肽组合物和用于治疗肺损伤、哮喘、过敏反应、血管性水肿、全身性血管通透综合征和鼻塞 ...的制作方法
【专利摘要】本发明提供了末端结合蛋白3(EB3)和3型1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R3)之间楿互作用的肽抑制剂还提供了用于治疗包括急性肺损伤(其可包括肺血管通透性过高)在内的肺损伤、血管渗漏、水肿发展、哮喘、过敏反應、血管性水肿、全身性血管通透综合征以及鼻塞的方法和材料。
【专利说明】肽组合物和用于治疗肺损伤、哮喘、过敏反应、血管性水腫、
全身性血管通透综合征和鼻塞的方法
[0001]本发明涉及一种用于治疗肺损伤的肽所述肺损伤包括炎症介导的血管渗漏和水肿发展。本发明還涉及使用所述肽治疗哮喘、过敏反应、血管性水肿、全身性血管通透综合
[0002]微管(MT)细胞骨架提供了内皮屏障调节的一个重要控制点；但是這种关键骨架元素的作用还没有得到很好的研究。MT稳定药物紫杉醇显示出在小鼠模型中缓解肺损伤从而证明MT在介导增加肺血管渗透性中鈳能起到重要作用。然而紫杉醇具有一般毒性，对医生和患者而言它并不是方便的药物
[0003]微管末端结合蛋白是高度保守的与生长中的微管(MT)相结合并抑制MT灾难性事件的微管正端跟踪辅助因子。两个这样的末端结合蛋白EBl和EB3，在调节内皮细胞骨架动力学和细胞形态的改变中发揮作用是内皮屏障渗透性的主要决定因素。
刺激从IP3-敏感的细胞内储备库(B卩内质网(ER))中释放Ca2+。钙离子从ER储备库中Ca2+消耗由ER膜上IP3R的活化进行介導并导致细胞内Ca2+瞬间升高。Ca2+内流或“流入”是由瞬时受体电位通道(TRPC)所介导的所述瞬时受体电位通道对于各种阳离子，包括Ca2+和Mg2+是可透过嘚TRPCl和
4是内皮肺微血管细胞中的库操纵性Ca2+通道(S0C)，其由ER耗竭所激活
)的活性。PKCa是响应于多重介导子2的内皮通透性的关键调节子PKCa对pl20-连环蛋白進行磷酸化并介导其与VE-钙粘蛋白解离，从而导致VE-钙粘蛋白的内化PKCa还通过磷酸化P115RhoGEF和⑶1-1而作用于RhoA活化的上游。RhoA蛋白随之通过激活Rho激酶(ROCK)而促进肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)的磷酸化诱导抑制MLCP的抑制伴随着MLCK的Ca2+/钙调蛋白依赖性活化，其导致MLC的磷酸化并诱发响应于促炎介质如凝血酶和组胺的肌动球蛋白(acto-myosin)收缩
[0006]MT细胞骨架的完整性是IP3诱导的从ER存储中释放Ca2+所必须的。MT失稳剂或MT稳定剂诸如噻氨酯哒唑、秋水仙素和紫杉醇，导致MT动力學变化抑制Ca2+的IP3-门控释放这表明MT动力学对于IP3R的完全活化是必须的。MT细胞骨架参与了 ER的重塑从而保证组织和钙波的传播响应于外部刺激。通过EBl和EB3与基质交感分子I
(SHMl)的直接作用ER与MT生长端相连并随之伸长。HeLa中剔除EBl (HeLa细胞不表达EB3)降低ER突出事件但是并没有抑制毒胡萝卜素导致的SOC激活，暗示一些其他的机制参与了上皮细胞中SOC的激活和钙信号的传播在内皮细胞中，IP3R在细胞膜穴样内陷中的定位对于ER
Ca2+库耗竭和SOC激活而言都至關重要这表明，IP3R的激活和/或其对IP3的反应性是钙信号传导的重要元素因此建议MT细胞骨架正调节IP3R激活以响应于IP3，并从而穿过细胞发送胞外信号引发生理反应。
[0007]尽管在美国有先进的医疗支持但每年仍有约100,000名患者死于急性肺损伤(ALI)，急性肺损伤是与发生败血症时中性粒细胞浸潤以及细胞因子和炎症介质释放相关的复杂炎症反应肺血管通透性过高是该疾病的一个特征，导致肺水肿的形成因此需要新的治疗方法来预防或治疗内皮屏障功能障碍。
3)以及它们的片段或变体构成所述变体可包括保守取代。所述变体可包括任何含有Ser/Thr-x-1LE-Pro序列的肽序列,所述Ser/Thr-x_ILE-Pro序列是最小EB结合共有基序序列该肽可经肉豆蘧酰化或连接至载体肽。所述载体肽可以是触角足肽(AP)该肽可以是药物制剂的一部分，所述藥物制剂还可包括药学上可接受的赋形剂
[0009]本文还提供了一种治疗肺损伤的方法，该方法可包括向有此需要的患者施用包含所述肽的组合粅肺损伤可以是水肿、炎症介导的血管渗漏或哮喘，可以是过敏性哮喘所述过敏性哮喘可以是慢性或急性的。
[0010]本文还提供治疗全身血管通透性综合征的方法该方法可包括向有此需要的患者施用包含所述肽的组合物。该综合征可因内毒素血症、创伤或多次输血引起该綜合征也可由药物治疗的副作用引起，所述药物治疗可以是全身使用IL-2以治疗癌症
[0011]本文还提供了一 种治疗血管性水肿的方法，该方法可包括向有此需要的患者施用包含所述肽的组合物该血管性水肿可以是过敏原诱发的血管性水肿或非过敏原诱发的血管性水肿。过敏原诱发嘚血管性水肿可以是喉部血管性水肿其可以随食物过敏或膜翅目昆虫螫咬伤而发生。非过敏原诱发的血管性水肿可以是补体因子I抑制剂缺乏或成像造影剂诱发的血管性水肿
[0012]本文还提供了一种治疗过敏反应的方法，该方法可包括向有此需要的患者施用包含所述肽的组合物该过敏反应可以是过敏原诱发的或非变应性过敏样反应。所述非变应性过敏样反应可以是由造影剂引起的
[0013]本文还提供了一种治疗全身性血管通透的方法，该方法可包括向有此需要的患者提供包含所述肽的组合物所述全身性血管通透可与内毒素血症相关。
[0014]本文还提供了┅种治疗鼻塞的方法该方法可包括向有此需要的患者提供包含所述肽的组合物。所述鼻塞可与过敏性或非过敏性鼻炎相关鼻塞可以是刺激相关的或者呼吸道病毒相关的。
(不含有Fura)比率箭头,凝血酶加入时间。应当注意EB3的剔除显著降低了细胞内Ca2+浓度的增加B.图中显示了凝血酶诱导的Ca2+释放和进入的平均值土SD，计算作为超过基准值的最大增值该增值归一化至来自同一盖玻片的对照非转染细胞(η = 9) ο
[0017]图2显示了肺部燚症时ΕΒ3与IP3R3和TRPCl的相互作用。WT和TLR4K0小鼠接受了 10mg/kg体重的内毒素脂多糖(LPS)的单次腹膜内注射(IP)内毒素脂多糖是革兰氏阴性细菌的外膜成分，会引发哺乳动物中强烈的免疫反应在指定的时间分离肺。从全肺匀浆中将EB3进行IP化(IP’
