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第三章 分子克隆的载体
第三章 分子克隆的载体? 载体的功能及特征 ? 质粒（plasmid）? 噬菌体或病毒DNA ? 考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 ? 人造染色体载体1?载体的功能及特征?载体的定义将外源DNA或基因携带入宿主细胞的 工具称为载体(vector)<
br />2?载体的功能? 运送外源基因高效转入受体细胞 ? 为外源基因提供复制能力或整合能力 ? 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件3?载体的特征?分子较小，可携带比较大的DNA片段。 ?能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 ?要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制 酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。 ?有合适的选择标记，易于筛选。 ?有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。 ?从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。4?基因克隆利用重组DNA技术分离目的基因，称为基因 克隆(gene clone) 克隆(clone)动词：指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程。 名词：指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群 遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所 组成的特殊的群体。5?基因文库genelibrary由大量的含有基因组DNA（即某一生物的全部 DNA序列）的不同DNA片段的克隆所构成的群 体，称为基因文库(gene library)6载体的分类功能克隆载体:克隆一个基因或DNA片段 表达载体:用于一个基因的蛋白表达 整合载体:把一个基因插入到染色体 组中7来源：质粒载体plasmid噬菌体载体phage 柯斯质粒载体cosmid真核细胞克隆载体8载体的种类和特征载体种类 质粒* 受体细胞 E.coli 结构 环状 插入片断 ＜8* 9 - 24kb ＜10 kb 35- 45kb ≈300 kb 举例 pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， λ gt系列 M13mp系列 pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV Pel oBAC系列 PCYPAC1λ噬菌体丝状噬菌体及噬菌粒 粘粒载体 BAC (Bacterial Artificial Chromosome) PAC (P1-derived Artificial chromosome)E.coliE.coli E.coli线状环状 环状E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类 细胞 动物细胞 动物细胞 和细菌环状 环状 线性染色体 线性染色体 环状 环状100 - 2000 kb 100 - 2000 kb ＞1000 kbYAC (Yeast Artificial chromosome )MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 病毒载体 穿梭载体SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 pSVK3质粒，PBV, Ti质粒 9第一节质粒（plasmid）载体?10一、质粒的基本特征1.质粒的基本概念?质粒是一种独立于染色体外的遗传因子，可自身复 制和表达（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）?大多数为超螺旋的双链共价闭合环状分子DNA (coverlently closed circle DNA, cccDNA) ,少数为线性 ?大小为1-200kb，也有更大 ?常见于原核细菌和真菌中11一、质粒的基本特征质粒的表型：抗生素的抗性，产生抗生素、降解复 杂有机化合物、产生毒素（如大肠杆菌素、肠毒 素）、合成限制性内切酶和修饰酶、生物固氮和杀 虫等12? 克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA 水平上的操作。 ? 基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、 储存和表达。13质粒DNA的构型： SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（（open circular DNA, ocDNA） L 型 线性DNA（linear DNA,LDNA） 作为载体的质粒都含有三种共同的组分： 复制基因（replicator） 选择性记号 克隆位点14LOCSC152.