gal声临其境是在什么背景下产生的？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-10-24 05:58 标签： 声临其境是在什么背景下产生的
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关注虾米：IPTG和X-gal在表达重组菌时究竟起什么作用为何有的要都加，有的却可以不加IPTG(重组,蓝白斑筛选) - DNA技术 - 生物秀
标题: IPTG和X-gal在表达重组菌时究竟起什么作用为何有的要都加，有的却可以不加IPTG(重组,蓝白斑筛选)
摘要: [IPTG和X-gal在表达重组菌时究竟起什么作用为何有的要都加，有的却可以不加IPTG(重组,蓝白斑筛选)] IPTG和X-gal在表达重组菌时究竟起什么作用？为什么有的要都加，有的却可以不加IPTG？转化TOP10后涂板进行蓝白斑筛选是不是可以不涂IPTG？ 关键词:[重组 蓝白斑筛选]……
IPTG和X-gal在表达重组菌时究竟起什么作用？为什么有的要都加，有的却可以不加IPTG？转化TOP10后涂板进行蓝白斑筛选是不是可以不涂IPTG？
回复在T-A克隆时，IPTG是T7启动子的诱导剂，在IPTG的诱导下，T7启动了下游的lac-Z基因的表达，则lac-Z与X-gal反应生成蓝色的物质，是一种非常容易的筛选标记，如果PCR片段连接进去，则破坏lac-Z，lac-Z不表达，没有蓝色出现。在BL21 菌种中，IPTG还是T7启动子的诱导剂，表达时不需要加X-gal。回复请教yanjiangang一个问题：“BL21 菌种中，IPTG还是T7启动子的诱导剂，表达时不需要加X-gal”，为什么在BL21中不需要加X-gal?X-gal原本就应该是一种兰白斑显色底物，没有了底物怎么显色，只是说有些lacZ前的启动子不是诱导型，所以可能不需要加IPTG，但在BL21中不要加X-gal我没有找到相关的资料，希望yanjiangang能稍微解释一下，谢谢！回复T7启动子不用诱导!ITPG是lac-Z启动子的诱导物,诱导表达lac-Z启动子后面的连接的T7启动子专一识别的T7-RNA聚合酶,从而使T7启动子能够转录后面的外源orf导致原核表达能够实现.蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法： 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素(antibiotic)基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌(Escherichia coli)的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。有重组质粒的细菌形成白色菌落。回复对于上面的几位个人有不同的看法。在AT克隆时，我们用的宿主细胞是克隆宿主（DH5A，JM109等），IPTG的加入是起诱导物的作用，但是诱导的启动子不是T7，而是lac启动子（T7启动子的诱导需要T7RNA聚合酶，而大肠杆菌(Escherichia coli)本身是不能产生这种聚合酶的，如果要用T7启动子表达，则必须要用到ED3溶源型细菌，在BL21里面，IPTG加入诱导的其实不是T7启动子，而是诱导DE3产生T7RNA聚合酶，由T7RNA聚合酶诱导T7启动子表达下游基因）。我们在做蓝白斑筛选时用的宿主都是A肽缺失型的，在没有插入片段以前，lac启动子可以产生A肽，具有β-半乳糖苷酶的活性，可以和X－gal作用，出现蓝色。反之，如果片段成功插入，则破坏了lacZ的读码框，A肽不可以表达，出现白色。 至于搂住所说的，如果不加IPTG的情况只能出现在lacZ的表达是组成型启动子的时候！ 另外“。yanjiangang 兄说“在BL21 菌种中，IPTG还是T7启动子的诱导剂，表达时不需要加X-gal。” 不是很明白。BL21菌株很少用来克隆用的，但是如果在BL21菌株中进行蓝白斑筛选，也得加Xgal吧！希望yanjiangang 能够解释一二！
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