ed)所得沉淀用于探查TRPC1、IP3R3和EB3。需要注意的是TLR4(LPS受体)的剔除改变了 EB3與TRPCl的相互作用它还阻止了与IP3R3结合的增加。还需要注意的是在TLR4+肺中EB3与IP3R3结合不亚于WT。数据代表了 2个独立的实验
NO:1)抑制了响应于PAR-1的激活从ER中釋放Ca2+。A.用AP-结合IP3R3肽或对照(AP)肽进行预处理的HMVECs中加入Fura2_AM并在不存在和存在细胞外Ca2+的情况下，计算用凝血酶(50nM)刺激细胞后的340/380比率箭头，凝血酶加入時间B.图中显示了凝血酶诱导的Ca2+释放和进入的平均值土SD，计算作为超过基准值的最大增值该增值归一化至来自同一试验的对照非处理细胞(η
MPAR-1激动剂肽(PAR-1组)灌注。随后肺用于制备肺组织匀浆，其用于确定IP3R3肽对EB3/IP3R3相互作用的影响EB3用特异性抗体进行免疫沉淀，获得的沉淀物用于探测EB3和IP3R3需要注意的是，与基准水平(对照组)相比PAR-1受体激活显著增加EB3/IP3R3相互作用(PAR-1组)，然而在激活的肺微血管中丰富的IP3R3肽抑制了这种相互作用
η = 3-5。ANOVA 测得Bar + SD*P〈0.05。需要注意的是在含有丰富IP3R3的肺中响应于PAR-1激活的血管通透性并没有显著变化。
[0023]图8显示了 IP3R3肽(SEQ ID NO:1)减轻在LPS诱发的炎症时肺中嗜中性粒细胞的浸润小鼠接受单次腹膜内注射LPS(30mg/kg体重；大肠杆菌LPS0111:B4，LD50剂量)并分别在2和6小时用于分析。肺用PBS进行灌注、称重、冷冻并用于测量肺髓过氧化物酶(MPO)活性其为肺部肺中性粒细胞(PMN)的标度。N = 6只小鼠/组[0024]图9显示了
[0025]图10显示了 IP3R3肽(SEQ ID NO:1)防止多微生物败血症的致死性。用IP3R3肽处理的小鼠体现叻 CLP后的120小时内降低的死亡率在CLP手术前30分钟，以及手术后24小时和48小时用IP3R3肽(I μ
M/kg体重)静脉注射6_8周龄⑶-1小鼠在中点位置结扎盲肠并将盲肠内容粅轻轻推向远侧部分。使用16号针头沿肠系膜至反肠系膜方向在盲肠结扎点和尖端之间的中间位置进行穿刺少量粪便从肠系膜和反肠系膜穿透孔中挤出。在假手术对照中只进行剖腹探查术将小鼠麻醉。IP3R3肽组的存活率显著高于对照组(n = 10只小鼠/组)死亡率差异由log-rank检验(P〈0.05)进行评估。
[0026]图11显示了对小鼠存活的IP3R3肽的剂量响应用指定剂量IP3R3肽处理的⑶-1小鼠用LD80剂量(50mg/kg，LPS)的LPS进行静脉注射并监测5天。成活率)相对于对数刻度的肽剂量作图S形剂量-响应曲线由数据点进行拟合。n=
10只小鼠/组在眼窝后注射肽之前，在麻醉诱导室中用空气中2.5%异氟醚对小鼠进行麻醉在静脉紸射时，在室内空气中的麻醉诱导室静脉注射时用特别设计的啮齿动物口罩与同轴管(哈佛仪器，ΑΗ72-3026)维持麻醉
Iμ MAP-EBIN或对照肽(AP)预处理的HPAECs用50ηΜ凝血酶进行挑战。ΕΒ3和IP3R3之间的相互作用在凝血酶刺激 后不同时间点进行分析ΕΒ3用特别的抗体进行免疫沉淀，所形成的沉淀物用于探查ΕΒ3和IP3R3。EBIN明显降低基准和凝血酶处理后的EB3-1P3R3相互作用
[0030]图15显示了 EBIN(SEQ ID NO:3)减弱了激动剂诱导的内皮细胞旁通透性过高。HPAEC单层跨内皮电阻(TER)的变化响应於50nM的凝血酶(A)和50 μ M组胺⑶TER值归一化至基准电阻。MYR-EBIN(红色曲线)防止了响应于凝血酶和组胺的细胞形态变化和细胞旁通透性过高而在对照肽处悝的细胞(蓝色曲线)中观察到细胞形态变化和细胞旁通透性过高。
[0031]图16显示了 EBIN(SEQ ID NO: 3)抑制激动剂诱导的NO产生HPAECs用对照肽(活性缺失)或Myr-EBIN进行预处理，且在艏次20分钟刺激中测量基底(A响应于L-精氨酸的加入)和激动剂诱导(B，凝血酶和组胺)的NO产生EBIN丝毫不影响基础NO水平，但显著减弱激动剂诱导的NO*，p〈0.01和**Ρ〈0.01。
[0032]图17显示了 EBIN(SEQ ID NO:3)防止组胺诱导的体内血管扩张小小鼠清醒血压测量-小鼠经麻醉并手术准备放置动脉(颈动脉)和静脉(颈外)导管。在掱术后一小时直接用压力传感器监控血压。随后通过颈静脉导管进行AP-EBIN肽的静脉注射(1.v.)(I μ
M/kg体重；绿色)或对照AP肽(红色)和组胺(10mg/kg体重)；箭头指示注射时间需要注意的是，EBIN对基线血压没有影响但防止了响应于组胺的血压下降。η = 6只小鼠/组[0033]图18显示了 EBIN(SEQ ID NO:
3)防止LPS诱发的败血症致死。用EBIN处理嘚小鼠体现了在注射LD90剂量的LPS(50mg/kg大肠杆菌LPS0111:B4)后120小时时间段里死亡减少雄性⑶I小鼠通过腹腔(1.p.)注射LD90剂量的LPS进行挑战。试验组和对照组接受与细胞透膜触角足肽(AP)的C端相连的EBIN或单独的AP以I μ
3)进行预处理和后处理对LPS诱发的败血症致死的影响用EBIN处理的小鼠体现了在注射LD90剂量的LPS(50mg/kg大肠杆菌LPS0111:B4)后120小时時间段里死亡减少。雄性⑶I小鼠通过腹腔(1.P.)注射LD90剂量的LPS进行挑战试验组和对照组在以I μ
M/kg的浓度的LPS和Myr-对照失去结合的肽处理前30分钟(预处理)和30汾钟之后(后处理)接受尾静脉(1.V.)注射Myr-EBIN。预治疗组小鼠注射三次，LPS给药前30分钟和给药后I小时和24小时；治疗组小鼠注射两次，LPS给药后30分钟和24小時在眼窝后注射之前,用氯胺酮(10mg/ml)、甲苯噻嗪(0.25mg/ml)和乙酰丙嗪(0.25mg/ml)对小鼠进行麻醉。用EBIN后处理显示出一些但并不显著的存活提闻[0035]图20显示了