质粒的基本特征 1）质粒的自主复制性? 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复 制? 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对 应关系 ? 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质 粒可分为两大复制类型：? 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 relaxed plasmid ? 严紧型复制控制的质粒 1 - 3 拷贝 stringent plasmid162）质粒的不相容性plasmids incompatibility是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质 粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在第二个质粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现 象。质粒的不相容性分子基础，主要是由于它们在复制功 能之间的相互干扰造成的。 不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存 于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时， 在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异 最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。不相容群指那些具有不相容性的质粒组成的一个群体，一般 具有相同的复制子。在大肠杆菌中现已发现 30 多个不相 容群，如 ColE1 和 pMB1 ， pSC101 和 p15A。17AB183）质粒的可转移性transferring 在自然条件下，很多质粒可通过称为细菌接合 （conjugation）的作用转移到新的宿主细胞内。 要素：移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。194）携带特殊的遗传标记野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记 基因，这是寄主生物产生正常生长非必需的附加 性状，包括： ? 物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离 子、有机物 ? 物质合成 抗生素、细菌毒素、有机碱这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义21标记基因marker gene? 选择标记基因selective marker gene用于鉴别目标DNA的存在，将成功转化了质粒的 宿主挑选出来 抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记22?氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene, ampr） ?四环素抗性基因（Tetracycline resistance gene,tetr） ?氯霉素抗性基因（chloramphenicol resistance gene, Cmr, cat）?卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycinresistance gene, kanr, neor）23?琥珀突变抑制基因 supF 在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终 止密码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为 UAA），或琥珀突变（突变为 UAG），或乳白突变 （突变为 UGA）。supF 基因编码细菌的抑制性 tRNA ，可在 UAG 密码子上编译酪氨酸。如果在某一宿主中含具琥珀突变的tetr 基因和 ampr 基因，只有当宿主含有 supF 基因时才会对 Amp 和 Tet 具有抗性。24?正向选择标记，表达一种使某些宿主菌致死的基因 产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。 如蔗糖致死基因 SacB ，来自淀粉水解芽胞杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ，编码果聚糖蔗糖酶。 在含蔗糖的培养基上 sacB 基因的表达对大肠杆菌来 说是致死的，因此该基因可用于插入失活筛选重组子。25? 筛选标记基因主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外 源 DNA 片段插入到一个质粒载体上时，可通 过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重 组质粒。