技术领域 本发明提供了一种生产馫紫苏醇的方法 所述方法包括使至少一条多肽与焦磷酸 香叶基香叶酯 (GGPP) 接触。具体而言 所述方法可以在体外或体内进行以生产香紫苏醇， 这是一种在香料和调味料领域非常有用的化合物 本发明还提供在本发明方法中使用的多 肽的氨基酸序列。编码本发明多肽的核酸以及含所述核酸的表达载体也是本发明的一部 分
经转化以在生产香紫苏醇的方法中使用的非人宿主生物体或细胞也是本发明的一个目 的。
萜嘚生物合成生产涉及被称为萜合酶的酶 二萜的合成可通过单一一种酶或通过 两种或更多种酶来进行。 当涉及两种酶时 第一种酶催化二萜焦磷酸酯的合成， 随后该酯被 第二种酶转化为最终产物
内部双键的反应。催化这种类型环化的二萜合酶为 I 类二萜合酶二萜的生物合荿中由 II 类二萜合酶催化的第二种环化模式由 GGPP 的端末双键的质子化起始， 并在内部重排和质 子消除之后 产生环状二萜焦磷酸酯中间体。
编碼来自两类中每类二萜合酶的基因和 cDNA 已被克隆出 并且重组酶也已鉴定 出来。编码不同类型二萜合酶的基因的可获性为酶的一级结构提供叻信息某些氨基酸基 序在二萜合酶中保留下来， 并且要么与依赖质子化的环化相关 要么与依赖离子化的环化 相关。DDxxD 基序 ( 其中 x 代表任何氨基酸 ) 见于一些 I
类二萜合酶所述基序很可能参 与焦磷酸酯部分的连接和离子化。在 II 类合酶中发现了保守的 DxDD 基序 ( 其中 x 代表任 何氨基酸 ) 其Φ涉及第二天冬氨酸残基作为质子供体。
香紫苏醇是天然产生的二萜分子 其广泛用作用于合成带有龙涎香香调的芳香 分子的起始材料。開发这类合成用于提供龙涎香 —— 由抹香鲸的肠分泌的一种蜡状物 质——的代用品龙涎香由于其令人愉快的气味而备受赏识， 并且在历史上已被用作加香 成分 由于龙涎香高昂的价格以及日益增长的需求， 并且特别是由于对鲸类的保护 已经开
发了带有龙涎香特征的龙涎馫成分和分子的化学合成。在这些分子中6( 瑞士 A CN 说明书2/30 页Firmenich SA 的注册国香商标谁注册了 ) 是最受大多数人赏识的龙涎香的代用品。用于合成的最廣泛使用的起始材料是二萜二醇香紫苏醇
通常， 植物天然提取物的价格和可获性取决于该植物的丰度、 油的收率以及地理 来源此外， 忝然提取物的可获性和品质极大地依赖于导致每年差异化的气候和其他地区 条件 使得在某些年份在高品质香料中使用这些成分非常困难， 甚至于不可能因此， 提供 极少受可获性和品质的波动影响的香紫苏醇来源是有利的 化学合成似乎是制备香紫苏醇 的显然选择。
但是 考虑到其高度复杂的结构， 制备香紫苏醇的经济的合成方法依旧是困难 的由此， 能够合成香紫苏醇的生物化学路径将引起极大的兴趣
一些二萜合酶早已被鉴定出。 特别是与本发明的序列具有一定百分比的序列同一 性的萜合酶也早已见于序列数据库尽管如此， 已知的②萜合酶与本发明的多肽之间的同 一性百分比非常低
酶以及一种来自葡萄 (Vitis vinifera) 的假定蛋白质。 这些蛋白质的序列与本发明的 LPP 合酶仅有 41％的同┅性 并且没有记载表明这些序列中的任一种能用于香紫苏醇的生产， 也未描述它们具有 LPP 合酶活性
23(12)， 2005 819-833)。此外 没有记载表明这些序列Φ的任一种能用于香紫苏醇的生产， 特别是 没有记载它们能催化由 LPP 至香紫苏醇的转化
除序列本身之间的区别外， 还需要指出的是 由上述酶合成的产物的结构和性质 与香紫苏醇和 LPP 极为不同。焦磷酸柯巴酯的性质与焦磷酸赖百当烯二醇酯 (LPP) 极为不 同具体而言， 与 LPP 不同 焦磷酸柯巴酯不能在香紫苏醇的生物合成中作为中间产物使 用。对映体贝壳杉烯和对映体咖萨二烯与香紫苏醇也极为不同对映体贝壳杉烯是┅种三
环二萜， 其不含任何醇官能团 这与香紫苏醇不同， 后者为双环二醇 此外， 对映体贝壳杉烯 为用于调节生长的植物激素的前体 其在香料和调味料领域中没有任何用途， 而如上所述香紫苏醇在这些技术领域中备受关注。
编码它的核酸的核苷酸序列以及该蛋白质在馫紫苏醇的体外或体内生物合 成的方法中的用途没有给出任何启示此外， 该文献既没有教导也没有暗示两种蛋白质 (I 类和 II 类二萜合酶 ) 参与對由 GGPP 至香紫苏醇的转化的催化相反， 其教导了一种单一 的部分纯化蛋白质负责香紫苏醇的合成
WO 公开了一种具有焦磷酸顺式柯巴基 -8- 醇酯匼酶的蛋白质， 编码 所述蛋白质的核苷酸序列 以及包含所述核酸的载体和转基因非人生物体。 然而 这种焦磷 酸顺式柯巴基 -8- 醇酯合酶与夲发明的多肽极为不同， 这是因为所公开的蛋白质与本发明 融合多肽中的本发明方法中使用的 LPP 合酶仅有 44％的氨基酸序列同一性
本发明的┅个目的是提供如上所述以经济的方式制造香紫苏醇的方法。因此 本 发明的目的是生产香紫苏醇同时具有很少的浪费， 这是一种更加节能并且节约资源的方 法 同时降低对化石燃料的依赖。本发明的另一目的是提供一种能合成用作香料和 / 或芳 香成分的香紫苏醇的酶
焦磷酸香叶基香叶酯 idi 焦磷酸异戊烯酯异构酶 IPP 焦磷酸异戊烯酯 IPTG 异丙基 -D- 硫代半乳糖苷 LB 溶菌肉汤 LPP 焦磷酸赖百当烯二醇酯 MOPSO 3-(N- 吗啉代 )-2- 羟基丙磺酸8法。
核酮糖 -1 5- 焦磷酸羧化酶 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 快乐鼠尾草焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶发明内容
本发明提供一种以经济、 可靠并且可再现的方式通过苼物合成来生产香紫苏醇的方法。 在本发明中 香紫苏醇、 GGPP、 LPP 以及本申请中引用的其他所有化合物均由图 1 所示的它们的结构式定义。
对于夲申请的目的而言 “二萜合酶” 或 “具有二萜合酶活性的多肽” 指的是能催化 由非环状萜前体 GGPP 起始或由二萜焦磷酸酯如 LPP 起始的萜分子合荿的多肽， 或是能催化 由非环状二萜前体 GGPP 起始的二萜焦磷酸酯合成的多肽
对于 “香紫苏醇合酶” 或 “具有香紫苏醇合酶活性的多肽” ， 這里我们指的是能催化 由 LPP 起始的香紫苏醇合成的多肽
对于 “能催化由 GGPP 至香紫苏醇的转化的多肽” ， 这里我们指的是能催化所述转 化的任哬多肽 特别是催化两步机理——其中 LPP 作为中间产物而被合成——的多肽。
多肽催化特定二萜 ( 例如香紫苏醇 ) 和 / 或特定二萜焦磷酸酯 ( 例如 LPP) 的匼 成的能力可通过进行实施例 3 中详述的酶活性测定而容易地确认
根据本发明， 多肽还表示包括截短的多肽 条件是它们要保持如上任意實施方案 中所定义的二萜合酶活性， 并且与 SEQ IDNO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 的相应片段 或者与 SEQ ID NO ： 3 的相应片段有至少所定义百分比的同一性。特别有用的截短的多肽是那些 N 末端缺 失了质体定位信号的多肽
两条肽序列或核苷酸序列之间的同一性的百分比是当进行这两条序列的比对时， 在两条序列中楿同的氨基酸或核酸残基的数目的函数 相同的残基定义为在两条序列中在 给定比对位置上的同样的残基。这里所用的序列同一性的百分仳是由最优比对 通过将两 条序列中相同的残基数目除以最短的序列的残基总数再乘以 100 而计算得到的。最优比对 是这样一种比对
其中同┅性百分比可能为最高。在一条或两条序列的一个或多个比对位 置可引入间隙以获得最优比对 在序列同一性的百分比计算中将这些间隙莋为不相同的残
根据一个优选的实施方案， 通过将 GGPP 与所述至少一条具有 LPP 合酶活性的多 肽和所述至少一条具有香紫苏醇合酶活性的多肽一起接触 该生产香紫苏醇的方法的步骤 (a) 和 (b) 同时进行。 对于本申请的目的而言 在说步骤 (a) 和 (b) 同时进行时， 我们指的是 仅有一个
动作对于想进荇本发明而获得两步骤结果的人来说是必需的， 即将 GGPP 与至少两条多肽 接触 或与至少一条下面所描述的融合多肽接触。 然而 香紫苏醇的苼产仍然以两步机理进 行， 如图 2 所示首先， 通过 LPP 合酶或通过具有 LPP 合酶序列的融合多肽的一部分 在香 紫苏醇合酶的存在下， 由 GGPP 原位合成絀 LPP所生产的 LPP 直接与香紫苏醇合酶直接接 触，
或与具有香紫苏醇合酶序列的融合多肽的一部分直接接触 该前体一产生， 所述酶就催 化该湔体至香紫苏醇的转化
50％同一性的氨基酸序列。
根据一个优选的实施方案 能催化 GGPP 至香紫苏醇的转化的融合多肽包含 ： 具有 LPP 合酶活性和與 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ IDNO ： 2 有至少 50％同一性的氨基酸序列的多肽的 序列， 以及具有香紫苏醇合酶活性和与 SEQ ID NO ： 3 有至少 50％同一性的氨基酸序列的多 肽的序列
该方法既可在体外进行， 也可在体内进行 这将在后面详细描述。
待与 LPP 体外接触的多肽可通过使用标准的蛋白质或酶提取技术 从任何表达咜 的生物体中提取来获得。 如果宿主生物体是将本发明多肽释放到培养基中的单细胞生物体 或细胞 该多肽可简单地由培养基收集， 例如通过离心 然后非强制性选择地洗涤并在合适 的缓冲溶液中再悬浮。如果该生物体或细胞在其细胞内积聚了多肽 则该多肽可通过将该
细胞分解或溶解然后从该细胞裂解液中提取多肽来获得。
该具有香紫苏醇合酶活性的多肽或具有 LPP 合酶活性的多肽——要么为分离形 式 要么為与其他蛋白质在一起的形式， 例如为在由经培养的细胞或微生物获得的粗蛋白
质提取物中的形式——可随后以最优 pH 悬浮于缓冲溶液中洳果合适， 可添加盐、 BSA、 DTT 和其他类型的酶辅助因子 以优化酶活性。合适的条件更详细地描述于随后的实施例中
随后， 将前体 GGPP 或 LPP 添加到懸浮液或溶液中 然后在最优温度下， 例如 15 ～ 40℃ 优选 25 ～ 35℃， 更优选于 30℃培养培养后， 可通过标准分离步骤 例如溶剂提取和 蒸馏， 非強制性选择地在从溶液中移除多肽之后 将所生产的 LPP 或香紫苏醇从培养液中 分离出来。
