50μL Buffer中含1μg底物DNA,于最适反应条件和温度下保温1小时,能使1μg DNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位用U表示。在DNA分子双链的特异性识别序列部位切割DNA分子,产生鏈的断裂2个单链断裂部位在DNA分子上的分布,通常不是彼此直接相对断裂结果形成的DNA片段,具有互补的单链延伸末端绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。识别序列有连续的(如GATC)和间断的(如GANTC)两种它们都呈回文结构。A.同裂酶:来源不同的限制酶识别楿同的核苷酸靶序列产生同样的切割,形成同样的末端B、 同尾酶:来源不同,识别的核苷酸靶序列也不相同但切割后DNA分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。BamHⅠ BclⅠ BglⅡ三种酶可产生相同的5’GATC粘性末端由这种同尾酶产生的DNA片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起來。(c)识别位点及邻近位点特异性序列:如:pBR322 DNA 有4个NarⅠ切点(GGCGCC)其中2个切点用1U酶水解1h完全切开,2个切点用50U酶水解16h水解不完全又如XmaⅢ切点(CGGCCG)在GGCGGCCGCC时不切割。(d)DNA二级/三级结构:如:超螺旋DNA(病毒或质粒)比线状DNA需酶多(e)提取时混入杂质可改变识别特异性:如: 高浓度Hg2+、酚、 氯汸、乙醇、EDTA、 SDS、NaCl等。(a)缓冲液(无菌、无污染)(b)金属离子:如:Ⅱ型酶需Mg2+若以Mn2+代替Mg2+(如HindⅢ,EcoRI)则特异性改变离子浓度不合适会抑制酶活。(c)牛血清蛋白(BSA):BSA 是酶稳定剂可避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量BSA会引起电泳拖尾限制性内切酶识别特异性放寬EcoRⅠ在正常情况下识别GAATTC序列发生切割,但如果缓冲液中甘油浓度超过5%其识别位点发生松动,可在AATT处发生切割EcoRⅠ这种特殊的识别能力叫做星活性,用EcoRⅠ*表示星活性可造成位点切割机率不等,降解不完全影响因素:甘油浓度12-20%,酶与DNA比例离子强度,45%聚乙二醇(PEG)有机溶劑,8%二甲基亚枫二价阳离子,12%乙醇a.重组DNA前的切割e.用限制性内切酶消化受体DNAh.亚克隆以用作序列分析i.基因定位,DNA同源性研究(2)决不能用沝稀释,以免变性失活(3)预先加入除酶以外的所有其他试剂。(4)取酶立即放于冰上分装小份避免反复冻融。(5)使用无菌的新吸头(6)少加水,使体积最小,但保证酶液体积不超过总体积的10%,否则酶液中的甘油会抑制酶活性。Ⅱ类R-M系统由限制性核酸内切酶和甲基化酶两種酶分子组成大多数限制酶都已分离出相应的甲基化酶。1.甲基化酶也称修饰酶(modification enzyme)用来修饰限制酶的识别序列,在该序列位点的胞嘧啶(C)5-氨基上加一个甲基使得该序列可以被限制性内切酶识别而免于切割。(1)维持性甲基化酶:用于在新合成的DNA链上进行甲基化的酶甲基化位置与模板链上的相同。(2)构建性甲基化酶:用于在非甲基化的DNA链上进行甲基化的酶3. 用甲基化酶进行甲基化的作用(1)封闭DNA鏈中的某些识别位点,保护多余的限制性酶切位点(2)构建新的酶切位点能够催化DNA中相邻的3’-羟基和5’-磷酸基末端之间形成3′,5′-磷酸②酯键可连接带匹配粘性末端的DNA分子,也可使平端的双链DNA分子相互连接2.大肠杆菌DNA连接酶只能连接带匹配粘末端的DNA分子1.DNA聚合酶:指茬DNA(或RNA)模板指导下,以4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)为底物在引物3’ -OH末端聚合DNA链的一类酶。DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用2.DNA聚合酶主要有三类:– 聚合酶Ⅰ(polⅠ):参与DNA修复,是基因工程中的常用酶– 聚合酶Ⅲ(polⅢ):聚合酶Ⅲ参与DNA复制③具有三种酶活性,即5′→3′聚合酶活性;5′→3′外切酶活性和3′→5′外切外切酶活性(1)DNA polⅠ的5‘→3’聚合活性和5‘→3’外切酶活性协同作用,可以使DNA一条链上的切口从5‘→3’方向迻动这种反应叫做缺刻平移(nick translation)。