α-互补 ?插入失活?26?α-互补α-互补是指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变 体与带有完整的近操纵基因区段的 β-半乳糖苷酶（β galactosidase ，由 1024 个氨基酸组成）阴性的突变体 之间实现互补。α-互补是基于在两个不同的缺陷 β半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。27lacZ 基因是乳糖 lac 操纵子中编码 β-半乳糖苷酶的 基因，乳糖及其衍生物可诱导其表达。 乳糖既是 lac 操纵子的诱导物，也是作用的底物。 IPTG：异丙基-β-D- 硫代半乳糖苷，乳糖的衍生物， 可作为 lac 操纵子的诱导物，但不能作为反应的底 物； X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，可作为 lac 操纵子的底物，但不能作为诱导物。 X-gal 可作生色剂，被 β-半乳糖苷酶分解后可产生 兰色产物，可使菌落或噬菌斑呈兰色。28乳糖操纵子(lac operon)的结构调控区 DNA 结构基因PO操纵序列ZYAZ： β-半乳糖苷酶启动序列Y： 透酶A：乙酰基转移酶29调节基因功能 互补3031?插入失活通过插入失活进行筛选的质粒主要有 pBR322 ， 该质粒具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素 抗性基因（ampr）两种抗性标记。当外源 DNA 片段插入 tetr 基因后，导致 tetr 基因 失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通 过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片 段插入到载体中。3233二、质粒载体的种类1. pBR322之前 天然质粒：没有经过以基因克隆为目标的体 外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天 然质粒有EolE1、RSF2124和pSC101等， 但存在一定的局限性。分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、 遗传标记不理想等34转化效率与质粒大小成反比，质粒＞15kb， 转化效率成为限制因素质粒越大，越难用限制性酶切进行鉴定。 质粒越大，拷贝数越低352. pBR322之后 调整载体的结构，提高载体的工作效率 pBR322 pUC系列质粒 ? 去掉多余片段，提供多克隆位点，筛选标 记 ? 增加辅助功能，表达载体（expression vector），穿梭载体（shuttle vector）363.克隆载体1）pBR322质粒载体? 松弛型复制? 氯霉素可扩增? 拷贝数 50 - 100 / cell ? 用于基因克隆 以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个 选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或 AmpsTetr的重组子，可通过插入失活来进行筛选37382）pUC18/19质粒载体? 来自pBR322 ? 拷贝数 2000 - 3000 / cell ? 装有多克隆位点（MCS） ? 正选择颜色标记 lacZ’ ? 用于基因克隆和测序α-互补39403）pUC118/119质粒载体由 pUC18/19 增加了一些功能片段改造而来，大 小为 3162bp ，相当于在 pUC18/19 中增加了带 有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包 装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。用途：制备单链DNA 用于: DNA序列测定、定点诱变、制备探针414）pGEM-3Z/4Z质粒载体由 pUC18/19 增加了一些功能片段改造而来，大 小为 2.74kb 与 pUC18/19 相比，在多克隆位点的两端添加了 噬菌体的转录启动子，如 Sp6 和 T7 噬菌体的启 动子。 pGEM-3Z 和 pGEM-4Z 的差别在于二者互换了 两个启动子的位置。 用途：体外转录得到RNA，用于体外蛋白质的 合成或用作克隆邻近DNA片段的探针42435）多功能质粒载体在上述载体的基础上，人们设计出一些多功能的质粒载 体，这类质粒载体综合了以上质粒的特点。 除了作为质粒载体基本要素外，综合了上述功能要素， 如多克隆位点、 α-互补、噬菌体启动子和单链噬菌体 的复制与包装信号。 典型的这类质粒有 pBluescriptⅡKS（±），这类质粒 一般由 4 个质粒组成一套系统，其差别在于多克隆位 点方向相反（根据多克隆位点两端 KpnⅠ 和 SacⅠ 的 顺序，用 KS 或 SK 表示），或单链噬菌体的复制启始 方向相反（或者说，引导 DNA 双链中不同链合成单链 DNA ，用 + 或 - 表示）44454.表达载体expression vector该类载体是在常规克隆载体的基础上衍 生而来的，主要增添了强启动子，以及 有利于表达产物分泌、分离或纯化的元 件，如PET系列载体。