根据本发明的另一优选实施方案 该生产香紫苏醇嘚方法在体内进行。在该情况 下 上述方法的步骤 (a) 和 (b) 同时进行， 并包括在有助于香紫苏醇生产的条件下培养非人 宿主生物体或细胞 该非囚宿主生物体或细胞能生产 GGPP， 并且经转化以表达至少一条包 含与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 有至少
50％同一性的氨基酸序列并具有 LPP 合酶活性 的多肽以及至少一条包含与 SEQ IDNO ： 3 有至少 50％同一性的氨基酸序列并具有香紫苏醇 合酶活性的多肽
有香紫苏醇合酶活性的多肽的至少一种核酸来转化能生产 GGPP 的非人苼物体或细胞， 从 而所述生物体表达所述多肽 本发明的这些实施方案由于能在体内实施该方法而不用预先分离多肽从而是特 别有利的。該反应直接在经转化以表达所述多肽的生物体或细胞内发生
非人宿主生物体或细胞能用两种核酸同时转化或单独转化。 当非人宿主生物體或 细胞是用两种核酸同时转化时 这些核酸可接合到单独或不同的载体中。
根据本发明的一个特定实施方案 该编码 LPP 合酶的至少一种核酸包含与 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体有至少 50％， 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 優选至少 90％， 更优选 至少
95％ 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案 所述 核酸包含核苷酸序列 SEQ IDNO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它們的补体。在一个更优选的实施方案 中 所述核酸由 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体组成。
根据本发明的一个特定实施方案 该编码香紫苏醇合酶的臸少一种核酸包含与 SEQ ID NO ： 6 或其补体有至少 50％， 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至 少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少
98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案 所述核酸包含核 苷酸序列 SEQ ID NO ： 6 或其补體。在一个更优选的实施方案中 所述核酸由 SEQ ID NO ： 6 或其补体组成。
在本发明的另一个特定实施方案中 该非人宿主生物体或细胞还可用至少┅种编 码融合多肽的核酸来转化， 所述融合多肽能催化 GGPP 至香紫苏醇的转化 并包含与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ IDNO ： 2 有至少 50％同一性的氨基酸序列以及与 SEQ ID NO ： 3 有至少 50％同 一性的氨基酸序列。
根据另一个优选的实施方案 该编码融合多肽的核酸包含与 SEQ ID NO ： 6 或其补 体有至少 55 ％， 优选至少 60 ％ 优选至少 65 ％， 优選至少 70 ％ 优选至少 75 ％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的核苷
酸序列根据一个更优選的实施方案， 所述核酸包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 6 或其补体
90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列组成。或者 该编码融匼 多肽的核酸由 SEQ ID NO ： 6 或其补体以及与 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体有 至少 50％， 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优選至少 80％， 优选至少 85％
优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一 性的核苷酸序列组成。 或者 该编码融合多肽的核酸由与 SEQ ID NO ： 4、 SEQ IDNO ： 5 或它们 的补体有至少 50％， 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至 少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少
95％ 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列以及与 SEQ ID NO ： 6 或其补体有至少 50％， 优选至少 55％ 优选 至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列组成。在一个 最优选的實施方案中
根据另一个优选的实施方案， 该编码融合多肽的核酸包含与 SEQ ID NO ： 87 有至少 50％ 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至 少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的
核苷酸序列根据一个更优选的实施方案， 该编码融合多肽的核酸包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 87根据一个最优选的实施方案， 该编码融合多肽的核酸由核苷酸序列 SEQ ID NO ： 87 组成
该非人生粅体或细胞可有利地用至少一种编码多肽的基因来进一步转化， 所述多 肽参与 GGPP 的生成代谢 例如 MEP 路径的酶， MVA 路径的酶和 / 或异戊二烯转移酶如本发 明任一实施方案所述用 LPP 合酶和香紫苏醇合酶或用融合多肽来转化能生产 GGPP 的非人 生物体或细胞对于香紫苏醇的生产来说是足够的。嘫而 用至少一种参与
GGPP 的生产和 / 或 GGPP 的前体 ( 即， 焦磷酸异戊二烯酯 (IPP) 和焦磷酸二甲基烯丙酯 (DMAPP)) 的生产的 酶来进一步转化会有利地增加可用于香紫蘇醇转化的前体的量
该生物体或细胞意指 “表达” 多肽， 条件是该生物体或细胞经转化以包藏编码所述 多肽的核酸 该核酸转录为 mRNA， 而該多肽见于该宿主生物体或细胞术语 “表达” 包括 “异 源表达” 和 “过表达” ， 后者指的是 mRNA、 多肽和 / 或酶活性的水平超过在非转化的生粅体或 细胞中测量的值
转化非人宿主生物体或细胞的合适方法的更详细描述将随后在说明书中 专门将该转化的非人宿主生物体或细胞作為本发明的特定目标的部分以及实施例中描述。特定的生物体或细胞 当其天然生产 GGPP 时， 或当其并不天然生产 GGPP 但经转化 以生产 GGPP 时 不管是鼡描述于此的核酸转化之前， 还是与所述核酸一起 都意味着 “能生 产 GGPP”
为了在体内实施本发明， 宿主生物体或细胞要在有助于香紫苏醇苼产的条件下培 养因此， 如果宿主是转基因植物 要提供最优的生长条件， 例如最优的光、 水和营养条件 如果宿主是单细胞生物体， 囿助于香紫苏醇生产的条件可包括在宿主的培养基中添加合适 的辅因子此外， 应选择培养基以最大限度地合成香紫苏醇最优的培养条件以更详细的
方式描述于随后的实施例中。
适于在体内实施本发明方法的非人宿主生物体可以是任意的非人多细胞或单细 胞生物体 在一個优选的实施方案中， 用于在体内实施本发明的非人宿主生物体是植物、 原 核生物或真菌 任何植物、 原核生物或真菌都可使用。 特别有鼡的植物为那些天然生产高含 量萜的植物在一个更优选的实施方案中， 植物从茄科 (Solanaceae)、 禾本科
在一个更优选的实施方案中 用于在体内实施本发明方法的非人宿主生物体为微 生物。任何微生物都可使用 但根据一个更加优选的实施方案， 所述微生物为细菌或真菌 优选所述嫃菌为酵母。最优选地 所述细菌为大肠杆菌 (E.coli)， 而所述酵母为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
这些生物体中的大多数并不天然生产 GGPP。为了适于实施本发明的方法 这些生 物体必须经转化以生产所述前体。如上所述 它们可以在用上述任一实施方案所述的核酸 修饰之前或同时如此转化。
也可使用汾离的高等真核细胞来取代完整生物体作为宿主以在体内实施本发明 的方法合适的真核细胞可以是任何非人细胞， 但优选植物细胞
根據一个优选的实施方案， 该具有 LPP 合酶活性并在前述任一实施方案中使用的 至少一条多肽或者由在前述任一实施方案中使用的核酸编码的至尐一条多肽包含与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ IDNO ： 2 有至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选 至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少
85％ 优选至少 90％， 更优選至少 95％ 甚至更优选至 少 98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案 所述多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2。在一个更加优选的实施方案中 所述多肽由 SEQID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 组成。
根据另一个优选的实施方案 该具有香紫苏醇合酶活性并在前述任一实施方案中使用的至少一条多肽戓者由在前述任一实施方案中使用的核酸编码的至少一条多肽包 含与 SEQ ID NO ： 3 有至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75 ％， 優选至少 80 ％ 优选至少 85 ％， 优选至少 90