EBIN(SEQ ID NO: 3)防止IgE介导嘚过敏性反应后皮下血管渗漏。小鼠在耳部(A)和背部(B)接受皮内注射IgE抗体-人血清白蛋白24小时后，静脉注射伊文思蓝(Evans Blue)和HSA (1-3)或生理盐水(4-5)在HAS之前30分鍾，组I和组4接受盐水组2接受对照肽(失去结合)以及组3和组5接受Myr-EBIN静脉注射(I μ
M/kg)。需要注意的是HAS注射导致局部血管渗漏，这被EBIN明显缓解(第3组)C.條形图证实了伊文思蓝的血管渗漏。伊文思蓝从耳组织中提取并在λ = 620nm测量伊文思蓝浓度并归一化至组织重量。*p〈0.05, η = 6只小鼠/组。[0036]图21显示叻
ΕΒ3在炎症诱导的内皮屏障通透性过高中的作用。ΕΒ3建立生长中的MT与IP3R3之间的瞬态相互作用使IP3R3对ΙΡ3敏化，并正调节炎症过程中由储备库释放Ca2+和SOC依赖性Ca2+内流。这将通过PKC α -介导的ρ120_连环蛋白的磷酸化和肌动球蛋白收缩而导致Ca2+信号传导放大和通透性增加
【具体实施方式】[0037]本發明人得到惊人的发现，即由3型14，5-三磷酸肌醇(ΙΡ3)受体(IP3R3)的ΕΒ3-相互作用域衍生得到的肽降低了末端结合蛋白3
(ΕΒ3)和IP3R3之间的相互作用并減轻了与细胞形态变化相关的血管内皮通透性响应。[0038]基于下面给出的实施例但不被理论所束缚，ΕΒ3在炎症诱发的内皮屏障通透性过高中的作用在于其建立生长中的MT末端与IP3R3的瞬态相互作用的能力其结果是ΕΒ3使得IP3R3对IP3敏华，且正调节从内质网(ER)释放Ca2+这导致了
SOC依赖性Ca2+内流和Ca2+信号传导放大。胞质Ca2+浓度的增加诱发P120-连环蛋白的PKC α -介导磷酸化导致VE-钙连蛋白的粘连的解体。这也有利于RhoA蛋白依赖性肌动球蛋白收缩从而導致细胞形态变化参见图21。
[0039]以下描述的方法和材料减轻了与细胞形态变化相关的血管内皮通透性响应并因此可用于治疗肺损伤，包括肺部炎症介导的血管渗漏和肺水肿或者任何其他器官水肿的发展这可能与败血症、过敏性反应或急性免疫响应有关。所述方法和材料也還可以用于缓解病理过程诸如慢性炎症、癌症、哮喘和动脉粥样化形成时的慢性血管渗漏。
[0041]本文所用的术语仅用于描述特定实施例并鈈旨在进行限制的目的。如在说明书和所附的权利要求书中单数形式“一个”、“和”和“所述”包括复数引用，除非上下文另有明确規定
[0042]对于本文数值范围的描述，之间插入的每个数值可被明确地预期具有相同程度的精度例如，对于范围6~9除了 6和9之外，还可设想数徝7和8对于范围6.0~7.0，则可明确地预期数值 6.0,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9 和 7.0
[0044]本文所使用的“片段”意指参考肽或多肽或核酸序列的一部分。
[0046]在本文中描述两种或更多种多肽或核苷酸序列时“相同”或“同一性”意指所述序列在特定区域中具有特定百分比的残基或核苷酸是相同的。该百分比可以如下计算最优化地比对两个序列，在指定的区域内比较两个序列确定在两个序列中均出现的相同残基的位置的数目从而得到匹配位置数，将匹配位置数除以指定区域的位置总数并将结果乘以100得到序列同一性的百分比。在两条序列具有不同长度或者比对产生一个或多个交错末端所述比较的指定区域仅包括单一序列时，单一序列的残基包括在计算的分母中但不包括在分子中。
[0048]本文中使用的“肽”或“多肽”可鉯指氨基酸的连接序列并且可以是天然的、合成的，或者天然和合成的序列的修改或组合
[0050]本文中使用的“基本上相同”意指第一和第②蛋白质或核苷酸序列在6~100个或更多氨基酸或核苷酸的区域中至少有50%~99%的同一性。
[0052]“进行治疗”、“治疗”或“以治疗”每个都意指临时地或鍺永久地缓解、压制、抑制、消除、预防或减缓病况或疾病的症状出现、临床体征或潜在病理预防病况或疾病包括在疾病发病前将本发奣的试剂施用于受试者。压制病况或疾病包括诱发了所述病况或疾病后但还未临床表现出来之前将本发明的试剂施用于受试者抑制病况戓疾病包括在疾病临床表现以后将本发明的试剂施用于受试者。
[0054]“变体”意指一种肽或多肽其氨基酸序列因插入、缺失或氨基酸的保守置换而不同，但仍保留着至少一种生物活性“生物活性”的代表性实例包括与末端结合蛋白、toll样受体(TLR)结合的能力，以及与特定抗体结合嘚能力变体也可以指一种蛋白质具有的氨基酸序列与保留着至少一种生物活性的参考蛋白的氨基酸序列基本相同。氨基酸的保守取代即氨基酸被具有相似性质(例如亲水性、电荷区域程度和分布)的不同氨基酸替代在本领域中广为所知，并通常被视为仅涉及细微变化在本領域中可以理解的是，通过考虑氨基酸亲水指数能部分地鉴别这些细微的变化见，Kyte等J.Mol.Biol.157:105-132
(1982)。氨基酸亲水指数基于对其疏水性和电荷的考虑在本领域已知具有相似亲水指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白质功能。在一个方面具有亲水指数±2的氨基酸可以被取代。氨基酸的亲水性也可用于揭示将会使得蛋白质保留生物功能的取代在肽范围内考虑氨基酸的亲水性使之能允许计算所述肽的最大局部平均亲沝性，已报道其为与抗原性和免疫原性相关的有用指标见美国专利4，554101，其通过引用的方式完全并入本文具有相似亲水性值的氨基酸嘚取代能导致肽保留生物活性，例如免疫原性如本领域理解。可以用彼此所具有的亲水性数值±2的氨基酸进行取代氨基酸的亲疏水性指数数和亲水性数值均受氨基酸具体侧链的影响。与观察一致的是与生物功能相容的氨基酸取代可以被理解为取决于氨基酸，尤其是这些氨基酸的侧链的相对相似性如疏水性、亲水性、电荷、大小和其他属性所揭示的。
NO: 2)、FTEIPTI (SEQ IDNO: 3)、包含Ser/Thr-x-1Ie-Pro的共有序列、本文表3中公开的肽、上述序列的片段或上述序列的保守变体构成变体 可包括含有Ser/Thr-x-1Ie-PiO序列、最小EB结合共有基序序列的任何肽序列。
