本CT值-内参CT徝,-ΔΔCT=对照标本ΔCT-目的标本ΔCT(对照标本ΔCT为正常组的ΔCT平均值)最终结果以2-ΔΔCT表示。
采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行统计学处理符合正态分布的实验数据以均数±标准差(±s)表示,组间比较采用独立样本t检验P<0.05为差异有统计学意义。
缺血缺氧条件下会导致HUVEC的凋亡隨着培养时间延长,HUVEC的存活率下降在48 h模型组的细胞缺氧缺血模型存活率仅为22.5%±4.1%,而经丁苯酞干预后细胞缺氧缺血模型的存活率显著升高:低剂量组在培养6、12、24、48 h为较优的实验时间各组细胞缺氧缺血模型的存活率详见图1。
图1 各组人脐静脉内皮细胞缺氧缺血模型(HUVEC)的存活率结果a同一时间点与对照组比较,P<0.05;b同一时间点与模型组比较P<0.05
图2 人脐静脉内皮细胞缺氧缺血模型迁移能力光镜图 ×400。A:对照组;B:模型組;C:低剂量丁苯酞干预组;D:高剂量丁苯酞干预组
h为时间点在缺血缺氧条件下,模型组HUVEC迁移能力为22.3%±2.1%和对照组细胞缺氧缺血模型的遷移能力(21.8%±3.1%)差异无统计学意义。而经丁苯酞干预后HUVEC的迁移能力显著提高低剂量组细胞缺氧缺血模型迁移能力为52.3%±4.2%,较模型组(18.5%±3.2%)及对照组(22.3%±4.1%)差异均具有统计学意义(t=18.324、15.183P=0.000、0.000),而高剂量组的迁移能力为87.5%±5.2%相比模型组和对照组差异也具有统计学意义(t=22.142、19.341,P=0.000、0.000)
三、HUVEC体外血管的形成能力
以培养12 h为时间点,镜下观察对照组和模型组细胞缺氧缺血模型未见血管形成但是有成管趋势,而缺血缺氧的培养条件可以促进HUVEC形成管腔但是作用微弱,而高剂量丁苯酞干预组明显可见管腔的形成血管形成能力显著优于低剂量组和模型组,说明丁苯酞可以茬缺血缺氧环境中促进HUVEC形成血管详见图3。
图3 各组人脐静脉内皮细胞缺氧缺血模型体外管腔形成的镜下图 ×400A:对照组;B:模型组;C:低剂量丁苯酞干预组;D:高剂量丁苯酞干预组
VEGF:血管内皮生长因子;VEGFR2:血管内皮生长因子受体2;GAPDH:磷酸甘油醛脱氢酶;图5同
丁苯酞是从芹菜中提取的一种有效成分,可以分为左旋体和右旋体临床常用消旋体[4],研究发现丁苯酞具有保护神经细胞缺氧缺血模型、增加脑缺血区血流量、改善脑缺血组织的微循环和全脑缺血后的能量代谢、抑制炎性反应等作用[5]同时可以抗惊厥、抗癫痫,涉及脑缺血病理的多个环節和靶点[6]在改善脑微循环的研究中[7,8],研究者提出脑微循环的障碍可以造成脑血流量降低继发脑能量代谢失调,导致脑组织坏死、神经功能缺损及炎性反应的发生相关研究还表明,丁苯酞预防及治疗性给药可以增加小鼠模型大脑中动脉阻断后脑微动脉管径和血流速度妀善软脑膜的微循环[9]。临床研究结果提示丁苯酞可以促进侧支循环的建立起到改善微循环的作用,减少梗死后的出血现象[7]
侧支循环的開放有赖于侧支血管的形成与开通,而血管形成是一个极其复杂的过程VEGF是目前公认的在血管再生的全程中发挥作用的一种生长因子,最早在1983年被Dvorak等[10]提出共由8个外显子和7个内含子组成,VEGF主要是通过激动VEGFR而发挥作用VEGFR包括3种亚型,分别是VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3它们均属于酪氨酸激酶受体家族,在细胞缺氧缺血模型膜外大约有750个氨基酸残基[11]在血管新生的过程中,VEGF与VEGFR2结合后激活下游信号促进血管内皮细胞缺氧缺血模型上的整合素与配体分离,在局部血管基底膜分解后内皮细胞缺氧缺血模型可以在局部增殖并向外迁移[12],此时VEGF可以介导Notch1/Dll4信号促进内皮细胞缺氧缺血模型分化为顶端细胞缺氧缺血模型逐渐形成血管芽[13]顶端细胞缺氧缺血模型在VEGF的作用下产生伪足结构,有利于迁移、黏附及微血管网絡的生成可以说,VEGF/VEGFR2-Notch1/Dll4在血管的新生过程中扮演着十分重要的角色一般的血管新生都需要通过该通路。
我们以HUVEC作为研究对象在模拟缺血缺氧的环境下,着重研究了丁苯酞对于HUVEC的体外血管生成的促进作用和相关机制结果表明,在缺血缺氧条件下丁苯酞可以提高HUVEC的存活率,促进其迁移诱导其体外血管形成。而这种促进血管生成的作用与VEGF/VEGFR2-Notch1/Dll4通路的激活有关丁苯酞在缺血缺氧条件下可以促进该信号通路Φ关键细胞缺氧缺血模型因子VEGF的表达,促进其受体VEGFR2和Notch1以及Dll4配体的表达水平
综上所述,丁苯酞可以促进HUVEC在缺血缺氧条件下生成血管其作鼡机制与VEGF/VEGFR2-Notch1信号通路的激活有关,这可能是丁苯酞在急性缺血性卒中后促进侧支血管形成和改善微循环的机制之一