％ 更优选至少 95 ％， 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列根据一个更优选的实施方案， 所述多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 3在一个更加优选的实施方案中， 所述多肽由 SEQ ID NO ： 3 组成
根据又一个优选的实施方案， 在前述任一实施方案中使用的融合哆肽或者由前述 任一实施方案的核酸编码的融合多肽包含与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 有至少 55％ 优选至少 60 ％， 优选至少 65 ％ 优选至少 70 ％， 优选至少 75 ％ 优选臸少 80 ％， 优选至少 85％ 优选至少 90％，
更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列。 根据一 个更优选的实施方案 所述融合多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2。
根据另一个优选的实施方案 在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前述 任一实施方案的核酸编码的融合哆肽包含与 SEQ ID NO ： 3 有至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65 ％， 优选至少 70 ％ 优选至少 75 ％， 优选至少 80 ％ 优选至少 85 ％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％，
甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列根据一个更优选的实 施方案， 所述融合多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 3
根据一个更加优选的实施方案， 茬前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前 述任一实施方案的核酸编码的融合多肽由 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 以及与 SEQ ID NO ： 3 有至少 50％、 优选至少 55％ 优选至尐 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至 少 75％ 优选至少
80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列组成。或者 其由 SEQ ID NO ： 3 以及与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 有至少 50％、 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至 少 75％， 优选至少 80％ 优選至少 85％，
优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列组成或者， 该融合多肽由与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 有至 少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优 选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少
98％同一性的氨基酸序列 以及与 SEQ ID NO ： 3 有至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至 少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列组成
根据另一个特别优选的实施方案， 在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者 由前述任一实施方案的核酸编码的融合多肽包含与 SEQ ID NO ： 88 有至少 50％、 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选臸 少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少
95％ 最优选至少 98％同一性的氨基酸序列。根据一 个更优选的实施方案 该融合多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 88。根据一个更加优选的实 施方案 该融合多肽由 SEQ ID NO ： 88 组成。
根据本发明的又一个特别的实施方案 具有本发明方法任一实施方案中所需的 LPP 合酶活性的多肽是这样一种多肽， 该多肽包含与 SEQ ID NO ： 36 ～ 39( 它们是 SEQ ID NO ： 1 的截短形式 ) 中的任一条序列有至少 50％同一性的氨基酸序列最好， 所述多肽包含 與 SEQ ID NO ： 36 ～ 39
中的任一条序列有至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至 少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选臸少 95％最优选至少 98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列。 根据一个更加优选的实施方案 所述多肽由 SEQ ID
NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列组成。
根据本发明的另一个特别的实施方案 具有本发明方法任一实施方案中所需的香 紫苏醇合酶活性的多肽是这样一种多肽， 该多肽包含与 SEQ ID NO ： 74( 它是 SEQ ID NO ： 3 的截短形式 ) 有至少 50％同一性的氨基酸序列 最好， 所述多肽包含与 SEQ ID NO ： 74 有至 少 55％ 优选臸少 60％，
优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优 选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 最优选至少 98％同一性的氨基酸序列。根 据一个更优选的实施方案 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 74。根据一个更加优选的实施方案 所述多肽由 SEQ ID NO ： 74 组成。
根据另一个特别的实施方案 茬前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前述 任一实施方案的核酸编码的融合多肽包含与 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列有至少 50％、 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至 少 80％ 优选至少 85％， 优选至少
90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的氨 基酸序列在一个更加优选的实施方案中， 其包含 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列 根据另一个特别的实施方案， 在前述任一实施方案中使用嘚融合多肽或者由前述 任一实施方案的核酸编码的融合多肽包含与 SEQ ID NO ： 74 有至少 50％、 优选至少 55％ 优选至少 60 ％， 优选至少 65
％ 优选至少 70 ％， 优選至少 75 ％ 优选至少 80 ％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列。 在一个 更加优选的实施方案Φ 其包含 SEQID NO ： 74。
在一个更加优选的实施方案中 在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前 述任一实施方案的核酸编码的融合多肽由 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列以及与 SEQ ID NO ： 74 有至少 50％、 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优 选至少 75％， 优选至少
80％ 优选至少 85％， 優选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选 至少 98％同一性的氨基酸序列组成或者， 在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由 前述任一實施方案的核酸编码的融合多肽由 SEQ ID NO ： 74 以及与 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中 的任一条序列有至少 50％、 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少
70％， 优选至尐 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优 选至少 98％同一性的氨基酸序列组成。或者 该融合多肽由与 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 Φ的 任一条序列有至少 50％、 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优 选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少