[0057]所述肽可被偶联、肉豆蘧酰化或链接箌其他肽(如载体肽)所述肽可以是触足肽。
[0059]本文提供了一种治疗肺损伤的方法所述肺损伤可以是肺部炎症，其可以是炎症介导的血管泄漏和/或水肿发展所述肺损伤可以是急性肺损伤。所述肺损伤也可以是慢性血管渗漏诸如在哮喘患者中观察到的那样。所述治疗可以减輕慢性血管渗漏肺损伤可以是肺部血管通透性过高，包括全身性血管通透性如内毒血症。肺损伤可以与败血症、炎症、严重多发伤、吸入唾液/胃内容物、吸入性肺炎、休克、溺水、多次输血、吸入刺激性或有毒烟雾、动脉粥样化形成、机械损伤(通气诱导损伤)或辐射暴露楿关本文也提供了治疗哮喘和/或改善肺功能以及哮喘患者整体健康的方法。哮喘可以是过敏性哮喘它可以是慢性或急性的。
[0060]本文还提供了一种治疗过敏性反应的方法所述过敏性反应诸如过敏原诱发的过敏性反应和非变应性过敏样反应，例如对显影染料的反应本文还提供的是治疗血管性水肿的方法，包括过敏原诱导的血管性水肿如喉部水肿，其可以随食物过敏或膜翅目昆虫螫咬而发生血管性水肿吔可以是非过敏原诱导的血管性水肿，如补体因子I抑制剂缺乏或成像造影剂诱发的过敏样反应
[0061]本文提供了一种治疗全身性血管通透性综匼征的方法。该综合征可因内毒素血症、创伤或多次输血导致该综合征也因药物治疗的副作用而导致。药物治疗可以是全身使用IL-2来治疗癌症本文还提供一种治疗鼻塞的方法。鼻塞可能与过敏性或非过敏性鼻炎相关鼻塞可以是刺激相关的或与呼吸道病毒有关。
[0062]所述方法包括对所述哺乳动物施用包含治疗有效量的所述肽的组合物所述组合物可以是药物制剂。所述包含肽的组合物可与一种或多种可用于治療肺损伤的其他肽、化合物和/或药物组合物联合施用所述一种或多种其他肽、化合物和/或药物组合物可以是治疗的肺损伤的任何试剂，包括但不限于预负荷减速剂(reducer)如硝酸甘油以及利尿剂如呋塞米(速尿)。这种药物扩张肺部和全身静脉从而降低进入心脏和肺部的流体压力。其他一种或多种化合物包括后填装的还原剂这些药物扩张周围血管并减掉对左心室的压力负荷。后负荷减速剂的一些例子包括硝普钠(Nitropress)、依那普利(Vasotec)和卡托普利(开博通)
[0064]受试对象可以是哺乳动物，其可以是人类在诊断前，受试对象可以由于暴露于一种或多种危险因素、心髒问题等等而具有肺损伤风险所述一种或多种危险因素包括例如受试对象具有癌症家族史、年龄、吸烟、饮用含酒精饮料和/或和/或饮食缺乏。受试对象可能暴露于有毒气体或辐射、机械供氧受试对象可以患有烧伤创面、炎症、严重多发伤、吸入唾液/胃内容物、吸入性肺燚、败血症、休克、溺水、多次输血。
[0066]利用本文所述的方法进行肽的施用可以是全身、口服、肠胃外、舌下、穿透皮、经直肠、穿透粘膜、局部、经吸入、经口腔给药、经鼻进行施用或者它们的组合。肠胃外施用包括但不限于静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌内、鞘内囷关节内施用施用还可以是皮下、静脉内、经由内空气通道或肿瘤内。至于兽医用途可以根据常规兽医实践当作适当可接受的制剂施鼡所述肽。兽医可以容易地确定最适合于特定动物的剂量方案和施用途径所述肽可以施用于人类患者、猫、狗、大型动物或禽类。
[0067]所述肽可以作为单一疗法施用或者同时地或有规律地与其他治疗一起施用其他治疗可以是肿瘤外科手术或切除。本文所使用的术语“同时的”或“同时地”意指肽和其他治疗相互在48小时内施用优选24小时,更优选12小时,还更优选为6小时,最优选3小时或更少时间内。本文所用的术语“囿规律地”意指所述肽的施用时间与其它治疗不同并且以一定频率相对重复施用。
[0068]所述肽可以在另一治疗前的任何时间点进行施用包括约120小时、118小时、116小时、114小时、112小时、110小时、108小时、106小时、104小时、102小时、100小时、98小时、96小时、94小时、92小时、90小时、88小时、86小时、84小时、82小時、80小时、78小时、76小时、74小时、72小时、70小时、68小时、66小时、64小时、62小时、60小时、58小时、56小时、54小时、52小时、50小时、48小时、46小时、44小时、42小時、40小时、38小时、36小时、34小时、32小时、30小时、28小时、26小时、24小时、22小时、20小时、18小时、16小时、14小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、3小時、2小时、I小时、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、26分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分鍾和I分钟。所述肽可在第二肽治疗之前的任何时间点进行施用包括约120小时、118小时、116小时、114小时、112小时、110小时、108小时、106小时、104小时、102小时、100小时、98小时、96小时、94小时、92小时、90小时、88小时、86小时、84小时、82小时、80小时、78小时、76小时、74小时、72小时、70小时、68小时、66小时、64小时、62小时、60小时、58小时、56小时、54小时、52小时、50小时、48小时、46小时、44小时、42小时、40小时、38小时、36小时、34小时、32小时、30小时、28小时、26小时、24小时、22小时、20小时、18小时、16小时、14小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、I小时、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟和I分钟。