详细情况见后文4647第二节λ噬菌体载体 λ phage vectors48头部 C、B、D、E分别 指相应基因编码 的颗粒蛋白尾管尾锥 尾丝49一、λ噬菌体的分子生物学λ噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染 宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。基因组 双链 DNA 分子，实际大小为 48502bp在噬菌体颗粒内，基因组 DNA 呈线性，其两端的 5’末端带有 12 个碱基的互补单链（粘性末端）50当 ??噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单 链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，而后在宿主 细胞的 DNA 连接酶和旋促酶（gyrase）作用下， 形成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板 此时，???噬菌体可选择进入裂解生长状态（lytic growth），大量复制并组装成子代???噬菌体颗粒， 导致宿主细胞裂解。经过 40～45min 的生长循环， 释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒（每个细胞）或者进入溶源状态（lysogenic state），将?噬菌体 基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主的染 色体 DNA 中，并随宿主的繁殖传给子代细胞51感染周期/溶原52溶源阶段(整合到寄主 染色体上)裂解阶段(复制和释放)53?噬菌体基因组至少可编码 30 个基因，它们的分布和排 列与其功能有一定关系 根据执行功能的不同可将基因组分为三个区： 左边区域包括从基因 Nu1 到基因 J 之间的基因，其产 物用于噬菌体 DNA 的包装和噬菌体颗粒的形成。 中间区域（基因 J 右边至 gam）编码基因调节、溶源状 态的发生和维持以及遗传重组所需要的基因。其中许多 基因对裂解生长是非必须的，在构建载体时可以去掉， 用外源 DNA 片段替代。右边区域（基因 gam 右边至基因 Rz） 包含噬菌体复制 和裂解宿主菌所必须的基因。54λ噬菌体生物学特性： 生物结构 溶菌控制基因 晚期控制基因cos头部合成基因DNA合成控制基因阻遏基因 早期控制基因 阻遏基因 重组基因 删除与整合基因 3’ 5’ TCCAGCGGCGGGG λ- DNA尾部合成基因COSCCCGCCGCTGGA 5’3’COS5556（一）λ噬菌体的发育调节1．吸附（adsorption） 2．立即早期转录（immediate early transcription） 3．延迟早期转录（delayed early transcription） 4．溶源和裂解的感染分化 5．进入裂解生长 6．溶源化57（二）λ噬菌体的可取代区在溶源状态，λ噬菌体 DNA 整合在半乳糖代谢 基因 gal 和生物素合成基因 bio 之间。 λ噬菌体在某些条件下，会从宿主染色体上切离 出来，进入裂解循环。切离和整合是相互对立的 过程，在不同重组酶的作用下，导致切离或整合 的发生。581.区域溶源化?噬菌体的正确切离―正常?噬菌体不正确切离―不正常?噬菌体 gal替换或 bio替换 J 基因与 Cro 基因之间的 DNA 被 ga1 基因或 bio 基 因替换后，不影响 λ 噬菌体裂解生长。592.大小占λ噬菌体 DNA 的 1/3 ，主要包含控制λ噬菌体进 入溶源状态的调节基因和功能基因。60% 区域为裂解生长所必须的，左臂：约 20kb ，含有编码噬菌体头部和尾部蛋白 的基因，即从基因 A 至基因 J 的区域右臂：约为 8-10kb ，从 PR 启动子到右侧 cos 位点 可插入的外源DNA片段大小为9-23kb60二、λ噬菌体的选择标记1．基因组大小 λ 噬菌体的遗传学研究发现，重组 λ 噬菌体的基 因组 DNA 太大或太小会影响其存活能力。当基因组 DNA 长度为野生型 λ 噬菌体基因组 DNA 的78～105% 时，不会明显影响存活能力。野 生型 λ 噬菌体基因组 DNA 为 48kb ，若用外源 DNA 片段完全替换可取代区，外源 DNA 片段的大 小将在 9-23kb 范围内。612．lacZ 基因 lacZ 基因也可用于 λ 噬菌体载体，通过插入或替 换载体中的 β-半乳糖苷酶基因片段，在 IPTG/X-gal 平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体。623．基因 cⅠ 失活 p52cⅠ基因的表达促进 λ 噬菌体进入溶源状态，基因 cⅠ产 物活性受到影响会促进 λ 噬菌体进入裂解循环。?hfl+ E.coli 中，λ噬菌体可高效率地进入溶源状态。 ?hfl- E.coli 中，基因 c Ⅱ（基因 cⅠ 的正调节物）产物累 积到较高水平。hfl -可增加基因 cⅠ 的产物，从而使裂解生 长受到抑制，高效地进入溶源状态。 ?外源 DNA 片段插入基因 cⅠ 中，将高频率地使 hfl - E.coli 进入裂解生长状态。