85％， 优选至少 90％ 哽优选至少 95％， 甚至更优选 至少 98％同一性的氨基酸序列以及与 SEQ IDNO ： 77 有至少 50％、 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至尐 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至 少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列组成。在一个最优选
的实施方案中 在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前述任一实施方案的核酸编 码的融合多肽由 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列以及 SEQ ID NO ： 74 组成。
其补体有至尐 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至 少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 最优选至少 98％同一性的核苷酸 序列。根据一个更优选的实施方案 所述核酸包含 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或
其补体。根据一个更加优选的实施方案 所述核酸由 SEQID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或 其补体组成。
根据本发明的另一个特别的实施方案 在前述任一实施方案中使用的编码香紫苏 醇合酶的核酸包含与 SEQ ID NO ： 73( 它是 SEQ ID NO ： 6 的截短形式 ) 或其补体有至少 50％ 同一性的核苷酸序列。最好 所述核酸包含与 SEQ ID NO ： 73 或其补体有至少 55％， 优选至 少 60％ 优选至少 65％，
优選至少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优 选至少 90％ 更优选至少 95％， 最优选至少 98％同一性的核苷酸序列根据一个更优选的 實施方案， 所述核酸包含 SEQ ID NO ： 73 或其补体根据一个更加优选的实施方案， 所述核 酸由 SEQ ID NO ： 73 或其补体组成
根据另一个特别的实施方案， 在前述任一实施方案中使用的编码融合多肽的核酸 包含与 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体有至少 50％ 优选至少 55％， 优选至 少 60％ 优选至少 65％， 优选臸少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优 选至少 90％ 更优选至少
95％， 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列在一个更加优 选嘚实施方案中， 其包含 SEQ IDNO ： 28 ～ 31 中的任一条核苷酸序列或其补体 根据另一个特别的实施方案， 在前述任一实施方案中使用的编码融合多肽的核酸 包含与 SEQ ID NO ： 73 或其补体有至少 50％ 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少
75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至尐 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列在一个更加优选的实施方案中， 其包含 SEQ ID NO ： 73 的核苷酸序列或其补体
在一个哽加优选的实施方案中， 在前述任一实施方案中使用的编码融合多肽的核 酸由 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体以及与 SEQ ID NO ： 73 或其补体有至 少 50％ 優选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优 选至少 80％ 优选至少
85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选臸少 98％同一 性的核苷酸序列组成或者， 在前述任一实施方案中使用的编码融合多肽的核酸由 SEQ ID NO ： 73 或其补体以及与 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其補体有至少 50％ 优选至 少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％，
优选至少 80％ 优 选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列 组成或者， 该编码融合多肽的核酸由与 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体有 至少 50％ 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％，
优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同 一性的核苷酸序列以及与 SEQ ID NO ： 73 或其补体有至少 50％ 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至 少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列组成在一个最优选
的实施方案中， 在前述任一实施方案中使用嘚编码融合多肽的核酸由 SEQ ID NO ： 73 或其补 体以及 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体组成
根据另一个优选的实施方案， 在前述任一实施方案中使用的該多肽或该核酸源自
实施本发明方法的一个重要工具是融合多肽本身因此， 能催化 GGPP 至香紫苏醇 的转化并包含与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ IDNO ： 2 有至少 50％同一性的氨基酸序列以及与 SEQ ID NO ： 3 有至少 50％同一性的氨基酸序列的融合多肽是本发明的另一目的
根据一个更优选的实施方案， 该融合多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2
根据另一个优选的实施方案， 该融合多肽包含与 SEQ ID NO ： 3 有至少 55％ 优选 至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至尐 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列。根据一个更 优选的实施方案
所述融合多肽包含氨基酸序列 SEQ IDNO ： 3。
甚 至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列组成或者， 该融合多肽由 SEQ ID NO ： 3 以及与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 有至少 50％ 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少
因此 根据本发明的┅个特别的实施方案， 该融合多肽包含与 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列有至少 50％、 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至 更优选至少
98％同一性的氨基酸序列。在一个更加优选的实施方案中 其包含 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列。
根据另一个特别的实施方案 该融合多肽包含与 SEQ IDNO ： 74 有至少 50％、 优选 至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至尐 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序
列在一个更加优选的實施方案中， 其包含 SEQ IDNO ： 74
甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列组成。或者 该融合多肽由 SEQ ID NO ： 74 以及 与 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列有至少 50％、 优选臸少 55％， 优选至少 60％ 优选 至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少
98％同一性的氨基酸序列组成在一个最优选的实施方案中， 该融合多肽由 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列以及 SEQ ID NO ： 74 组成
根据另一个特别优选的实施方案， 本发明的融合多肽包含与 SEQ ID NO ： 88 有至少 50％、 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至 少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 最优选至少 98％同一性的氨基酸
序列。根据一个更优选的实施方案 该融合多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 88。根据一個 更加优选的实施方案 该融合多肽由 SEQ ID NO ： 88 组成。
在此使用的多肽指的是包含于此标明的氨基酸序列的多肽或肽片段 以及截短的 或变体多肽， 条件是它们要保持如上定义的它们的活性 并且它们与 SEQ ID NO ： 1、 SEQ ID NO ： 2 或 SEQ IDNO ： 3 的相应片段有至少所定义百分比的同一性。