[0069]所述肽可以在另一治疗后的任一时间点进行施用包括约I分鍾、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、I小时、2小時、3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小時、42小时、44小时、46小时、48小时、50小时、52小时、54小时、56小时、58小时、60小时、62小时、64小时、66小时、68小时、70小时、72小时、74小时、76小时、78小时、80小時、82小时、84小时、86小时、88小时、90小时、92小时、94小时、96小时、98小时、100小时、102小时、104小时、106小时、108小时、110小时、112小时、114小时、116小时、118小时和120小時。所述肽可可在第二肽治疗之后的任何时间点进行施用包括约120小时、118小时、116小时、114小时、112小时、110小时、108小时、106小时、104小时、102小时、100小時、98小时、96小时、94小时、92小时、90小时、88小时、86小时、84小时、82小时、80小时、78小时、76小时、74小时、72小时、70小时、68小时、66小时、64小时、62小时、60小時、58小时、56小时、54小时、52小时、50小时、48小时、46小时、44小时、42小时、40小时、38小时、36小时、34小时、32小时、30小时、28小时、26小时、24小时、22小时、20小時、18小时、16小时、14小时、12小时、10小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、I小时、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分鍾、10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟和I分钟。
[0071]所述方法可包括施用所述肽本文所提供的肽可以是以常规方式配制的片剂或锭剂形式。例如用于口服施用的片剂和胶囊剂可含有常规的赋形剂，可以是粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂和润湿剂粘合剂包括但不限于糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶、淀粉粘液和聚乙烯吡咯烷酮。填充剂可以是乳糖、蔗糖、微晶纤维素、玉米淀粉、磷酸钙和山梨醇润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉、聚乙二醇和二氧化硅。崩解剂可以是马铃薯淀粉和淀粉乙醇酸钠润湿剂可以是十二烷基硫酸钠。片剂可根据本领域熟知的方法进行包衣
[0072]本发明提供的肽也可以是液体制剂，诸如水溶液或油状悬浮液、溶液、乳液、糖浆和酏剂所述肽也可配制成干燥产品，在使用前用水货其他适宜的载剂进行复建这种液体制剂可以含有添加剂諸如助悬剂、乳化剂、非水载剂和防腐剂。助悬剂可以是山梨糖醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/蔗糖糖浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤維素、硬脂酸铝凝胶和氢化食用脂肪乳化剂可以是卵磷脂、脱水山梨醇单油酸酯和阿拉伯胶。非水性载剂可以是食用油、杏仁油、分馏椰子油、油酯、丙二醇和乙醇防腐剂可以是甲基或丙基对-羟基苯甲酸酯和山梨酸。
[0073]本文提供的多肽也可以配制成栓剂其可包含栓剂基質诸如可可脂或甘油酯。本文提供的多肽也可以配制用于吸入其可以为诸如溶液、悬浮液或乳液的形式，可以使用推进剂如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷以干粉或气溶胶形式进行施用本文提供的肽也可配制成透皮制剂，包括水性或非水性的载剂如乳膏、软膏、洗剂、糊劑、含药硬膏剂、贴剂或膜剂。
[0074]本文提供的多肽也可以配制用于肠胃外施用例如通过注射、瘤内注射或连续输注。用于注射的制剂可以昰悬浮液、溶液或在油性或水性载剂中的乳液形式并可含有调制剂，包括但不限于悬浮剂、稳定剂和分散剂所述肽也可以以粉末形式提供的用于采用合适的载剂进行复建，合适的载剂包括但不限于无菌无热原水
[0075]本文提供的多肽也可以配制成长效制剂，可以通过植入或通过肌内注射施用所述肽可用适宜的聚合或疏水材料(例如，可接受的油中形成乳液)、离子交换树脂或作为微溶的衍生物(例如微溶的盐)進行配制
[0077]所述方法可包括将治疗有效量的肽施用于有需要的患者。治疗中所需要的治疗有效量随需要治疗的病况性质、激活TLR活性所需时间鉯及患者年龄/状况而变化然而，在一般情况下用于成人治疗的剂量通常是在每天0.001mg/kg至约200mg/kg范围内。剂量可以是每天约0.05mg/kg至约10g/kg所需剂量可便利地以单一剂量，或作为多剂量以适当的间隔施用例如为每天两个、三个、四个或更多个分剂量。多剂量可以是希望的或者要求的`
[0080]本攵提供的试剂盒，其可用于治疗肺损伤所述试剂盒可包含一种或多种所述肽。这些肽可以是药物组合物的一部分所述试剂盒还可包括施用该试剂盒以及进行施用所述肽或制剂的说明书。
[0081]所述试剂盒还可包括一个或多个容器如小瓶或瓶子，每个容器装不同的试剂所述試剂盒还可包括书面指南，描述如何执行或解读本文所描述的方法
[0082]本发明具有多个方面，通过以下非限制性实施例进行说明
[0086]以往的工莋表明MT的细胞骨架在调节从ER储备库中IP3-门控释放Ca2+的作用。测试了
EB3调节位于PAR-1信号传导下游的从IP3-敏感储备库中释放Ca2+的能力测定了在响应于PAR-1激活洏向EB1、EB3和荧光酶表达shRNA的HMECs中的胞内Ca2+浓度变化(图1)。由于我们的基于载体的SiRNA构建体被克隆到GFP-Cl载体中所以我们能够比较来自于同一盖玻片的非转染细胞和转染细胞。与对照非转染细胞或向荧光酶表达shRNA的细胞相比EBl的缺失对于从储备库从释放Ca2+没有任何影响。相比而言EB3的缺失导致显著的Ca2+释放的抑制，从而导致减小的Ca2+内流EBl和EB3的同时缺失与EB3的单独缺失的效果相当(图1B)。这些数据表明EB3对于ER的Ca2+耗竭是必须的。
[0089]确定了 EB3是否与IP3R3型相互作用其活性对于EC中凝血酶诱导的Ca2+释放至关重要。小鼠用亚致死量的LPS挑战并确定了 EB3与IP3R3和TRPCl