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化， 产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。 ?在构建基因文库时，可提高排除非重组噬菌体的效率， 从而降低对基因文库进行筛选的劳动强度。63三、代表性λ噬菌体载体插入型载体（insertion vectors）：通过特定的酶切位 点允许外源 DNA 片段插入的载体置换型载体（replacement vectors）：允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段的载体 λ噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。65(一) 插入型载体：?cI基因插入失活：如λ gt10、λNM1149等载体，在cI 基因上有EcoR I的酶切位点。外源基因插入后将导致 cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原 化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。 ?lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必需区 段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入 失活后利用X-gal法筛选（蓝白筛选）。插入片段大小:6-11kb661.λgt1043340bp插入片段大小: 设计为6kb, 理论为7.6kb仅在cI基因内有一个EcoR I的酶切位点用于克隆小的cDNA而设计,外源DNA量有 限时选用较好,克隆效率高6768(二) 置换型载体：对λ噬菌体DNA进一步改造而来，去掉大多数非必需 片段，保留作为载体的?必需左臂：含与包装蛋白有关的基因?右臂：含与裂解生长有关的基因左右臂之间用一段填充片段（central stuffer） 替换与溶源循环有关的片段插入片段大小:9-23kb 主要用来构建基因组文库701. λEMBL 3/ 4大小为 43kb ，其左臂、右臂和填充片段的大小 分别为 20kb、 9kb 和 14kb 。从提高克隆效率角 度来看，克隆 DNA 片段的大小为 9-23kb 在填充片段中带有 red 和 gam 基因，当外源 片段替换填充片段后，重组体将变成 red-gam- ， 同时载体上含有 chiC 位点，因此可用 P2 噬 菌体的溶源性大肠杆菌进行 Spi 筛选重组体。 在填充片段两端带有对称的多克隆位点，这两 个载体的差别是多克隆位点的排列位置相反71722.Charon 4A大小为 45kb ，其左臂、右臂和填充片段的 大小分别为 19.5kb、 11kb 和 14.7kb用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的 Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作 为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片 段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而 后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli， 形成空斑。 置换型λ噬菌体是使用最广泛的载体。73四、λ噬菌体载体的克隆原理及步骤步骤： 1.通过裂解过程增殖载体 2.载体与外源DNA的酶切。应用适当的核酸内切 酶消化λ载体，除去可取代的DNA片段； 3.外源DNA与载体的连接。将上述所得的λDNA载 体臂同外源DNA片段连接； 4.重组噬菌体的体外包装。对重组体的λDNA分 子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重组 噬菌体 5.包装噬菌体颗粒的感染 6.筛选 74体外包装 λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经 过体外包装，然后以噬菌体感染的方式将 重组DNA导入E.coli细胞内。这是因为以感 染方式导入细胞的频率可达 106~108pfu/μgDNA，而以转染的方式导入 的频率仅为103~105pfu/ μgDNA。λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA （约48.5 kb）的78%~105%。75由于λ噬菌体包装时，当DNA的长度 短于野生型的78%或超过105%时，噬 菌体的活性就急剧下降。因此只包装 它的野生型DNA（48.5KB）的78%105%左右的DNA，要求λ载体DNA和 外源DNA长度之和在39～53kb之间。 插入式载体可携带的外源DNA片段 较置换型为小。761. 连接2.组装3.侵染77Charon 4A78根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选79104第六节 表达载体 Expression vectors主要用来使外源基因表达出蛋白质产物 注意：启动子的性质，终止子、起始密码、 终止密码的阅读正确。 