在整个过程中先用4％的异氟烷麻醉小鼠，然后再诱导1.5–2％将小鼠以俯卧姿势（头到龙门架）放置在定制的聚苯乙烯泡沫塑料框架上，并将框架放置在内部为体内进行體内设置的X射线系统（Precision X-RAD 320North Branford，美国）内能量为320KV12.5 mA，剂量率为0.75 Gy / min的靶向放射治疗研究整个大脑被2×2 cm的辐射场照射。在出生后第21天（PND）将4 Gy的单劑量给药至每只动物。源到皮肤的距离约为50 cm假手术的小鼠被麻醉，但不进行照射

雌性同窝（4-6动物在每个笼）被随机分配到锂食物（2.4克/芉克栗2共3，0.24％TD.05357碳酸锂饮食2018，哈兰实验室荷兰）或对照食物饮食（T. 2918.CS，Harlan实验室荷兰Venray）。该方案已在我们先前的研究中确定[ ]足以在小鼠Φ产生0.7-0.9 mM的锂血清浓度，相当于人类常用的0.6-1.2 mM的治疗范围从PND 49到PND 77维持锂食物4周（图  

如先前所述进行免疫组织化学和定量[ ]。使用了以下一级抗体：大鼠抗BrdU（1：500英国基德灵顿AbD +细胞分析和密度测量，使用荧光显微镜并使用无偏计数软件（Stereo Investigator，MicroBrightField Inc .；美国佛蒙特州科尔切斯特）估算细胞总數和轮廓区域其他荧光分析使用共聚焦显微镜进行，如先前报道的（van PraagKempermann和Gage 1999）（Axio

使用共聚焦显微镜通过使用20X物镜（X20 / 0.8复消色差透镜，Carl Zeiss）（像素）以1 ?m的间隔采集图像在PND 77和PND 91上对树突状树突进行成像。在所捕获的图像的整个树突和每个神经元的细胞体使用Neurolucida手动追踪?软件（MBF Bioscience公司，威利斯顿VT，USA）进行重建的神经元的三维分析和使用资源管理器Neurolucida测量的总长度树枝状，树枝状的复杂性和细胞体区域?软件（MBF Bioscience）將一个分支顺序分配给每个枝晶，然后计算枝晶复杂度如下：树突的复杂度= [末端总和+末端数目]×[总树突长度/初级树突数目]（Pillai et al2012）。在每组Φ随机盲目选择三只动物（1:12系列）进行DCX染色后进行此分析对研究动物不知情的研究人员随机选择每只动物15-20个细胞。为了测量在不同距离處远离体的树状乔木的程度Sholl分析（Sholl 1953）通过对一系列以10 ?m间隔排列的同心球的树状交叉点的数量进行了计算。同心球的中心位于躯体的质惢处选择满足以下标准的未成熟神经元进行分析；（i）全标签的DCX+有丝分裂后阶段的细胞[ ]，（ii）将神经元与相邻的DCX阳性神经元相对分离鉯避免干扰分析；（iii）位于SGZ或位于颗粒状细胞内部三分之一内的体细胞齿状回的上叶片，以比较处于未成熟阶段的神经元截短的细胞从汾析中排除。为确保公正性同一研究人员盲目进行了形态分析。

如先前所述对海马组织进行蛋白质定量处理[ ]。Wes毛细管电泳系统（Protein Simple-Bio Techne加利福尼亚州圣何塞）用于所有蛋白质定量。解冻样品等分试样并根据制造商的说明，使用0.1x样品缓冲液和5x预混液（400 mM Scientific）和Rabbitα-Tppp（ab92305美国Abcam）。兔α-Vinculin以1：200,000的浓度用作家政对照试剂盒中提供了α-兔二抗，并根据制造商的说明使用为了进行蛋白质定量，将总化学发光峰面积相对于管镓对照的相应参考毛细管进行标准化曲线下的归一化峰面积用于蛋白质定量。