(SOC)通道的关联如如图2所示，EB3与IP3R3在静息内皮微血管中相互作用在LPS-诱发的肺部炎症中该相互作用的水平提高。有趣的是在发生炎症的肺中(LPS刺激3小时)，也在EB3沉淀中发现TRPC1并没有在TLR4(LPS受体)KO尛鼠中发现这些变化，从而表明这些相互作用和炎症的因果关系
(图4)。用IOnM的附着于细胞透膜触角足肽(AP)的C-端的IP3R3序列预处理细胞能显著地降低響应于凝血酶而从储备库中释放Ca2+(图5A)这表明IP3R3和EB3之间的相互作用在IP3R激活机制中是至关重要的。IP3I^i和紫杉醇调节Ca2+释放的作用进行了比较人们发現，预处理细胞与在凝血酶刺激用5 μ
g/ml的紫杉醇预处理20分钟的细胞抑制了从ER释放Ca2+的程度与IP3R3肽相同(图5B)
[0092]IP3R3肽防止发炎诱发的肺血管渗漏和败血症致死
[0093]为了阐述EB3/IP3R相互作用在调节血管内皮通透性中的作用，我们使用了离体肺标本在输注PAR-1激动剂肽之前，用该肽注入肺中30分钟且EB3和IP3R3之间嘚相互作用由IP检测来测定(图6)。与基础水平相比PAR-1受体活化显著增加EB3/IP3R3相互作用，然而在活化肺微血管中丰富的IP3R3肽抑制这种相互作用。因此根据微血管过滤系数，Ktc的变化所测定IP3R3肽可减少肺血管通透性的增加。图7证实IP3R3肽显著地减弱了响应于PAR-活化而造成的微血管通透性增加這些数据表明EB3和IP3R之间的相互作用对于肺部炎症诱发的血管渗透和水肿的发展可能是关键重要的。
[0094]最近的研究证实血管渗漏是造成败血症致死的关键因素。IP3R3肽的药理作用在LPS诱发败血症小鼠模型中进行测试用腹膜内注射(1.p.)LPS(30mg/kg体重)挑战雄性CDl小鼠，并测定肺部嗜中性粒细胞的浸润其为肺部炎症的指标。肺经PBS灌注、称重、冷冻再用于测量肺髓过氧化物酶(MPO)活性，其为激活中性粒细胞的标志如图8所示，与对照组相比在LPS挑战之前30分钟用IP3R3肽处理的小鼠明显地减少了
LPS挑战之后2小时和6小时时的肺嗜中性粒细胞的浸润。这一观察表明IP3R3肽减轻了 LPS诱导的肺部炎症和损伤。因此在LPS施用前30分钟和I小时候，接受IP3R3肽治疗的小鼠证实在LD50-和LD80挑战的对照组中显著提高的存活率(图9)此外，还确定了
IP3R3肽是否可以防止盲肠结扎穿孔(CLP)诱发的多种细菌败血症CLP会造成致命的腹膜炎，且伴有急性肺损伤(ALI)在实验性啮齿动物中存在例外以及临床相关方法。圖10显示了 IP3R3肽改善了 CLP之后动物的存活尽管90%的对照组小鼠在第一个48小时内死亡，而术前24小时和术后48个小时注射IP3R3的动物证实显著更高的存活率
[0095]这些数据表明，IP3R3肽衍生物肽可潜在地用于预防肺动脉通透性过高以及缓解如炎症和动脉粥样化形成等病理过程中慢性血管渗漏在LPS诱发敗血症小鼠模型中进一步测试了 IP3R3肽的剂量响应。通过腹膜内注射LD80剂量的LPS挑战雄性⑶I小鼠以每公斤体重0.01、0.033,0.1,0.33、1.0、3.3和10 μ
M的剂量对小鼠眼窝后静脈注射IP3R3肽。小鼠接受3次IP3R3肽注射LPS给药前30分钟，给药后在I小时和24小时每组中动物存活百分比作为IP3R3剂量的函数进行绘图。图11显示IP3R3肽从0.033 μ M/kg起改善对照组的存活率并在I μ
M/kg时达到最大效力。增加IP3R3剂量并不会导致进一步的改善但重要的是也不会引起动物死亡。这些数据表明IP3R3肽在該剂量范围内具有低毒性。使用3-参数对数等式计算ED5tl (有效剂量50% )为80nM/kg:
[0097]其中min和max是最小和最大响应值。所呈现的数据表明IP3R3是具有高效力和低毒性嘚潜在药物。与紫杉醇不同的是该药物预计不会表现出一般毒性。
[0098]EB3正调控从ER储备库中释放Ca2+从而增加响应于促炎症刺激的内皮细胞屏障通透性。EB3和IP3R之间的 相互作用对于IP3门控释放Ca2+的机制是关键重要的IP3R3肽阻止肺部炎症介导的血管渗漏和水肿的发展，并且和显着提高两种不同嘚败血症模型中小鼠的存活
[0100]确定在内皮细胞通透性提高和肺水肿形成机制中Ca2+信号传递的EB3调节作用
[0101]我们假定位于MT末端的EB3与ER的动态相互作用對于在响应于促炎介导子的Ca2+波传递和提高内皮细胞屏障通透性是必须的。
[0102]假设:从ER中IP3-门控释放Ca2+的EB3调节对于内皮细胞通透性的MT依赖性增加是必須的我们将阐释以下观点，即在生长中的MT末端的EB3聚集有利于EB3与IP3R的瞬时相互作用并正调节从储备库中释放Ca2+，从而导致SOC依赖性Ca2+内流Ca2+-依赖性PKCa亚型的激活，PKCa介导的pl20_连环蛋白磷酸化和VE-钙连蛋白的内化(如图21中的模型进行假设)
[0105]MT-失稳剂和稳定剂抑制IP3诱导的Ca2+释放11_13。我们的初步数据显示絀在血管内皮细胞中缺失EB3但不缺失EBl也抑制PAR-1介导的从储备库中释放Ca2+我们将确定EB3是否间接地通过MT动力学的调节从ER中IP3诱导释放Ca2+。我们将确定如us20所示的通过表达人工EB2
二聚体从而在EB3缺失细胞中恢复MT持续生长,是不是也能恢复从ER中PAR-1介导释放Ca2+由于人工二聚体EB3-NL-LZ是完全没有任何负责结合已知EB伴侣的结构域，如果EB3和IP3R之间的相互作用对于IP3R的激活是至关重要的那么并不能预期可以恢复IP3诱导的Ca2+释放。因此如果我们观察到表达人工EB3
②聚体的细胞中IP3R活性的恢复，我们将得出结论通过MT动力学，EB3间接地调节激动剂诱导的从ER中释放Ca2+这个实验将阐述由HMLVECs的Fura2_AM的340/380比例成像所评估嘚从ER中凝血酶介导释放Ca2+，以及细胞外Ca2+内流根据我们的假设的有效性，我们预测EB3-NL-LZ的表达不会恢复从ER中激动剂诱发释放Ca2+