如果在大肠杆菌里表达，必须把所克 隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的 转录―翻译信号控制之下。139表达载体的结构1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS2）大肠杆菌操纵子元件 阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。140141一、大肠杆菌表达载体大肠杆菌表达载体都是质粒载体。 作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求， 即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中。 在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表 达载体。各种表达载体的不同之处在于其表达元件 的差异。1421．表达融合蛋白的表达载体基因融合就是将两个或多个开放阅读框架按一定 顺序连接在一起，融合阅读框架的表达产物是一 个杂合蛋白，即融合蛋白（fusion protein）。融合蛋白有两种不同的含义?一种是通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产 物.指在基因水平将目的蛋白基因同某个高表达蛋白片段基 因相连，并在真核或原核细胞中表达出的具有上述两部分 结构域的重组蛋白 ?另一种含义就是介导两个细胞质膜融合的一组蛋白, 如 在仙台病毒脂双层外侧小叶中含有的两种糖蛋白之一,介导 病毒被膜与宿主细胞质膜的融合作用。另一种糖蛋白是血 细胞凝集素神经酰胺酶。 143144为什么要表达融合蛋白?当蛋白质表达以后，有效的分离纯化或分泌就成为获得目 标蛋白的关键因素。?通过以融合蛋白的形式表达，并利用载体编码的蛋白或多 肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。用作分离的载 体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 （fusion Tag）， fusion tag所编码的可能是整个功能蛋白或是其中的部分?常用的有谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase, GST） 、 六聚组氨酸肽（polyHis-6） 、蛋白质 A（protein A）和纤维 素结合位点（cellulose binding domain）等。?目的蛋白可连接在标签蛋白或标签多肽的氨基端或羧基端145一般融合 载体图解146（1） 表达GST融合蛋白的载体 P90GST 表达载体在启动子 tac 和多克隆位点之间加入了 两个与分离纯化有关的编码序列 ?谷胱甘肽S转移酶基因GST ?凝血蛋白酶（Thrombin）切割位点的编码序列 当外源基因插入到多克隆位点后，可表达出由三部分 序列组成的融合蛋白。 GST 是来源于血吸虫的小分 子酶（ 26kDa），在 E.coli 易表达，在融合蛋白状态 下保持酶学活性，对谷胱甘肽有很强的结合能力149150分离纯化：将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和 层析柱，当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱 时，融合蛋白将吸附在树脂内，其它细胞蛋白就被洗 脱出来。 再用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱，可将融 合蛋白释放出来。 用凝血蛋白酶切割融合蛋白，便可获得纯化的目标蛋 白。 除了凝血蛋白酶的切割位点外，其它还有 Xa 因子 （Factor Xa）和肠激酶。151（2） 利用 T7 噬菌体启动子的表达载体 p88表达载体 pET-5a 是典型的 pET 载体，其组成是在 载体的基本结构的基础上加入了 T7 噬菌体启动子序 列及其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些 酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。152153154155156（3）组氨酸标签表达载体利用组氨酸标签的表达载体有很多，在pET系列载体中也 有．如pET-16b. ?主体框架与pET-5a相似：多一个lacⅠ基因 ?主要差别：在启动子下游含有一段编码6个组氨酸His的序 列和编码Xa因子酶切位点的序列． 表达：当外源基因插入到BamHⅠ等位点后，在BL21(DE3)菌株 中可表达出带His-6标签的融合蛋白． 分离提纯：多聚组氨酸肽能与2价重金属阳离子镍离子结合， 将镍固定在树脂上，便可对带His标签的融合蛋白进行亲和层析 分析．纯化的融合蛋白再用Xa因子处理可除去标签多肽，从而 获得纯化的目的蛋白．157158（4）内含肽标签表达载体NEB发展的一套IMPACT-TWIN表达系统，将目的蛋白放在两 个可自裂解的内含肽intein中间，在得到融合蛋白之后不通过蛋 白酶水解就可将标签蛋白切除． 