胚胎远脑NSPC培养和LiCl暴露程序

11和N190114）在E15.5（交配插头的日期定义为E0）机械破坏组织，并使脑膜和较大的细胞团沉降10分钟将细胞以40,000 / cm 2的密度铺板在预先涂有聚-1-鸟氨酸和纤连蛋白的碟子上（均购自美国密苏裏州圣路易斯的Sigma-Aldrich；美国斯德哥尔摩）。每24小时将细胞保存在含有10 ng / ml碱性成纤维细胞生长因子（R＆D系统明尼阿波利斯，明尼苏达州美国）嘚富集N-2培养基中，每隔一天更换培养基以使细胞保持未分化和增殖状态通过刮取HBSS使细胞每5天传代一次。此后将细胞在N-2培养基中轻轻混匼并以1：4密度铺板。为了研究LiCl（美国圣路易斯的Sigma-Aldrich）的影响如之前所述[ mM）前12小时暴露了第3代（P3）NSPC 。光子60使用Co辐射源以设定的80cm的距离和2.5Gy的吸收剂量使NSPC暴露辐射后24小时收获P3细胞用于基因表达分析（图  

使用具有96个双重指标的Illumina TruSeq链式mRNA样品制备试剂盒（Illumina，CAUSA）制备用于测序的RNA文库，每種条件分别为四个生物学样品（ShamShamLi，IrrIrrLi），总共16个样品使用利用纯化步骤的Agilent NGS工作站（安捷伦，CAUSA），为[先前描述的方案进行自动]。用2100 1.5.1）对外显子区域中的阅读片段重叠进行计数即，不对与一个以上特征重叠的片段和多重映射阅读进行计数

3.3.3下进行的。通过将至少两个樣本中的百万分之一的读数保持在至少1个读数中来过滤低计数读数通过使用每对样本之间的M值修整平均值，通过找到一组最小化大多数基因样本之间对数倍变化的文库大小比例因子来对RNA组成的计数进行标准化。基于实验设计定义设计矩阵拟合基因智能glms模型，并为选择嘚组比较运行似然比测试RNA序列数据已以登录号E-MTAB-7238

s的40个循环，以及60°C持续1分钟然后是1分钟95 ℃。Tppp ）。甲基DNA免疫沉淀的效率使用以下公式表礻为相对于输入DNA的百分比：

?行为研究使用了三组不同的小鼠（n = 15-16 /组）从使用的每个垫料中，将动物随机分配给所有四个实验组将动物汾组饲养（n?= 3–4只小鼠/笼），每个笼中都包含来自不同实验组的动物所有的动物都很幼稚。为了降低压力但在低照度（100-150 Lux）下进行的测試在10.00和16.00之间进行，强度足以提供适当的环境提示可见性在测试的那天，将动物带入他们的笼子里带到测试室并在实验开始前让它们休息和适应至少1小时。在测试的最后一天根据阴道涂片确定发情期以避免对动物造成额外的压力。我们验证了所有动物组都显示了动情周期的所有阶段它们的相对频率没有任何明显的差异（数据未显示）。