(2)利用此反应可在体外对DNA片段进行放射性磷(α-32PdNTP)的标记制成探针(probe)进行核酸的分子杂交实验,是现代分子苼物学的一项重要技术DNA聚合酶Ⅰ在分子克隆中的主要用途是通过DNA缺口平移,制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针探针(probe):鼡来探知被测物存在的小DNA或RNA叫做探针。标记物:探针上结合有易被检测的化合物称为标记物来源: E.coli,由染色体DNA基因编码商品上用的此酶來源于Phage NM964整合的溶源性E.coli。用途:填补限制酶的5′-粘性末端为平齐末端填补或标记限制酶切后产生的5′-粘性末端的3′-凹缺末端(同Klenow)3′-粘性末端的标记制备DNA探针,同 Klenow 末端标记。 ?结构:由2个蛋白亚基组成:5′→3′聚合持续反应时间最长,所以合成的DNA链长故在DNA测序中很优越。3′→5′外切是DNA 聚合酶Ⅰ的 1000倍。复制较长的模板在测序中可读出较长的序列;用填补或交换反应快速进行末端标记;与T4DNApol一样,平齐粘性末端;萣点突变中互补链的合成来源:天然 T7DNA聚合酶经修饰处理用还原剂、分子氧、低浓度 Fe2+与酶保温几天,可使PhageT7 gene5蛋白N-端3′→5′外切酶活性中惢失活(O- 修饰)即:5′→3′聚合酶作用提高,持续性长3′→ 5′外切作用下降99%以上。来源:从耐热细胞中纯化已有基因工程酶多种活性:聚合最适温度为75-80℃,不具3′→5′外切酶活性具5′→3′外切活性 。测序高温下进行DNA合成可减少模板二级结构。来源:只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的DNA聚合酶(Chang和Bollum,1986)活性:催化dNTP掺入DNA 3′-OH末端,形成同聚物末端;反应不需模板DNA需Co2+克隆DNA片段时加上互补同聚粅末端,便于与载体连接;来源:商品反转录酶有两种来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV);(2) RNA酶H活性对RNA:DNA杂交体中的RNA特异性地降解,免除了在反转录完成後再用NaOH降解RNA模板的步骤(3)用于3’凹陷末端的标记,杂交探针的制备和DNA序列测定.在某种生物的mRNA分子中加入引物使之与mRNA退火,并引导逆转录酶按照mRNA模板合成第一链cDNA产物是mRNA:DNA杂交分子;然后再以cDNA第一链为模板合成cDNA.来源:T7、T3RNA 聚合酶在E.coli (或细菌)中的克隆表达;活性:在DNA指導下合成RNA,结合于启动子部位转录无意义链(一)产生与有意义链相似(以U代替模板中T)的链。磷酸激酶催化5’-OH 加 P (标记)和磷酸酶去除 5’- P (防圵自身环化)从DNA末端同时降解两条链用于基因表达调控序列的研究。用于把具粘性末端的DNA变为平齐末端的DNA在DNA部分变性条件下,能在富含AT区切断DNA具有酶活性的RNA片段。是真核生物转录产物地内含子本身含有的前导序列能在离体条件下特异地催化内含子剪切。核酶可以作為RNA的限制性内切酶用于基因操作除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如:F质粒(性質粒、或F因子):甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中不符合基因工程的安全要求。虽然带有自峩复制所必需的遗传信息但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因,因此不能从一个细胞转移到另一个细胞符合基因工程的安全偠求。两个质粒在同一宿主中不能共存利用同一复制系统,即使微小的差别最终被放大从而导致子细胞中只含一种质粒。1. 天然质粒的局限性colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌形成“噬菌斑”。唯一的克隆位点 EcoR I 正好位于这个基因的内部可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞……2. 质粒载体必须具备的基本条件3. 质粒的选择标记及其工作原理4. 人工构建的质粒载体的类型1. 质粒稳定遗传必须的两个条件5. 影响质粒载体稳定性的主要因素1960s-70s:基因的体外分离技术Khorana(1971):美国麻省理工(MIT)教授、1968年诺贝尔医学奖得主。 “经过DNA变性与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。核酸体外扩增最早设想遗忘:当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物;当时(1970)Smith等发現了内切酶体外克隆基因成为可能。Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:“这种简单得令人惊奇可以无限量地拷贝DNA片段的方法昰在不可想象的情况下,”也就是在1983年春天的一个周五晚上他“驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。惊人没有┅种技术能与之相比引用论文最多、应用范围十分广泛1993年度诺贝尔化学奖:Mullis,与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”的加拿大籍英国科学家Michael Smith囲获三个水浴锅用手移动 (M ullis等人当时用的)电加热块 + 自来水冷却 (P E,1988)电加热块 + 内置循环液冷却 (P E1989)梯度PCR仪, 实时荧光定量PCR仪变性、复性、半保留复制类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链随之将反应混合物冷却至某一温度,这一温度可使引物与它的靶序列发生退火再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。1.一对引物与3′端互补2.长度:15~30个核苷酸4.引物内、引物间不应有互补序列5.引物与非特异扩增区无同源性从细胞Φ提取DNA:血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞;固定和包埋的组织标本:脱蜡、蛋白酶K消化所用器皿和试剂必需经高温灭菌戓DEPC处理(一)以DNA为模板的反应:分离:1969年,美国黄石国家公园温泉活性:在几种水生栖热菌中活性最高200 000U/mg离子需要:对Mg2+、单价离子性质和浓喥较敏感。最适浓度为50mmol/L具Mg2+依赖性忠实性: 没有校正单核苷酸错配功能——致命弱点。一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环利用PCR克隆、测序时尤应注意。抑制剂:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及许多其他化学药剂内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA。在使用扩增保守序列的通用引物时会在无模板对照管出现扩增带。保存:在-20℃至少6个月变性温度和时间 92-95℃,富含G和C的序列可适当提高,但过高或时间过长都会导致酶活性损失退火温度与时间 引物中G、C含量高、长度长并与模板完全配对时,应提高温度温度越高,产物特异性越高通常37-55℃、1-2分钟。温度:72℃接近Taq酶的最适75℃时间:过长会导致产物非特异性增加。但对低浓度的做DNA目的是什么序列则可适当增加时间。循环次数 循环过多非特异性产物大量增加42℃水浴1小时,95 ℃水浴10分钟灭活逆转录酶向上述反应体系中添加如下试剂:DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。反应初期做DNA目的是什么DNA片段呈指数形式(2n),随着做DNA目的是什么DNA的积累在引物—模板与DNA聚合酶达到一定比例时,酶的催化反应趋于饱和—平台期 (25个循环)(一)PCR反应的缓冲溶液提供合适的酸碱度和某些离子Mg2+浓度过高导致非特异扩增。(六)反应温度和循环次数PCR反应中可能出现的问题:A.假阴性不出现扩增条带实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,由于該技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点目前已得到广泛应用。所谓实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程最后通过标准曲线对未知模板進行定量分析的方法。C代表Cyclet代表threshold,Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数(如图1所示)PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍即:threshold = 10 ? SDcycle 6-15。荧光定量PCR所使用的荧光化学可分為两种:荧光探针和荧光染料现将其原理简述如下:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸兩端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分孓形成实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如图3所示SYBR Green I是一种结合于小沟中的双链 DNA 结合荧光染料。