如载体pTWIN1，其基本结构与pET-16b相似，只是表达元件不 同．利用T7噬菌体启动子，其后依次为几丁质结合结构域 （chitin binding domain, CBD）、intein1、多克隆位点、intein2 和CBD。 Intein1 蓝细菌dnaB基因产物的微型intein，在特定pH和温度 下，在该intein C端发生水解，从而将intein与其下游的多肽序 列分开 Intein2 蟾蜍分枝杆菌gyrA基因产物或热自养烷杆菌rir1基因 产物的微型intein，可在其N端进行巯基诱导的水解，利于目的 蛋白形成二硫键 159表达和分离提纯在pTWIN1中，当外源目的基因插入多克隆位点并带 有自身的翻译终止密码子时，可表达出在目的蛋白末 端带有CBD和intein1的融合蛋白。?表达该融合蛋白的细胞抽提物流过几丁质树脂层析 柱时，融合蛋白就被吸附在树脂上? ? ?通过洗涤可将其它蛋白除去调节层析柱的pH至7.0并于室温放置，目的蛋白与 intein之间发生水解?通过洗脱便得到纯化的目的蛋白160161162（5）分泌型表达载体除了在细胞内表达外，还可让表达的蛋白分泌到 细胞外或细胞周质区中。可避免细胞内蛋白酶的降解，或使表达的蛋白正确 折叠，或去除 N-- 末端的甲硫氨酸，从而达到维护 目标蛋白活性的目的。 利用信号肽序列作为融合标签可将融合蛋白分泌 到细胞外，可利用的信号肽有碱性磷酸酶的信号肽 和蛋白质 A 的信号肽。163表达载体 pEZZ18 的表达元件： lac 启动子、蛋白质 A 的信号肽序列和两个合成的 Z 功能域（domain） 蛋白质 A：来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），具有与抗体 IgG 结合的能力， Z 功能域就 是根据蛋白质 A 中结合 IgG 的 B 功能域而设计的。 融合蛋白表达后，在信号肽序列的指导下，分泌到 培养基中。然后用固定了 IgG 的琼脂糖层析柱，通 过与 ZZ 功能域的结合而得到纯化的融合蛋白。这个 14kDa 的 “ZZ” 肽链对融合蛋白的正确折叠几乎没 有影响。1641652．非融合蛋白表达载体pKK223-3 表达载体： 4584bp 使用的启动子：tac 强启动子，杂合启动子 trp-lac 终止子： 5SrRNA 区域（rrnB 操纵子区域），rrnBT 和 rrnBT2 终止子（ 防止通读）受 lac 阻抑物调控， 1-5mM IPTG 诱导可直接表达任何含 RBS 和 ATG 的基因，若无 RBS， 其 ATG 需与固有RBS相隔5-13bp。166167二、穿梭载体 Shuttle vector如有些载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中 复制，或能在 E.coli 中复制又能在革兰氏阳性细菌中 复制。 这类载体主要是质粒载体。定义:能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。由于复制和选择都是有宿主专一性的,穿梭载体至少应 含有两套复制单元和两套选择标记,相当于两个载体的 联合. 添加其它宿主的ori和选择标记,突出在非大肠杆菌中的 操作1681.大肠杆菌/革兰氏阳性细菌穿梭载体 是典型的穿梭载体，其作用主要是将目标基 因转移到芽胞杆菌或球菌中去。 枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性细菌的代表种, 但研究早期几乎没有发现其有质粒.因此应 用于该细菌的穿梭载体的质粒复制区主要来 自球菌或其它芽孢杆菌.1692．大肠杆菌/酵母菌穿梭载体酵母菌除了在真核生物的细胞生物学研究方面发挥 重要作用外，在作为蛋白质的真核表达系统方面也显 示出巨大威力。 大肠杆菌 - 酿酒酵母穿梭质粒载体，含有分别来 自大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点与选择标记，另有 一个多克隆位点区。由于此类型的载体既可在大肠杆 菌细胞中复制，也可在酿酒酵母细胞中复制，因此在 遗传学研究中很受欢迎。它使研究工作者可自如的在两种不同的寄主细胞之间 来回转移基因，并单独或同时在两种宿主细胞中研究 目的基因的表达活性及其它的调节功能。1703．其它穿梭载体在哺乳动物、植物、昆虫细胞等细胞中使用 的表达载体或其它载体，一般都有在大肠杆菌 中复制的元件，因此都具备穿梭载体的特征171三、整合载体在生物学研究和基因工程应用中，会涉及将某个 基因或某些基因插入到染色体中去的工作，承担这 部分工作的载体，可称为整合载体（integration vector）。 根据整合方式的不同：定点整合和随机整合 按其作用：目标基因的插入或敲除 随机突变体库 的构建1721．基因插入knock-in / 基因敲除knock-out?当外源基因整合到宿主细胞的染色体后，可以稳定 的遗传，进而达到稳定表达的目的. ?在实验研究中，经常需要敲除某个基因，从而验证 其功能.?同源重组整合载体是最常用的整合载体，该载体一 方面含有大肠杆菌克隆载体的骨架，更主要的是含 有一段便于同源重组的重组 DNA 片段。 ?从染色体上待插入位点处取出一段 DNA， 将选择 标记基因和多克隆位点插入到这个片段中间得到这 一重组 DNA 片段。