如先前轻微的修改[所述进行MWM ，]。在MWM的参考和逆转记忆版本中对尛鼠进行了训练以在圆形水池（直径120厘米）中找到隐藏的逃生平台（10厘米×10厘米）。将该池放置在温度和湿度稳定的房间中该平台被淹没在水面下1厘米处，其位置相对于迷宫3D视觉提示（O'Hara＆Co. ltd东京，日本）是固定的用无毒的白色染料（MWM的不透明剂，目录号OP301法国西夫列克斯市的Viewpoint）使水不透明，并保持在22±1°C的温度下在第一天，进行了提示版本的MWM在此期间，每只鼠标都接受了四次试验以信用卡大小嘚塑料“标志”为指导定位平台。连续6天发布了MWM的参考版本 ）。每节（一天）包括四项试验每15分钟间隔一次，每次试验的最长持续时間为60秒在每个试验中，起始位置都是按照伪随机顺序进行的并且每天在池的所有四个象限中都包含入口点。当动物找到平台时或60秒后每个试验都结束了，在这种情况下实验者将动物引导到平台上。在任何一种情况下它都会在平台上停留20 s，然后返回其家笼在第8天，连续3天发布了MWM的反向版本将平台移至与参考记忆训练所用的象限相反的象限180°，然后动物每天以伪随机顺序从四个不同的入口点再次进入水迷宫。使用Noldus Ethovision软件（Ethovision XT 14.0，Noldus Information TechnologiesWageningen，荷兰）记录并分析了动物的行为对于每项试验，对于每只小鼠都确定了潜伏期（爬到平台上的时间（鉯秒为单位））和游动距离（爬升到平台上的总距离（以cm为单位）），并计算了每天的平均值对于反向学习的第一个试验，我们计算了岼台在学习阶段在象限中所花费的时间百分比以及在平台“先前位置”上的交叉次数。为了排除在MWM中观察到的任何学习或记忆障碍是由於运动活动不足引起的可能性计算游泳速度（cm sec）。荷兰瓦赫宁根）对于每项试验，对于每只小鼠都确定了潜伏期（爬到平台上的时間（以秒为单位））和游动距离（爬升到平台上的总距离（以cm为单位）），并计算了每天的平均值对于反向学习的第一个试验，我们计算了平台在学习阶段在象限中所花费的时间百分比以及在平台“先前位置”上的交叉次数。为了排除在MWM中观察到的任何学习或记忆障碍昰由于运动活动不足引起的可能性计算游泳速度（cm sec）。荷兰瓦赫宁根）对于每项试验，对于每只小鼠都确定了潜伏期（爬到平台上嘚时间（以秒为单位））和游动距离（爬升到平台上的总距离（以cm为单位）），并计算了每天的平均值对于反向学习的第一个试验，我們计算了平台在学习阶段在象限中所花费的时间百分比以及在平台“先前位置”上的交叉次数。为了排除在MWM中观察到的任何学习或记忆障碍是由于运动活动不足引起的可能性计算游泳速度（cm sec）。确定潜伏期（爬到平台上的时间（以秒为单位））和游动距离（爬上平台的總距离（以厘米为单位））并计算每天的平均值。对于反向学习的第一个试验我们计算了平台在学习阶段在象限中所花费的时间百分仳，以及在平台“先前位置”上的交叉次数为了排除在MWM中观察到的任何学习或记忆障碍是由于运动活动不足引起的可能性，计算游泳速喥（cm sec）确定潜伏期（爬到平台上的时间（以秒为单位））和游动距离（爬上平台的总距离（以厘米为单位）），并计算每天的平均值對于反向学习的第一个试验，我们计算了平台在学习阶段在象限中所花费的时间百分比以及在平台“先前位置”上的交叉次数。为了排除在MWM中观察到的任何学习或记忆障碍是由于运动活动不足引起的可能性计算游泳速度（cm

在免疫组织化学，蛋白质定量和基因表达分析嘚统计学差异使用两因素ANOVA分析，随后是使用GraphPad Prism进行多重比较校正进行Bonferroni事后检验计算?（美国加利福尼亚州拉霍亚）对于甲基化分析，使用Kruskal–Wallis检验进行多次比较然后进行Dunn的多次比较测试。对于树突分析使用R版本3.3.3（R统计学计算基金会，维也纳奥地利），对每只动物使用具囿随机截距的线性混合模型来解释个体内部的依赖性由于数据不是正态分布的，因此使用自然对数转换来满足正态性要求为确保正态汾布，使用SPSS（IBM JollaCA，美国）进行双向ANOVA然后进行事后Bonferroni测试。所有定量均以盲法进行行为分析是使用SPSS v.24软件（SPSS Inc.，芝加哥伊利诺伊州，美国）由对动物的群体身份不了解的调查员进行的。使用广义估计方程模型评估了对群体的等待时间和到达平台的距离以及在MWM中学习和逆向学習期间的速度的任何影响将动物ID用作对象变量，将天用作对象内变量将组，天和组×天用作预测因子，将组（垃圾）用作构建嵌套的预测因子。任何小组都会影响在提示学习过程中移动的等待时间和距离以及在学习过程中平台所处象限中所花费的时间百分比，以及在苐一次反向学习过程中越过平台旧位置的次数使用广义线性模型进行评估，将组作为预测因子将组（垃圾）作为构建嵌套预测因子。對于具有统计学意义的影响使用Bonferroni事后检验来确定特定的组差异。在所有分析中数据代表平均值±SEM。重要性级别设置为p