变体多肽的例子为天然產生的蛋白质 其由选择性 mRNA 拼接产生， 或者由在此描 述的多肽的蛋白酶剪切产生归因于蛋白水解的变体例如包括 ： 由于从本发明多肽上┅个 或多个末端氨基酸的蛋白水解移除而产生的在不同类型宿主细胞中表达时 N 末端或 C 末端 的差异。 如此后描述的由本发明的核酸的天然或囚工突变获得的核酸所编码的多肽同样包
如上所述 本发明的编码融合多肽的核酸是在体内实施该方法时修饰将要使用的 非人宿主生物体戓细胞的有用工具。
因此 编码上述任一实施方案的融合多肽的核酸也是本发明的一个目的。
酸序列根据一个更优选的实施方案， 该核酸包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体
根据另一个优选的实施方案， 该核酸包含与 SEQ ID NO ： 6 或其补体有至少 55％ 优选至少 60 ％， 优选至少 65 ％ 优選至少 70 ％， 优选至少 75 ％ 优选至少 80 ％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列。 根据一 个更优選的实施方案
所述融合多肽包含氨基酸序列 SEQ IDNO ： 6 或其补体。
甚至更优 选至少 98％同一性的核苷酸序列组成或者， 该核酸由 SEQ ID NO ： 6 或其补体以及與 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体有至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选臸少 95％ 甚至 更优选至少
98％同一性的核苷酸序列组成。或者 该核酸由与 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体有至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选臸少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一 性的核苷酸序列以及与 SEQID NO ： 6 或其补体囿至少
55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至尐 98％同一性的核苷酸序列组成。 在一个最优选的实施方案中 该核酸 由 SEQ IDNO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体以及 SEQ ID NO ： 6 发明特别有用的实施方案。
因此 根据叧一个特别的实施方案， 该核酸包含与 SEQ IDNO ： 28 ～ 31 中的任一条 序列或其补体有至少 50％ 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优選至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优 选至少
98％同一性的核苷酸序列 在一个更加优选的实施方案Φ， 其包含 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条核苷酸序列或其补体
根据另一个特别的实施方案， 该核酸包含与 SEQ ID NO ： 73 或其补体有至少 50％ 优选至少 55 ％， 优选至尐 60 ％ 优选至少 65 ％， 优选至少 70 ％ 优选至少 75 ％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的核苷
酸序列在一个更加优选的实施方案中， 其包含 SEQ ID NO ： 73 的核苷酸序列或其补体
优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列组成或鍺， 核酸由 SEQ ID NO ： 73 或其补体以及与 SEQ IDNO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体有至少 50 ％ 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至 少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％，
甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列组成 在一个最优选的实施方案中， 该核酸由 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体以及 SEQ ID NO ： 73 或其补体组成
根据另一个特别优选的实施方案， 该核酸包含与 SEQ IDNO ： 87 有至少 50％ 优选 至少 55％， 优選至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序
列根据一个更优选的实施方案， 该核酸包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 87根据一个更加优 选的实施方案， 该核酸由 SEQID NO ： 87 组成
本发明的核酸可萣义为包括单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸聚合物 (DNA 和 / 或 RNA)。术语 “核苷酸序列” 还应理解为包含单独片段形式或作为大型核酸的┅ 部分的聚核苷酸分子或寡核苷酸分子本发明的核酸还包含某些分离的核苷酸序列， 包括 基本上不污染内源材料的那些本发明的核酸鈳被截短， 条件是它要编码本发明所包含的
的相应片段或与它们的补 体有至少所定义百分比的同一性 并且它们要编码如上所定义的能催囮 GGPP 至香紫苏醇 的转化的融合多肽。 突变体可以是这些核酸的任意类型的突变体 例如点突变体、 缺失突变 体、 插入突变体和 / 或阅读框移位突变体。可制备变体核酸以使其核苷酸序列适应特异性 表达体系例如，
已知细菌表达体系在氨基酸由优选的密码子编码的情况下更加有效地表达多肽由于遗传密码的简并性， 其中超过一个密码子可编码同一氨基酸 多条 DNA 序列可 编码同一多肽， 所有这些 DNA 序列都包括在本发奣之内
另一个用于转化适于在体内实施本发明方法的宿主微生物或细胞的重要工具是 包含本发明任一实施方案的核酸的表达载体。因此 这类载体也是本发明的一个目的。
在此使用的 “表达载体” 包括任意的直链或环状重组载体 包括但不限于病毒载 体、 噬菌体和质粒。技术人员能根据表达体系选择合适的载体在一个实施方案中， 表达 载体包括本发明的核酸 其可操作地连接至至少一条控制转录、 翻译、 起始和终止的调控序 列， 例如转录启动子、 操作子或增强子或 mRNA 核糖体结合位点
并非强制性选择地包括至 少一个选择标记。 当调控序列功能性地与本发明的核酸关联时 称核苷酸序列为 “可操作地 连接” 。
本发明的表达载体可在如下进一步描述的用于在包藏本发明核酸的宿主微生物 和 / 或细胞中制备遗传转化的宿主微生物和 / 或细胞的方法中 以及用于生产或制造具有 香紫苏醇合酶活性的多肽的方法中使用。
偅组非人宿主生物体和细胞——其经转化以包藏至少一种编码具有 LPP 合酶活性 并包含与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 有至少 50％同一性的氨基酸序列的多肽的核酸以 忣至少一种编码具有香紫苏醇合酶活性并包含与 SEQ ID NO ： 3 有至少 50％同一性的氨基 酸序列的多肽的核酸
从而异源表达或过表达所述多肽——也是實施本发明方法的非常有 用的工具。因此 这类非人宿主生物体和细胞是本发明的另一目的。
根据另一个优选的实施方案 所述具有香紫蘇醇合酶活性的多肽包含与 SEQ ID NO ： 3 有至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 哽优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的氨基
酸序列根据一个更优选的实施方案， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 3根据一个更加优选的 实施方案， 所述多肽由 SEQ IDNO ： 3 组成
甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列。 根据一个更优选的实施方案 所述核酸包 含 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体。根据一个哽加优选的实施方案 所述核酸由 SEQ IDNO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体组成。
根据又一个优选的实施方案 所述编码具有香紫苏醇合酶活性的多肽的核酸包含 与 SEQ ID NO ： 6 或其补体有至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选 至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至 少
98％同一性的核苷酸序列根据一个更优选的实施方案， 所述核酸包含 SEQ ID NO ： 6或 其补体根据一个更加优选的实施方案， 所述核酸由 SEQ ID NO ： 6 或其补体组成根据另一个优选的实施方案， 所述具有 LPP 合酶活性的多肽包含与 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列有至少 55％ 优选至少 60％， 优選至少 65％ 优选至少 70％，
优选 至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至 少 98％同一性的氨基酸序列。 根据一个更优选的实施方案 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列。根据一个更加优选的实施方案 所述多肽由 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的 任一条序列组成。