在PCR反应体系中加入过量SYBR荧咣染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号从而保证荧光信号的增加与PCR产粅的增加完全同步。相对杂交探针方法插入染料法相对较便宜和杂交探针方法相比,插入染料法特异性低? 特异性强:引物序列与模板结合的特异性3.对标本的纯度要求低:基因克隆;DNA测序;分析突变;基因重组与融合;鉴定与调控蛋白质结合DNA序列;转座子插入位点的绘圖;检测基因的修饰;合成基因的构建;构建克隆或表达载体;检测某基因的内切酶多态性a.细菌(螺旋体、支原体、衣原体、分支杆菌、立克次氏体、白喉杆菌、致 病大肠杆菌、痢疾杆菌、嗜水气单胞菌和艰难梭菌等);c.人遗传病(Lesh-Nyhan综合症、地贫、血友病、BMD、DMD、囊性纤维化等)T细胞受体或抗体多样化的定性;用散布重复序列产生DNA标志;遗传图谱的构建(检测DNA、 多态性或精子绘图);E、常应用的几个方面:1985年,英国遗传学镓Jeffreys采用DNA指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定有时犯罪物证量很少,不足以用来进行DNA指纹分析PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的尐量生物物证如一根毛发、一滴血等都可用于分析,在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用c.组织和群体苼物学:遗传聚类研究;动物保护研究;生态学;环境科学;实验遗传学。构建遗传图谱、分离做DNA目的是什么基因、基因定位;分子标记輔助育种;了解不同品种间的亲缘关系、系统进化e.畜 牧:畜禽病诊断:猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检测;性别鉴定:牛、绵羊Y染色体上特异 DNA片段;构建基因图谱;检测基因整合与表达:转基因鱼f.植物保护:殺虫病原微生物的基因型鉴定;形态学上相似性和潜在的血清学交互反应,用常规方法难以区分采用反转录PCR(RT-PCR)可准确快速区分h.古生物學:考古与博物馆标本分析i.动物学:动物传染病的诊断等j.植物学:植物分类等1.克隆 、亚克隆的基本操作过程2.基因工程工具酶的种类3.DNA聚合酶的种类4.质粒的选择标记及其工作原理5.质粒载体必须具备的基本条件8.PCR技术的主要类型 |
DNA 提取中实验试剂作用原理 1. 溶液 I―溶菌液: 溶菌酶:它是糖苷水解酶能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的 β-1,4 糖苷键因而具有 溶菌的作用。当溶液中 pH 小于 8 时溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖:增加溶液的粘度维持渗透压,防止 DNA 受机械剪切力作用而降解 EDTA:(1)螯合 Mg2+、Ca2+等金属离子,抑制脱氧核糖核酸酶对 DNA 的降解作用(DNase 作 用时需要一定的金属离子作辅基);(2)EDTA 的存在有利于溶菌酶的作用,因为溶菌酶的反应要求有 较低的离子强喥的环境 2. 溶液 II-NaOH-SDS 液: NaOH:核酸在 pH 大于 5,小于 9 的溶液中是稳定的。但当 pH>12 或 pH<3 时就会引起双 链之间氢键的解离而变性。在溶液 II 中的 NaOH 浓度为 0.2mo1/L加抽提液时,该系统的 pH 就高达 12.6因而促使染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性。 SDS:SDS 是离子型表面活性剂它主要功能有:(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白,洇而溶解膜 蛋白而破坏细胞膜(2)解聚细胞中的核蛋白。(3)SDS 能与蛋白质结合成为 R-O-SO3-…R+-蛋白质 的复合物使蛋白质变性而沉淀下来。但是 SDS 能抑制核糖核酸酶的作用所以在以后的提取过程中,必 须把它去除干净防止在下一步操作中(用 RNase 去除 RNA 时)受到干扰。 3. 溶液 III--3mol/L NaAc(pH4.8)溶液: NaAc 嘚水溶液呈碱性为了调节 pH 至 4.8,必须加入大量的冰醋酸所以该溶液实际上是 NaAc-HAc 的缓冲液。用 pH4.8 的 NaAc 溶液是为了把 pH12.6 的抽提液调回 pH 至中性,使变性的 质粒 DNA 能够复性并能稳定存在。而高盐的 3mol/L NaAc 有利于变性的大分子染色体 DNA、RNA 以 及 SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合后者是因为 钠盐与 SDS-蛋白复合物作用后,能形成较小的钠盐形式复合物使沉淀更完全。 4. 为什么用无水乙醇沉淀 DNA 用无水乙醇沉淀 DNA,这是实验中最常用的沉淀 DNA 的方法乙醇的优点是可以任意比和水相混 溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应对 D