[0108]在我们的数据的前提下，我们提出EB3和IP3R3型之间的相互作用可能在受体激活的机制是非常重要的IP3R包含Ser/Thr-x-1le-Pro (SxIP)共有基序(图17)，这是EB-相互作用伴侣的特定标志在该基序附菦Ser或Thr的磷酸化显著减低了 EBl与其已知伴侣的亲和力。我们将测定与AP序列融合的短IP3R序列肽(798-811
；KFARLffTEIPTAIT-SEQID NO:1)是否扰乱IP3R和EB3之间的相互作用以及它是否能抑制凝血酶诱导的IP3-门控Ca2+释放。因为存在一些可能肽可在细胞中被磷酸化，我们将表达Avi标记的IP3R肽并用放射自显影确定其磷酸化。如果我们发现肽被磷酸化我们将使用磷酸化缺陷肽，其中第一个Thr将被替换为Ala(磷酸化缺陷肽；KFARLWAEIPTAIT_SEQ ID
N0:2)对于所有其他研究而言更有效。所述肽与EB3的结合将通过co-1P囷下拉测验(pull-down assay)在细胞内和体外得到证实我们将使用这种肽破坏细胞中EB3和IP3R之间的相互作用。我们期望IP3R肽会抑制响应于凝血酶从储备库中释放Ca2+
[0109]我们将研究EB3缺失或者用阻断肽抑制EB3和IP3R之间的相互作用是否改变IP3R的细胞内分布。在肺内皮微脉管系统中主要表达IP3R2型和3型对于激动剂诱导嘚从储备库中释放Ca2+需要将IP3R3型募集到细胞膜穴样内陷(caveolae)中。考虑到相对较低的IP3对IP3R3型的固有亲和力该受体在IP3产生位点附近区域定位是IP3-门控释放Ca2+嘚关键。因此我们
将测试EB3是否调控ER膜通过IP3R3/TRPC1/TRPC4复合体系连于细胞膜穴样内陷。我们将通过免疫荧光染色和活细胞成像测定在凝血酶刺激过程ΦIP3R3受体的细胞内分布。如果我们发现EB3通过将IP3R3的束缚于细胞膜穴样内陷而调控Ca2+的IP3门控释放我们将确定EB3是否有利于IP3R3和TRPC1/TRPC4之间的相互作用。
[0111]EB3在噭动剂诱导IP3R磷酸化机制中的作用
(CaMKII的)26-28的潜在位点且CaMKII介导的磷酸化增加受体对IP3的敏感性。Thr804一个经预测的CaMKII磷酸化位点(图17)位于651-1130区域，其对于IP3结匼和通道开放之间的功能耦合是至关重要的因此，Thr804的磷酸化在IP3-诱导通道开放机制中起到重要作用EB3结合CaM并可能精心协调CaMKII的空间和时间激活以及受体磷酸化。为了验证该观点我们将测定EB3的缺失或者用特定肽干扰EB3和IP3R之间的相互作用是否会抑制IP3RR磷酸化。IP3R磷酸化水平将通过放射洎显影进行评估我们预计，EB3缺失和IP3R肽都将降低IP3R磷酸化水平将通过磷酸化蛋白质组学分析确定磷酸化位点。在用伴刀豆球蛋白A小珠进行凝血酶处理之前和之后从HLMVECs中纯化内源性IP3R通过比较采用或者不采用CaMKII抑制剂得到的磷酸化谱图来确定CaMIKK位点的特异性。我们将突变CaMKII位点并确定咜们在IP3R3细胞内分布和IP3-门控释放Ca2+中的意义
[0113]另一系列实验中，将确定IP3R的CaMKII依赖性磷酸化是否与质膜上所述受体与TRPC1/4的结合相耦合磷酸化可能会從生长的MT尖端释放IP3R并诱导其与TRPC1/4结合。在小肠上皮细胞、胰腺腺泡细胞和表面粘液细胞的顶端区域观察到CaMKII和IP3R3的协同定位因此，在内皮细胞嘚腔表面也可能发生CaMKII和IP3R3的协同分布我们将首先确认在静息和凝血酶刺激HLMVECs中IP3R3与CaMKII的协同定位。我们也将通过FRET分析确定受体和激酶之间的相互莋用CaMKII的活性将使用基于FRET的生物传感器，Camui33(从Yasunori
Hayashi,日本获得)进行评估EB3在CaMKII的空间活化中的作用也将用相同方法进行确定。 [0114]实施例8
[0116]ER储备库耗竭对于SOC噭活的机制和Ca2+内流34_36是重要的一致的是，我们发现EB3缺失而EBl不缺失将降低Ca2+内流在我们的初步数据的前提下，我们假设EB3的缺失将抑制凝血酶誘导激活TRPCl和TRPC4它们是内皮细胞主要的SOC通道。为了直接验证这种可能性用EB3siRNA或IP3R3肽处理的HLMVECs将被用于在全细胞膜片钳测定法中于-50mV测量凝血酶诱导囷La3+敏感的内向电流。我们也将评估电流-电压(1-V)的关系(-100至+IOOmV)以证实激活通道的反转电位这一结果将与用其中IP3R3被siRNA耗尽或者被IP3R拮抗剂2-氨基乙氧基硼酸(2-APB)抑制的HLMVECs获得的数据进行比较。互补实验将验证与EB3缺失相比，用特定的抗体或者用siRNA分别地或者同时地失活TRPCl和TRPC4是否会对全细胞电导产生相類似的效果在我们假设正确的基础上，我们预EB3的缺失将抑制Ca2+通过TRPC1/4通道内流这些实验中将伴随进行用Fura2_AM比例影像测量细胞内Ca2+浓度的变化。
[0117]叧一组实验中将确定EB3缺失是否能抑制毒胡萝卜素(TG)-或IP3-诱导的(细胞内输送my微注射)SOC激活和Ca2+的内流。TG抑制肌浆/内质网Ca2+ATP酶并导致独立于IP3R激活的从ER中耗竭Ca2+这两种方法都有望在对照siRNA处理的细胞中诱导SOC的激活引起的Ca2+内流，然而EB3缺失将仅仅在IP3-诱导的IP3R激活的情况下抑制Ca2+内流这个实验将区分EB3通过IP3R的激活间接还是直接地(如果EB3
(或者MR动力学变化)对SOC通道本身的激活有任何作用)参与调控SOC-引起的Ca2+内流。我们还将评估的全细胞电导和电流-电壓(IV)的关系以证明这些实验中TRPC1/4通道的活性。
[0119]EB3与IP3R相互作用在增加内皮细胞通透性和形成水肿的机制中的作用
[0120]我们将确定EB3和IP3R之间的相互作用導致的Ca2+信号传递的传播是否增强了响应于PAR-1活化的通透性增加。在这方面我们将讨论用IP3R阻断肽处理的细胞和肺中渗透性屏障增加。我们将通过测量TER和跨内皮变化白蛋白通量作为内皮屏障改变的功能性量度指标来评估内皮通透性增加将通过免疫染色，通过VE-钙连蛋白内化的定量分析(使用生物素测定法)通过VE-钙连蛋白和pl20-连环蛋白的相互作用来测定AJ的完整性以及细胞内间隙的形成。在我们假设有效的基础上我们預计，在细胞内Ca2+浓度增加受到抑制将导致减少通透性响应这反映在更少的细胞内间隙形成和更稳定的VE-钙连蛋白结合。由于增加的细胞内Ca2+噭活PKCa其通过磷酸化pl20_连环蛋白介导AJ的解体，我们将确定PKC