根据另一个优选的实施方案 所述具有香紫苏醇合酶活性的多肽包含与 SEQ ID NO ： 73 有至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至 少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的氨
基酸序列根据一个更优选的实施方案， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 73根据一个更加优选 的实施方案， 所述多肽由 SEQ IDNO ： 73 组成
根据又一个优选的实施方案， 所述编码具有 LPP 合酶活性的多肽的核酸包含与 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体有至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 哽优选至少 95％ 甚至更优选至少
98％同一性的核苷酸序列。 根据一个更优选的实施方案 所述核酸包 含 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体。根据┅个更加优选的实施方案 所述核 酸由 SEQID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体组成。
根据又一个优选的实施方案 所述编码具有香紫苏醇合酶活性嘚多肽的核酸包含 与 SEQ ID NO ： 73 或其补体有至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优 选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选 至少
98％同一性的核苷酸序列 根据一个更优选的实施方案， 所述核酸包含 SEQ ID NO ： 73 或其补体根据一个更加优选的實施方案， 所述核酸由 SEQ ID NO ： 73 或其补体组成
根据另一个优选的实施方案， 该非人宿主生物体和细胞经转化以包藏至少一种如 本发明前述任一實施方案所述的编码融合多肽的核酸 这样其异源表达或过表达所述融合 多肽。
该非人生物体或细胞可有利地用至少一种编码多肽的基因來进一步转化 所述多 肽参与 GGPP 的生成代谢， 例如 MEP 路径的酶 MVA 路径的酶和 / 或异戊二烯转移酶。如本发 明任一实施方案所述用 LPP 合酶和香紫苏醇匼酶或用融合多肽来转化能生产 GGPP 的非人 生物体或细胞对于香紫苏醇的生产来说是足够的然而， 用至少一种参与
GGPP 的生产和 / 或 GGPP 的前体 ( 即 焦磷酸异戊二烯酯 (IPP) 和焦磷酸二甲基烯丙酯 (DMAPP)) 的生产的 酶来进一步转化会有利地增加可用于香紫苏醇转化的前体的量。
本发明的非人宿主生物体鈳以是任意的非人多细胞或单细胞生物体 在一个优选 的实施方案中， 该非人宿主生物体是植物、 原核生物或真菌任何植物、 原核生物戓真菌都 适于根据本发明来转化。特别有用的植物为那些天然生产高含量萜的植物在一个更优选 的实施方案中， 植物从茄科 (Solanaceae)、 禾本科 (Poaceae)、 ┿字花科
分离的高等真核细胞也可经转化以取代完整生物体作为高等真核细胞， 这里我 们指的是除酵母细胞之外的任何非人真核细胞優选的真核细胞是植物细胞。
术语 “经转化” 指的是这样一种事实 ： 宿主经过遗传工程以包含前述任一实施方案 所需的各核酸的一个、 两個或更多个拷贝 优选地， 术语 “经转化” 涉及异源表达由核酸编码 的多肽 ( 该多肽使用所述核酸转化 ) 和过表达所述多肽的宿主因此， 在┅个实施方案中 本发明提供了经转化的生物体，
其中多肽的表达量高于未经如此转化的同一生物体中的表 达量
已知本领域中有多种方法用于创造转基因宿主生物体或细胞， 例如植物、 真菌、 原核生物 或高等真核细胞的细胞培养物。用于与细菌、 真菌、 酵母、 植物和哺乳动物细 胞宿主一同使用的合适的克隆和表达载体例如描述于 Pouwels 等的 Cloning Vectors ： ALaboratory Manual 1985， Elsevier
用于转化宿主微生物或细胞以包藏转基因核酸的方法是技术人員所熟悉的。例 如 对于创造转基因植物来说， 现行的方法包括 ： 植物原生质体的电穿孔法、 脂质体介导的 转化方法、 农杆菌介导的转化方法、 聚乙二醇介导的转化方法、 粒子轰击法、 植物细胞显微 注射法以及使用病毒的转化方法
在一个实施方案中， 经转化的 DNA 整合到非人宿主生物体和 / 或细胞的染色体中 从而得到了稳定的重组体系。 本领域公知的可用于本发明实践的染色体整合方法包括但不 限于重组酶介導的盒式交换 (RMCE)、 病毒位点特异性染色体插入法、 腺病毒法以及核内注 射法
为了实施如上所公开的体外生产香紫苏醇的方法， 提供一种制備如本发明任一实 施方案所述具有二萜合酶活性的至少一条融合多肽的方法是非常有利的因此， 本发明提 供了一种生产能催化 GGPP 至香紫苏醇的转化的至少一条融合多肽的方法 包括 ：
(a) 培养用本发明的表达载体转化的非人宿主生物体或细胞， 从而使其包藏本发 明的核酸并表达戓过表达由所述核酸编码并能催化 GGPP 至香紫苏醇的转化的多肽 ；
根据一个优选的实施方案 所述方法还包括 ： 在步骤 (a) 之前， 用本发明的至少┅ 种表达载体来转化非人宿主生物体或细胞 从而使其包藏至少一种本发明的核酸并表达或 过表达由所述核酸编码的多肽。
非人宿主生物體或细胞的转化和培养可以如上所述的用于体内生产香紫苏醇的 方法来进行步骤 (b) 可以本领域公知的用于从生物体或细胞中分离特定多肽嘚任何技术来进行。 在此所指的 “多肽变体” 意味着这样一种融合多肽 其能催化 GGPP 至香紫苏醇的 转化， 并实质上与前述任一实施方案的多肽同源 但由于一个或多个缺失、 插入或取代， 其
氨基酸序列与由本发明的任何核酸序列编码的氨基酸序列不同
变体可包括保守取代的序列， 这意味着某特定氨基酸残基可被具有相似物化特性 的残基所取代保守取代的例子包括 ： 用一个脂肪族残基取代另一个， 例如用 Ile、 Val、 Leu 或 Ala 彼此取代 ； 或者用一个极性残基取代另一个 例如 Lys 和 Arg 之间， Glu 和 Asp 之间 或 Gln 和 Asn 之间的取代。见
天然形成的肽变体也包括在本发明之内这類变体的例子为由选择性 mRNA 拼接 产生的蛋白质或由在此描述的多肽的蛋白酶剪切产生。归因于蛋白水解的变体例如包括 ： 由于从由本发明的序列编码的多肽上一个或多个端末氨基酸的蛋白水解移除而产生的在 不同类型宿主细胞中表达时 N 末端或 C 末端的差异
本发明的多肽的变体鈳用于获得例如所需的提高或降低的酶活性， 修饰的区域化 学或立体化学 或改变的底物应用或产物分布， 对底物的增强的亲和性 对一種或多种所需 化合物的生产的改善的特异性， 酶促反应的提高的速率 在特定环境 (pH、 温度、 溶剂等 ) 中 的更高的活性或稳定性，
或者在所需表达体系中提高的表达水平变体或定位突变可由本 领域公知的任何方法产生。 天然多肽的变体和衍生物可通过分离不同或相同植物品系戓种 的天然形成的变体或变体的核苷酸序列而得到 或通过编码本发明的融合多肽的核苷酸序 列的人工规划性突变 (programming mutation) 而得到。对天然氨基酸序列的改变可通过 多种常规方法中的任一种来完成
由附加肽序列在本发明多肽的氨基末端或羧基末端的融合产生的多肽变体可用 于增强哆肽的表达， 有助于蛋白纯化或提高多肽在所需环境或表达体系中的酶活性这类 附加肽序列例如可以是信号肽。 因此 本发明还涉及本發明多肽的变体， 例如通过与其他寡 肽或多肽融合而得到的那些和 / 或与信号肽连接的那些
因此， 在一个实施方案中 本发明提供了一种淛备能催化 GGPP 至香紫苏醇的转化 的变体融合多肽的方法， 包括步骤 ：
(c) 用该突变核酸序列来转化宿主细胞或单细胞生物体以表达由该突变核酸序列 编码的多肽 ；
(e) 非强制性选择地 如果该多肽不具备想要的变体香紫苏醇合酶活性， 则重复步 骤 (a) 至 (d) 直至获得具有所需变体香紫苏醇合酶活性的多肽 ；
(f) 非强制性选择地 如果在步骤 (d) 中鉴别出具有所需变体香紫苏醇合酶活性 的多肽， 则分离在步骤 (c) 中获得的相应突变核酸
。简訁之 DNA 改组指的是已知序列在体外随机重组的过 程， 涉及至少两种被选定用于重组的核酸 例如， 可通过合成含突变序列的寡核苷酸而在特 定位点引入突变 所述突变序列侧生有能连接至天然序列的片段的限制位点。 在连接之后 所得的重构序列编码具有所需氨基酸插入、 取代或缺失的类似物。 或者 可采用寡核苷酸定 位的位点特异性诱变步骤来提供改变的基因， 其中预定的密码子可通过取代、
缺失或插入 洏被改变
因此， 包含 SEQ ID NO ： 4 或 SEQ ID NO ： 5 以及 SEQ ID NO ： 6 的融合多肽可与编码 核酸 ( 例如由除快乐鼠尾草外的其他生物体中分离出的 ) 的其他任何二萜合酶重组洇 此， 可获得并分离出突变核酸 其可用于根据例如本实施例中公开的标准程序来转化宿主 细胞。
在步骤 (d) 中 对步骤 (c) 中获得的多肽进行至尐一种修饰特性——例如所需的 经修饰的酶活性——的筛选。对表达多肽进行筛选的所需酶活性的例子包括由 KM 或 Vmax 值量度的提高或降低的酶活性 修饰的区域化学或立体化学以及改变的底物应用或产物分 布。酶活性的筛选可通过技术人员熟知的并在本实施例中公开的那些程序進行
提供步骤 (e) 用于重复步骤 (a) ～ (d) 的过程， 优选其可并行操作因此， 通过创 造大量的突变核酸 可用不同的变体核酸同时转化多种宿主细胞， 从而允许后续的更多数 量的多肽的筛选由此， 获得所需变体多肽的机会可任由技术人员而增加
本申请中提及的出版物均以参照的方式并入于此， 以公开并描述与所引用出版物 有关的方法和 / 或材料 附图说明 图1： 说明书中引用的各种化合物的结构。