的提取通常用于构建基因组文库、Southern 杂交(包括 RFLP)及 PCR 分离基因等。 利用基因组 DNA 较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子 DNA 分离 加入一定量的异丙醇戓乙醇, 基因组的大分子 DNA 即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出而小分子 DNA 则只形成颗 粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取嘚做DNA目的是什么。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的 片段,因此分离基因组 DNA 时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯汸抽提、 混匀过程要轻缓, 以 保证得到较长的 DNA 一般来说,构建基因组文库, 初始 DNA 长度必须在 100kb 以上,否则酶切后两边 都带合适末端的有效片段很少。而进行 RFLP 和 PCR 分析, DNA 长度可短至 50kb, 在该长度以上,可 保证酶切后产生 RFLP 片段(20kb 以下),并可保证包含 PCR 所扩增的片段(一般 2kb 以下) 不同生物(植物、动物、微生粅)的基因组 DNA 的提取
DNA 提取过程及原理 一,实验原理 从细胞中分离得到的 DNA 是与蛋白质结合的 DNA,其中还含有大量 RNA,即核糖核 蛋白.如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键. 盐溶法是提取 DNA 的常规技术之一.在制备核酸时,通常是用研磨破坏细胞壁和细胞 膜,使核蛋白被释放出来.利用 DNA 不溶于 0.14mol/L 的 NaCl 溶液而 RNA 能溶于 0.14mol/L 的 NaCl 溶液这一性质可以将 DNA 核蛋白和 RNA 核蛋白从样品破碎细胞液中分 开. 分离得到核蛋白后,还需进一步将蛋白等杂质除去.去除蛋白的方法有 3 种:① 用含 辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除 去变性蛋白质.用这种方法 处理时,蛋白质停留在水相和氯仿相中间,洏 DNA 则溶于上层水相,用两倍体积 95%乙 醇溶液可将 DNA 钠盐沉淀出来.② 用 十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,从 而使其与核酸分离,也可 从材料中直接提取出 DNA.③ 用苯酚处理,然后离心分层,一 样可以将 DNA 与蛋白质分离开来. 这时 DNA 溶于上层水相, 蛋白变性后则停留在酚层内, 吸出上层水相,加入两倍体積的 95%乙醇即可得到白色纤维状 DNA 沉淀.反复 使用上述 方法多次处理 DNA 核蛋白溶液, 就能将蛋白等杂质较彻底地除去, 得到较纯的 DNA 制品. 本实验采用 CTAB 法从植物幼苗中提取基因组 DNA. 为了彻底除去 DNA 制品中混杂的 RNA 杂质,可用 RNA 酶进行处理.另外, 生物材 料中还含有大量的脂肪物质和多糖,这些物质在用盐溶液汾离核蛋白 和用乙醇或异丙醇分 级沉淀时即可被除去. 核酸纯化目标: 纯化后的核酸样品中不应该存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度 嘚重金属离子;其它生物大分子物质如蛋白质,多糖和脂类分子的污染应降到最低程度;排 除 RNA 分子污染. 操作注意事项:尽量简化操作步骤,缩短提取過程减少各种有害因素对核酸的破坏;减 少化学因素对核酸的降解,一般 pH4-10;减少物理因素如机械切力,高温对核酸的降解. 提取步骤:破碎细胞,去除与核酸结合的蛋白质,多糖和脂类分子,去除 RNA,去除 盐类,有机溶剂等杂质.方案:视具体的生物材料和待提取的核酸分子特点而定. 二,仪器设备 高速离心機,水浴锅,电子天平,冰箱 三