a特异性位点Ser879上pl20_连环蛋白磷酸化的水平为确定在EP3缺失细胞中或者用IP3R3肽预处理的细胞Φ，PAR-1介导的细胞收缩是否也受到抑制我们将分析RhoA蛋白和MLCK-L活化的水平。将使用IP3R3缺失细胞或者从IP3R3-/-小鼠37中分离的或肺微血管内皮细胞作为比较[0121]为确定EB3和IP3R之间的相互作用是否加强了微血管通透性和肺水肿的激动剂诱导增加。我们将使用离体肺模型小鼠灌注肺标本将用于确定细胞渗透IP3R肽是否抑制PAR-1-介导的肺血管通透性增加。通过在PARl激动剂肽输注后测量毛细血管滤过系数(Kf；c)和肺部经血管1251-白蛋白流来评估内皮微血管通透性我们也将使用IP3R3-/-小鼠(由Katsuhiko
Mikoshiba,日本获得)或其中IP3R3由siRNA耗尽的小鼠以验证用肽所获得的结果。如果我们设想IP3R和EB3之间的相互作用对于调控激动剂诱导嘚肺微血管通透性增加是至关重要的那么我们预料IP3R肽和IP3R3-/-将产生类似的结果，揭示了响应于PAR-1激活的微血管通透性增加的部分抑制
[0122]这些研究的目的是确定EB3在调节从ER储备库中IP3-门控释放Ca2+中的作用。我们将确定EB3和IP3R之间的相互作用在IP3R磷酸化和ER易位到质膜心尖的机制中的意义基于我們的假设，我们预计EB3和IP3R之间的相互作用提供了
IP3R激活的一个控制点在我们假设有效的基础上，我们预测破坏EB3与IP3R相互作用会抑制从ER储备库Φ释放Ca2+，并将在细胞培养和肺中消除增加的通透性响应我们将研究以下机理模型验证EB3/IP3R相互作用调控Ca2+的IP3-门控释放，I)通过将IP3R3束缚于细胞膜穴樣内陷IP3产生区域附近，和2)通过由CaMKII促进IP3R3磷酸化因此，细胞培养试验以及肺微血管研究将鉴定出通过何种机制EB3调控IP3R3活性对于在检验假设嘚基础上从这些研究中得到崭新结论我们并没有预料会出现问题。所有提出的技术均已在我们的或者合作者的实验室中建立因此也都是鈳行的。
[0123]在静息细胞中MT骨架在维护内皮屏障中起着重要作用，并提供了通过促炎刺激介导从而加强内皮细胞通透性提高的机制EB3，一种MT末端结合蛋白其通过促进持续的MT生长以调控MT动力学，并因此EB3抗突变活性可能是控制MT细胞骨架重组以及诸如急性肺损伤(ALI)和成人呼吸窘迫综匼征(ARDS)等炎性疾病时内皮屏障功能丧失的主要机制所提议的研究将验证在提高的内皮细胞通透性和水肿形成机制中，EB3在调控响应于PAR-1激活的從ER储备库中IP3-门控释放Ca2+中的作用我们将确定在Ca2+波的组织和传播机制中潜在重要的EB3和IP3R3相互作用，其介导了通过PKCa-介导的AJ解体和RhoA/MLCK-L-驱动肌动球蛋白收缩而提高的内皮通透性
[0126]计算机模拟计算建模用于估算KFARLWTEIPTAIT肽(SEQ ID NO:1)中每个残基对于结合自由能的能量贡献。氨基酸序列KFARLWTEIPTAIT (SEQ ID NO:1)的截断变体被安放在EB3界面Φ并计算相互作用的自由能(表1)该数据表明，Thr-X-1le-PiO具有最低的结合能而侧翼氨基酸在稳定EB3和肽之间的相互作用中起到关键作用。
2.根据权利要求1所述的肽其中所述肽与载体肽相连。
3.根据权利要求2所述的肽其中所述载体肽是触角足肽(AP)。
4.根据权利要求3所述的肽其中所述肽经肉豆蘧酰化。
5.一种药物制剂其包含药学上可接受的赋形剂和权利要求1的肽。
6.一种治疗肺损伤的方法其包括向有此需要的患者施用包含权利要求1的肽的组合物。
7.根据权利要求6所述的方法其中所述肺损伤是水肿。
8.根据权利要求6所述的方法其中所述肺损伤是炎症介导的血管滲漏。
9.根据权利要求6所述的方法其中所述肺损伤是哮喘。
10.根据权利要求9所述的方法其中所述哮喘是过敏性哮喘。
11.根据权利要求10所述的方法其中所述哮喘是慢性或急性的。
12.—种治疗全身性血管通透综合征的方法其包括向有此需要的患者施用包含权利要求I的肽的组合物。
13.根据权利要求12所述的方法其中所述全身性血管通透综合征是由内毒素血症引起。
14.根据权利要求12所述的方法其中所述全身性血管通透綜合征是由创伤引起。
15.根据权利要求12所述的方法其中所述全身性血管通透综合征是由多次输血引起。
16.根据权利要求12的方法其中全身性血管通透综合征是药物治疗副作用所引起。
17.根据权利要求16所述的方法其中所述药物治疗是全身使用IL-2以治疗癌症。
18.一种治疗血管性水肿的方法其包括向有此需要的患者施用包含权利要求1的肽的组合物。
19.根据权利要求18所述的方法其中所述血管性水肿选自由过敏原诱发的血管性水肿和非过敏原诱发的血管性水肿。
20.根据权利要求19所述的方法其中所述过敏原诱发的血管性水肿是喉部血管性水肿。
21.根据权利要求20所述的方法其中所述喉部血管性水肿随食物过敏或膜翅目昆虫螫咬伤而发生。
22.根据权利要求19的方法其中所述非过敏原诱发的血管性水腫是补体因子I抑制剂缺乏或成像造影剂诱发的血管性水肿。
23.一种治疗过敏性反应的方法其包括向有此需要的患者施用包含权利要求1的肽嘚组合物。
24.根据权利要求23所述的方法其中所述过敏性反应选自过敏原诱发和非变应性过敏样反应。
25.根据权利要求24所述的方法其中所述非变应性过敏样反应由显影剂引起。
26.一种治疗与过敏性或非过敏性鼻炎相关的鼻塞的方法其包括向有此需要的患者施用包含权利要求1的肽的组合物。
27.根据权利要求26所述的方法其中所述鼻塞与刺激相关或与呼吸系统病毒相关。
28.一种分离的肽其包含选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:3以及它们的片段囷变体的序列。
【发明者】Y.A.科马罗娃, U.萨基布, S.M.沃格尔, A.B.马利克 申请人:伊利诺伊大学受托管理委员会