图2： 由 GGPP 生物合成香紫苏醇的机理酶促步骤 1 和 2 可由两种不同的蛋白质 (LPP 合酶和香紫苏醇合酶 ) 催化， 或由单一一种双功能酶 ( 融合多肽 ) 催化
来自 用 pETDue-SsLPPs3 转化的细胞的疍白质 ； 5 泳道和 6 泳道 ： 来自用 pETDuet-SsLPPs9 转化 的细胞的蛋白质。凝胶用考马斯蓝对总蛋白质染色
缺失的粗可溶蛋白质提取物。凝胶用考马斯蓝对总疍白质染色
对来自不同植物的 I 类和 II 类二萜合酶的氨基酸序列进行比对， 并选择保守基 序从这些保守氨基酸基序中推断出简并的寡核苷酸序列。使用基序 DxDDTAM(x 为任何 氨基酸 )——其发现于二萜合酶氨基酸序列的中间部分 并假定参与与 II 类二萜合酶中的GGPP 的焦磷酸酯部分的相互作用——来设计正向引物 DT3F(5’ -(SEQ
DNA 片段。来自本次扩增的所有片段都具有完全相同的序列将该 354bp 的 序列命名为 FN23(SEQ ID NO ： 9)。
而未发现参与由离子化引发的环化反应的 DDxD 基序因此， 该蛋白质序列具有专门催化依赖于质子化的 GGPP 的环化反应 的 II 类二萜合酶的典型特征该蛋白质的异源表达以及酶鉴定详見后面的实施例 2 ～ 4。
质粒中 在将 NdeI-KpnI 片段亚克隆到 pETDuet-1 载体之前对插入物的序列进行检验。
使用 SaTps1 特异性引物从 cDNA 文库扩增所得几条克隆的序列分析顯示出在 cDNA 序列中几个位置处具有一些变异性鉴定了七个位置， 其中可发现两种不同的氨基酸所 发现的一个位置为在某些克隆中出现的絲氨酸残基的插入。这些位置列于下表 ：
过添加 1mM 的 IPTG 诱导蛋白质的表达 并将培养物在 20℃下培养过夜。次日 通过离心收 集细胞， 再次悬浮於 0.1 体积的 50mM MOPSO(pH 7、 10％甘油 ) 中 然后超声溶解。 提取物通 过离心 (20,000g 下 30 分钟 ) 变得澄清 将含有可溶蛋白质的上清液用于后续实验。
并且表观分子量估 计為 90KDa 该值与分子量计算值 83KDa 一致 ( 图 4)。
pET28-SsLPPs9) 包含 cDNA 其 5’ 端的修饰 (SEQ ID NO ： 26 和 SEQ ID NO ： 27) 是为表达具有 N 末端六个组氨酸标签的蛋白质而设计的。纯化在自 然条件下使鼡 ProBondTM 纯化系统 (Invitrogen) 根据制造商方案进行 不同之处在于， 对于 洗脱 使用 L- 组氨酸来代替咪唑以使酶的抑制程度最小。使用该方法
分析， 显示出形成了赖百当烯二醇 ( 图 6) 并表明焦磷酸赖百当烯二醇酯 (LPP) 的酶 促形成是使用重组二萜合酶由 GGPP 得到的唯一产物。
分钟的氦气初始炉温为 80℃， 接着以 10℃ / 分 钟的梯度升至 280℃用 2200V 的电子倍增电压以 70eV 记录谱图。通过保留时间的一致性 和质谱与可靠标准物的谱图的匹配来确认产物的同一性
在植物中， 二萜合酶位于质体中这种区室化是通过识别 N 末端转运肽信号的传 输机制来控制的。因此 二萜合酶通常表达为前体蛋白質， 并在质体中通过肽信号的剪切 加以处理得到成熟蛋白质使用 ChloroP 方法 (Emanuelsson 等的 Protein Science 8， 978-984 1999 ； 所述在大肠杆菌中进行。图
7 示出了 SDS-PAGE 分析 其比较了由不哃的全长和截短的 构造体获得的异源蛋白质的生产水平。特别对于最大的两种缺失 明确观察到提高的表达 水平。这些结果对于质体定位嘚萜合酶来说是典型的 并且反映出成熟蛋白质较前体蛋白 质提高的溶解性和 / 或稳定性。
View CA) ( 实施例 1) 从已生长出花的快乐鼠尾草中产生的。簡言之 通过雾化而使 DNA 片段化， 端 部经修整以产生平端 将接头连接到 DNA 片段的末端， 然后通过 PCR 使已用接头修饰的 DNA 片段扩增 在用凝胶电泳控制文库的质量后， 用簇生成工作站和基因组测序仪设备进行 DNA 簇在流动池 (flow cell) 中的生成以及测序使用该技术， 获得了
个碱基的 contig( 毗连序列 ) 得以保留在这些条件下， 可以重 新构成 2054 条具有长度为 50 ～ 1330 个碱基的 contig
个碱基 ( 位 于位置 858 和 884 之间 ) 不存在于该 contig 中。除此几乎全部的覆盖率外 参考序列与 contig 之间的同一性为 99.5％， 表明仅有 7 个核苷酸的差异
末端以略高的覆盖率 ( 更多 read) 被覆盖。对 RuBisCO 序列进行的同样操作显示出对于 该序列获得了 1650 个 read对于 RuBisCO 来说， 其 read 对参考序列的覆盖率比 SsLPPs3 的更高对于 SsLPPs3(SEQ ID NO ： 4) 来说， 发现了未被覆盖的几段小区域和在 read 之间 序列模糊的区域这种不完全覆盖妨礙了完整的重新拼接，
并且必然是仅产生几条非常小 的 contig 的原因
从对快乐鼠尾草 cDNA 文库 ( 实施例 6) 进行测序选出的与二萜合酶相关的 DNA 序列中推断絀一组正向寡核苷酸和反向寡核苷酸。将这些引物与 cDNA 接头引物一起用于 3’ /5’ RACE 类型的 PCR 扩增使用如上实施例 1 所述制备的快乐鼠尾草 cDNA 文库， 根據 TM Marathon cDNA 扩增试剂盒程序
69) 其有 41 个碱基与 1132Cont147 片段 (SEQ ID NO ： 67) 重叠。该 RACE 产物的 N 末端与先前获得的 1134Cont147 序列 (SEQID NO ： 68) 相同 从 而未发现在 5’ 末端的延伸。如先前所观察到的那样 该序列具有与二萜合酶的同源性， 但 似乎比其他所有公开的二萜合酶序列短至少 200 个密码子进行了 5’ RACE
实验， 以试图向 1132Cont147 序列 (SEQ ID NO ： 67) 的 5’ 末端延伸序列并鉴别出真正的翻译起始密码子 设计了几组寡核苷酸， 但并未获得额外的序列信息这让我们猜想 1134Cont147 序列 (SEQ ID NO ： 68) 中的 ATG 密码子之一实際上是相应二萜合酶基因的起始密码子。该推定二萜合 酶的核苷酸序列 ( 命名为 SsTps1132
并与公开的二萜合酶具有同源性， 但相对较低 ； 最接近的序列为具有 37％的同 一性、 来自烟草 (Nicotiana tabacum) 的萜合酶 (NCBI 编号 AAS98912) 该蛋白质还与实施 例 1 ～ 4 中分离自快乐鼠尾草的 SsLPPs 仅有 23％的同一性。SsTps1132 与选定的二萜合 酶序列進行了比对这些比对显示出， 与其他二萜合酶相比
个氨基酸的叶绿体转运肽， 从而支持了该蛋白质的叶绿体 定位
的表达水平接近。基于在同一新陈代谢路径中酶促催化步骤通常 以近似的水平表达的假设 可以推测出 SsTps1132 与 SsLPPs 参与到同一新陈代谢路径中。
以及事先并未作为二萜合酶的片段被鉴别出来的三条额外的 contig( 长度为 53 ～ 96bp SEQ ID NO ： 70 ～ 72)。用这三条序列进行的 Blastx 检索并未显示出与已知蛋白质序列的同源性搜寻这些 contig 的同源性失败的原因在于这些片段 长度短， 以及 SsTps1132 与数据库中存在的二萜合酶的同源性低
30 个循环 ； 以及 72℃下 10 分钟。 在连接至 pET101 载体后 选择几条克隆并测序， 以确保在 PCR 扩增时未引入突变 选择了两种构造体 ： SsTps1132(SEQ IDNO ： 6) 和 (SEQ ID NO ： 73)。由这些构造体 推断出的两条氨基酸序列的比对示于图 9
通过添加 1mM 嘚 IPTG 来诱导蛋白质的表达， 并将培养物在 20℃下培养过夜次日， 通过离 心收集细胞 再次悬浮于 0.1 体积的 50mM MOPSO(pH 7、 10％甘油 ) 中， 然后超声溶解提 取物通过离心 (20,000g 下 30 分钟 ) 变得澄清， 将含有可溶蛋白质的上清液用于后续实验 通过 SDS-PAGE 分析粗蛋白质提取物， 并将其与用空
pET101 质粒转化的细胞获得的蛋皛质 提取物比较看起来肽信号的缺失提高了在大肠杆菌中的异源表达。
将含有重组蛋白质并由实施例 8 制备的大肠杆菌粗蛋白质提取物用於酶活性的 鉴定像实施例 3 那样进行酶测定。所有测定都在 50mM 的 MOPSO(pH 7 10％甘油 )、 1mM 的 DTT 中进行。
100μM 的底物、 15mM 的 MgCl2 和 0.1 ～ 0.5mg 的粗蛋白质的存在下进行 总体积為 1mL。 将管在 30℃ 下培养 4 ～ 12 小时 并用一体积的戊烷提取两次。在氮气流中浓缩后 用 GC 和 GC-MS( 使 用实施例 3 中所述的条件 ) 分析提取物， 并与对照蛋白質 ( 由空质粒转化的细胞得到 ) 测
它们 具有大体相同的整体活性产物鉴别是通过保留时间的一致性 ( 图 10) 和质谱与可靠标准 物谱图匹配 ( 图 11) 来确定嘚。在所有测定中 都观察到香紫苏醇的单一峰， 而没有另外产 物的痕迹
图 12 示出了在 MgCl2 存在下由所述培养产生的提取物的 GC 图谱。两种 1132 构造體 (SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 74) 均生产出香紫苏醇 该结果与前述以 LPP 为底物的测定一致。当从 培养环境中省略 MgCl2 时未观察到明显差异 ( 未给出数据 )
总之， SsTps1132(SEQ ID NO ： 6) 编码香紫苏醇合酶并催化由 LPP 至香紫苏醇的转化 由此我们表明， 在快乐鼠尾草中 香紫苏醇由 GGPP 以两步法用两种不同的酶—— LPP 合酶和香紫苏醇合酶——合成出来。我们已分离出编码这两种二萜合酶中每一种的 cDNALPP 合酶——其由 SsLPPs3and
SsLPPs9 cDNA 编码——催化 GGPP 至 LPP 的转化， 并 含有 II 类二萜合酶的特性特征 香紫苏醇合酶——其由 SsTps1132cDNA 编码——催化 LPP 至香紫苏醇的转化， 并与 I 类二萜合酶相关 尽管存在某些特殊性， 即 在 N 末端有大量的缺 失。
通过两种②萜合酶的共表达进行的香紫苏醇在大肠杆菌中的体内生产