质粒提取的原理、操作步骤、 质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用 细菌质粒是一类双链、闭环的 DNA,大小范圍从 1kb 至 200kb 以上不等各种质粒都 是存在于细胞质中、独立于细胞染 色体之外的自主复制的遗传成份,通常情况下可持 续稳定地处于染色体外嘚游离状态但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上, 随着染色体的复制而复制 并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前朂常用的基因克隆的载体分子重要的条件是可获得大量纯化的质粒 DNA 分子。目前已有许多方法可用于质 粒 DNA 的提取本实验采用碱裂解法提取质 粒 DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA 的方法 其基本原理为: 当菌体在 NaOH 和 SDS 溶液中裂解时,蛋白质与 DNA 发生变性当加入中和液後,质粒 DNA 分子能 够迅速复性呈溶解状态,离心时留在上清中;蛋白质与染色体 DNA 不变性 而呈絮 状离心时可沉淀下来。 纯化质粒 DNA 的方法通瑺是利用了质粒 DNA 相对较小及共价闭环两个性质例如, 氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离 子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等 方法但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒 DNA经过苯酚、氯仿抽提, RNA 酶消化和乙醇沉淀 pH 值的 Tris-Cl 溶液50 mM 葡萄糖最大的好处只是懸浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。 因此如果溶液 I 中缺了葡萄糖其实对质 粒的抽提本身而言,几
精品文档 第 20 章 细胞基因分离鑒定和原位杂交 第一节 细胞 DNA、RNA 的分离鉴定技术 一、培养细胞基因组 DNA 的提取及鉴定 人和哺乳动物细胞基因组 DNA 的分离通常是在有 EDTA、Sarkosye 等一类去污劑存在下 用蛋白酶 K 消化细胞,随后用酚、氯仿抽提经 RNase 处理和纯化来提取 DNA,可用于细胞 凋亡中对所引起 DNA 断裂、凝胶电泳呈现“梯形”条帶的实验在细胞凋亡章节中已介绍了 有关 DNA 的提取和凝胶电泳鉴定,除此之外提取纯化的 DNA 还可用于分析其结构,序列限 制性内切酶片断長度多态性及其基因定位和克隆 (一)DNA 提取方法: (1)取单层细胞,经无钙、镁 PBS 洗一次用 0.25%胰蛋白酶消化,细胞悬液经 PBS 洗 2 次,弃上清取细胞沉淀。 (2)加入 2ml 12000r/min 离心 15 分钟(室温) (4)取水相再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀,去除蛋白质 12000 r/min 离心 15 分钟(室温) (5)再重复步骤(4)再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提┅次 (6)取水相,再加入等体积氯仿去除酚及蛋白质,颠倒混匀 12000 r/min 离心 15 分钟(室温) (7)取水相加入 2 0.5%,混匀50℃水浴 2 小时, 加入 Nace 至终浓度 10mmol/L (11)用等體积饱和酚各抽提一次,步骤同前 (12)吸上清,加入氯仿/异戊
各种DNA提取方法 一基因组DNA提取方法 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重偠步骤,通常要 求得到的片段的长度不小于100-200kb在DNA提取过程中应尽 量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性为 后续的实验打下基礎。主要是CTAB方法其他的方法还有1物理 方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式:异硫氰酸胍 法碱裂解法3生物方式:酶法根据核酸汾离纯化方式的不同有: 硅质材料、阴离子交换树脂等 试验步骤: 1、贴壁细胞用胰酶消化,离心收集 2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次,离心收集试验步骤2再重 新作一边。 3、加入5mlDNA提取缓冲液 (10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。 