173基因敲除和基因嵌入技术该技术是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技 术。基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源 重组。指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相 近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中 的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组 中。此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体 的基因突变。 基因嵌入又称基因置换，它是利用内源基因序列两侧 或外面的断裂点，用同源序列的目的基因整个置换内 源基因。1742．随机插入突变载体随着功能基因组研究的发展，不断需要一系列 发生基因突变的材料。为了满足这一要求，构建 随机突变体库便进入到研究工作中。 随机突变体库：指标记基因在载体的携带下通过 DNA 重组事件随机插入基因组中而形成的突变体 的集合。 为了提高标记基因插入到基因组中的频率，一般 都要借助转座子来帮忙。175本章小结将外源 DNA 或基因携带入宿主细胞（host cell） 的工具称为载体，载体是基因操作的核心工具。 质粒载体是最常见的载体，也是使用最方便的 载体。它应用了质粒的复制、拷贝数及不相容 性等性质。质粒载体有抗性基因、琥珀突变抑制基因等多 种选择标记和 α-互补、插入失活等筛选标记。常见的质粒载体有： pBR322、 pUC18/19、 pUC118/119、 pGEM-3Z/4Z以及一些多功能的质 粒载体，如： pBluescriptⅡKS（±）。 176λ 噬菌体载体λ 噬菌体载体应用了 λ 噬菌体的生物学性质。 λ 噬菌体有溶源状态和裂解循环两种状态，有 着复杂的分子生物学调控机制。 λ 噬菌体载体有大小、 lacZ 基因、 cI 基因失 活以及 Spi 筛选等选择标记，分为插入型载体 和置换型载体。 常见的插入型载体有： λgt10、 λgt11及其衍生 载体和 λExcell 载体等。 常见的置换型载体有： EMBL3/4 及其类似载 体， λgem-11 载体。177M13 噬菌体载体M13 噬菌体是一种单链噬菌体，基于其构建的载 体可以制备单链 DNA 。常见的 M13 噬菌体载体有 M13mp18/19 ，其受体 细胞有特殊的遗传标志。带有丝状噬菌体大间隔区的质粒叫噬菌粒，噬菌 粒工作的时候需要 M13K07 辅助噬菌体的帮助。179表达载体大肠杆菌表达载体是最常见的表达载体，可分为 表达融合蛋白的载体和非融合蛋白表达载体。 常用的标签蛋白有谷胱甘肽转移酶、六聚组氨酸 肽、蛋白质 A 和纤维素结合位点等。 穿梭载体和整合载体在基因操作中也扮演着重要 的角色。181
分子克隆3目录_生物学_自然科学_专业资料。第一章、 第二章、 第三章、 第...质粒及其在分子克隆中的应用 ?噬菌体及其载体 M13 噬菌体载体 高容量载体的应用...分子克隆中良好载体应具备的条件:(1)必须有自身的复制子;(2)载体分子上必须有限制性核酸内切酶的酶切位点,即多克隆位点,以供外源DNA插入;(3)载体应具有可供选...第三章 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第四章 RNA 的提取和 cDNA 合成 第...一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性: (1)分子量 小、多拷贝、松驰控制型...PCR由变性--退火-延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至...以下框架图给 出了分子克隆的基本流程: PCR扩增目的基因 提取载体质粒 限制性...反转录酶还可利用单链 DNA 或 RNA 作模板合成分子探针。 第三章分子克隆载体 1.基因工程载体应具备哪些特点? 能在宿主细胞中独立复制; 有一定的选择标记,易于...分子克隆 1. 选择目的基因,并设计相应引物;(你现在已经有了) 2. 用引物 PCR 扩增目的基因片段; 3. 选择合适(抗性标记、酶切位点等)的克隆载体(为了保真扩增...19― 实验一 分子克隆 DNA 重组技术包括载体及外源 DNA 片段的酶切消化、 目的片段的获得及纯化、 目的片段与克隆载体的体外连接、重组子的筛选和鉴定...第3章 分子克隆 79页 1下载券 分子克隆具体 17页 1下载券 克隆全过程 4页 免费 分子克隆技术 19页 1下载券 分子克隆载体 10页 1下载券喜欢此文档的还喜欢...分子克隆技术实验操作手册_生物学_自然科学_专业资料...实验三 外源 DNA 片段在质粒载体中的克隆 7 实验...医用基础化学课件-第五章... 45页 免费 医用基础...分子克隆实验指南_院校资料_高等教育_教育专区。做了快一年的分子克隆,犯了很多...我个人 强烈建议第二种,连 T 载体。因为 PCR 产物直接酶切我觉得有两个缺点...
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