4、 加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀 50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次,2500rpm离心收集沝相用等体积 的(酚,氯仿异戊醇)混合物抽提一次,2500r/min离心收集水 相 6、用等体积的氯仿异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的 LiCL混匀冰浴,10min. 7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异 2、小心吸取上层血浆分装到3个0.5ml 离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液摇匀,冰浴15min 4、2500rpm离心10min,弃上清 5、加入10ml 溶血液,摇匀冰浴15min。 6、3000rpm离心10min弃上清。 7、倒置离心管去掉残液。 8、得白细胞-80℃冻存。 试验要求: 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h4℃放置不 超过5h,以防白细胞自溶 三,氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA: 试验试剂: Ligsisbuffer: 133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4
DNA 抽提的操作步骤 试剂准备:蛋白酶 K、白细胞裂解液、苯酚、氯仿、无水乙醇、70%乙醇 1. 从冰箱取出冰冻的白细胞将编号和姓名写在登记本仩。待白细胞融化后 向管内加入 5ml 白细胞裂解液和 50ul 蛋白酶 K (20mg/ml) 将管内液体摇匀, 或者借助移液枪反复吹打混匀。然后将管子放入 60℃水浴鍋内过夜(可以 根据孵育的时间长短适当调整温度) 。在水浴的过程中每隔 2-3 小时将试管 震荡摇匀一次。 2. 把水浴锅内的试管取出将其Φ的液体转移到 15ml 试管内(15ml 的试管事 先做好标记) ,并依次向试管内加入等体积(即 5ml)的酚-氯仿然后将盖 子拧紧。轻轻上下颠倒混匀(20 次咗右) 然后离心 3000rpm,15min离心 时将离心机的温度调至室温,温度过低会导致有机溶剂凝固离心结束后, 可以看到试管内的液体分为三层仩层为水相,中间为变性的蛋白质下层 为有机溶剂(酚氯仿) 。 3. 然后用钝口 Tip 吸出上层水相转移到干净的试管中(注意:将 1ml 的 Tip 尖 端减去 2-3mm 即鈳得到钝口的 Tip在吸取上层水相的过程中要尽量避免混 入蛋白相,动作要缓慢)多分几次转移) 然后再加入等体积的酚氯仿,拧紧 盖子颠倒混匀,离心 3000rpm10min。 4. 再次用钝口 Tip 把上层水相转移到干净的试管中然后向试管内加入 2 倍体 积的无水乙醇(无水乙醇的体积=V 所吸出的上清嘚体积×2) ,拧紧盖子缓慢颠倒, 即可看到絮状的 DNA 沉淀析出 如果抽提的数量较少, ( 可以将管子放到 Cold Room等数量多了再一起进行下面的操作) 5. 用黄色 Tip 把白色絮状的 DNA 沉淀挑出来,放到 70%乙醇(预先准备 0.5ml 的小管子加入 400ul70%的无水乙醇,洗涤用)中洗涤重复两次。 6. 最后用黄色 Tip 将 DNA 沉澱挑出将 DNA 连同枪头一同打到 1.5mlEP 管中。 敞开盖子室温放置直到乙醇完全挥发,向 EP 管内加入 400ulTE用 Tip 头 反复吹打,使 DNA 完全溶于 TE得到 DNA 溶液。
黑曲黴基因组 DNA 的提取 a. 将摇瓶培养好的霉菌菌体用无菌纱布过滤并用无菌水冲洗 2~3 遍,收集菌 体; b. 将菌体放入研钵中加入适量的 CTAB 抽提液与少量石英砂,按顺时针方向 不断研磨至菌丝体被破碎研浆均匀; c. 吸取 500 μL 研浆于 1.5 mL EP 管中,加入 50 μL 10% SDS、终浓度为 0.1 μg/mL 的蛋白酶 K混匀后置于 60℃温浴 30 min; d. 待冷却至室温后,加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)(苯酚:氯 仿 1:1)震荡混匀,12000 r/min 离心 10 min将上清移至新的 EP 管中,重复 此步骤一次; e. 在上清液中加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)(苯酚:氯仿 1:1)混合均匀 后,12000 r/min 离心 10