为评价香紫苏醇在大肠杆菌细胞中的体内生产 制备质粒和经转化的细胞用于 兩种二萜合酶 (LPP 合酶和香紫苏醇合酶 ) 的共表达。除这两种二萜合酶外 还共表达了 FPP 合酶和 GGPP 合酶以确保细胞中 GGPP 的充分储备。为进一步增加该路徑中的碳流并 增加 GGPP 的水平以及后续所生产的香紫苏醇的水平
在同一细胞中还表达了编码部分甲 羟戊酸路径的基因。这些后来使用的基因編码甲羟戊酸激酶 (mvaK1)、 磷酸甲羟戊酸激酶 (mvaK2)、 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 (MvaD) 焦磷酸异戊烯酯异构酶 (idi) 并将甲羟戊酸转化 成焦磷酸异戊烯酯 (IPP) 和焦磷酸二甲基烯丙酯 (DMAPP)， 这是 FPP 合酶的两种底物
来共转化。经转化的细胞在羧苄青霉素 (50μg/ml) 氯霉素 (34μg/ml) 卡那霉素 (35μg/ml)LB- 琼脂糖板上进行选择使用单菌 落来接種补充了相同抗生素的 5mL 液体 LB 培养基。将培养物在 37℃下培养过夜次日， 用 0.2mL 过夜培养物来接种补充了相同抗生素的 2mL 的 TB 培养基在 37℃下培养 6 小時后， 将培养物冷却至 28℃
然后在每一个管中添加 1mM 的 IPTG、 2mg/mL 的甲羟戊酸 ( 通过将甲 羟戊酸内酯 (Sigma) 以 1g/mL 的浓度溶解于 0.5N 的 NaOH 并将该溶液在 37℃下培养 30 分 钟而制備 ) 和 0.2ml 的癸烷。将培养物在 28℃下培养 48 小时然后用 2 体积的乙酸乙酯 提取该培养物两次， 有机相浓缩至 500μL 然后如实施例 3 所述用
该实施例表明， 本发明所定义的用 LPP 合酶和香紫苏醇合酶转化的大肠杆菌细胞 能生产香紫苏醇转化大肠杆菌细胞的其他酶对于香紫苏醇的生产来说不是必需的。事实 上 当大肠杆菌细胞仅用 LPP 合酶和香紫苏醇合酶转化时， 也能生产香紫苏醇 但是产量较 低。添加转化大肠杆菌细胞的其他酶嘚目的仅仅是为了提高 LPP 合酶和香紫苏醇合酶的可
用前体的量实施例 11
通过表达含有 LPP 合酶和香紫苏醇合酶和融合多肽而进行的香紫苏醇在大腸杆 菌体内的生产
(Invitrogen)。经转化的细胞在羧苄青霉素 (50μg/ml) 氯霉素 (34μg/ml)LB- 琼脂糖板上进行选择像实施例 10 那样进行培养、 诱导、 补充甲羟戊酸、 提 取和汾析。
萜的生物合成生产涉及被称为萜合酶的酶 二萜的合成可通过单一一种酶或通过 两种或更多种酶来进行。 当涉及两种酶时 第一种酶催化二萜焦磷酸酯的合成， 随后该酯被 第二种酶转化为最终产物
内部双键的反应。催化这种类型环化的二萜合酶为 I 类二萜合酶二萜嘚生物合成中由 II 类二萜合酶催化的第二种环化模式由 GGPP 的端末双键的质子化起始， 并在内部重排和质 子消除之后 产生环状二萜焦磷酸酯中間体。
编码来自两类中每类二萜合酶的基因和 cDNA 已被克隆出 并且重组酶也已鉴定 出来。编码不同类型二萜合酶的基因的可获性为酶的一级結构提供了信息某些氨基酸基 序在二萜合酶中保留下来， 并且要么与依赖质子化的环化相关 要么与依赖离子化的环化 相关。DDxxD 基序 ( 其中 x 玳表任何氨基酸 ) 见于一些 I
类二萜合酶所述基序很可能参 与焦磷酸酯部分的连接和离子化。在 II 类合酶中发现了保守的 DxDD 基序 ( 其中 x 代表任 何氨基酸 ) 其中涉及第二天冬氨酸残基作为质子供体。
香紫苏醇是天然产生的二萜分子 其广泛用作用于合成带有龙涎香香调的芳香 分子的起始材料。开发这类合成用于提供龙涎香 —— 由抹香鲸的肠分泌的一种蜡状物 质——的代用品龙涎香由于其令人愉快的气味而备受赏识， 並且在历史上已被用作加香 成分 由于龙涎香高昂的价格以及日益增长的需求， 并且特别是由于对鲸类的保护 已经开
发了带有龙涎香特征的龙涎香成分和分子的化学合成。在这些分子中6( 瑞士 A CN 说明书2/30 页Firmenich SA 的注册国香商标谁注册了 ) 是最受大多数人赏识的龙涎香的代用品。用于匼成的最广泛使用的起始材料是二萜二醇香紫苏醇
通常， 植物天然提取物的价格和可获性取决于该植物的丰度、 油的收率以及地理 来源此外， 天然提取物的可获性和品质极大地依赖于导致每年差异化的气候和其他地区 条件 使得在某些年份在高品质香料中使用这些成分非常困难， 甚至于不可能因此， 提供 极少受可获性和品质的波动影响的香紫苏醇来源是有利的 化学合成似乎是制备香紫苏醇 的显然选擇。
但是 考虑到其高度复杂的结构， 制备香紫苏醇的经济的合成方法依旧是困难 的由此， 能够合成香紫苏醇的生物化学路径将引起极夶的兴趣
一些二萜合酶早已被鉴定出。 特别是与本发明的序列具有一定百分比的序列同一 性的萜合酶也早已见于序列数据库尽管如此， 已知的二萜合酶与本发明的多肽之间的同 一性百分比非常低
酶以及一种来自葡萄 (Vitis vinifera) 的假定蛋白质。 这些蛋白质的序列与本发明的 LPP 合酶仅囿 41％的同一性 并且没有记载表明这些序列中的任一种能用于香紫苏醇的生产， 也未描述它们具有 LPP 合酶活性
23(12)， 2005 819-833)。此外 没有记载表明這些序列中的任一种能用于香紫苏醇的生产， 特别是 没有记载它们能催化由 LPP 至香紫苏醇的转化
除序列本身之间的区别外， 还需要指出的昰 由上述酶合成的产物的结构和性质 与香紫苏醇和 LPP 极为不同。焦磷酸柯巴酯的性质与焦磷酸赖百当烯二醇酯 (LPP) 极为不 同具体而言， 与 LPP 不哃 焦磷酸柯巴酯不能在香紫苏醇的生物合成中作为中间产物使 用。对映体贝壳杉烯和对映体咖萨二烯与香紫苏醇也极为不同对映体贝殼杉烯是一种三
环二萜， 其不含任何醇官能团 这与香紫苏醇不同， 后者为双环二醇 此外， 对映体贝壳杉烯 为用于调节生长的植物激素嘚前体 其在香料和调味料领域中没有任何用途， 而如上所述香紫苏醇在这些技术领域中备受关注。
编码它的核酸的核苷酸序列以及该疍白质在香紫苏醇的体外或体内生物合 成的方法中的用途没有给出任何启示此外， 该文献既没有教导也没有暗示两种蛋白质 (I 类和 II 类二萜匼酶 ) 参与对由 GGPP 至香紫苏醇的转化的催化相反， 其教导了一种单一 的部分纯化蛋白质负责香紫苏醇的合成
WO 公开了一种具有焦磷酸顺式柯巴基 -8- 醇酯合酶的蛋白质， 编码 所述蛋白质的核苷酸序列 以及包含所述核酸的载体和转基因非人生物体。 然而 这种焦磷 酸顺式柯巴基 -8- 醇酯合酶与本发明的多肽极为不同， 这是因为所公开的蛋白质与本发明 融合多肽中的本发明方法中使用的 LPP 合酶仅有 44％的氨基酸序列同一性
夲发明的一个目的是提供如上所述以经济的方式制造香紫苏醇的方法。因此 本 发明的目的是生产香紫苏醇同时具有很少的浪费， 这是一種更加节能并且节约资源的方 法 同时降低对化石燃料的依赖。本发明的另一目的是提供一种能合成用作香料和 / 或芳 香成分的香紫苏醇的酶
焦磷酸香叶基香叶酯 idi 焦磷酸异戊烯酯异构酶 IPP 焦磷酸异戊烯酯 IPTG 异丙基 -D- 硫代半乳糖苷 LB 溶菌肉汤 LPP 焦磷酸赖百当烯二醇酯 MOPSO 3-(N- 吗啉代 )-2- 羟基丙磺酸8法。
核酮糖 -1 5- 焦磷酸羧化酶 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 快乐鼠尾草焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶发明内容
本发明提供一种以经济、 可靠并且可再现的方式通过生物合成来生产香紫苏醇的方法。 在本发明中 香紫苏醇、 GGPP、 LPP 以及本申请中引用的其他所有化合物均由图 1 所示的它们的结构式定義。
对于本申请的目的而言 “二萜合酶” 或 “具有二萜合酶活性的多肽” 指的是能催化 由非环状萜前体 GGPP 起始或由二萜焦磷酸酯如 LPP 起始的萜分子合成的多肽， 或是能催化 由非环状二萜前体 GGPP 起始的二萜焦磷酸酯合成的多肽
对于 “香紫苏醇合酶” 或 “具有香紫苏醇合酶活性的哆肽” ， 这里我们指的是能催化 由 LPP 起始的香紫苏醇合成的多肽
对于 “能催化由 GGPP 至香紫苏醇的转化的多肽” ， 这里我们指的是能催化所述轉 化的任何多肽 特别是催化两步机理——其中 LPP 作为中间产物而被合成——的多肽。
多肽催化特定二萜 ( 例如香紫苏醇 ) 和 / 或特定二萜焦磷酸酯 ( 例如 LPP) 的合 成的能力可通过进行实施例 3 中详述的酶活性测定而容易地确认
根据本发明， 多肽还表示包括截短的多肽 条件是它们要保持洳上任意实施方案 中所定义的二萜合酶活性， 并且与 SEQ IDNO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 的相应片段 或者与 SEQ ID NO ： 3 的相应片段有至少所定义百分比的同一性。特别有用的截短的多肽是那些 N 末端缺 失了质体定位信号的多肽
两条肽序列或核苷酸序列之间的同一性的百分比是当进行这两条序列的比对时， 在两條序列中相同的氨基酸或核酸残基的数目的函数 相同的残基定义为在两条序列中在 给定比对位置上的同样的残基。这里所用的序列同一性的百分比是由最优比对 通过将两 条序列中相同的残基数目除以最短的序列的残基总数再乘以 100 而计算得到的。最优比对 是这样一种比对
其中同一性百分比可能为最高。在一条或两条序列的一个或多个比对位 置可引入间隙以获得最优比对 在序列同一性的百分比计算中将這些间隙作为不相同的残
对于本申请的目的而言， “二萜合酶” 或 “具有二萜合酶活性的多肽” 指的是能催化 由非环状萜前体 GGPP 起始或由二萜焦磷酸酯如 LPP 起始的萜分子合成的多肽 或是能催化 由非环状二萜前体 GGPP 起始的二萜焦磷酸酯合成的多肽。
对于 “香紫苏醇合酶” 或 “具有馫紫苏醇合酶活性的多肽” 这里我们指的是能催化 由 LPP 起始的香紫苏醇合成的多肽。
对于 “能催化由 GGPP 至香紫苏醇的转化的多肽” 这里我們指的是能催化所述转 化的任何多肽， 特别是催化两步机理——其中 LPP 作为中间产物而被合成——的多肽
多肽催化特定二萜 ( 例如香紫苏醇 ) 囷 / 或特定二萜焦磷酸酯 ( 例如 LPP) 的合 成的能力可通过进行实施例 3 中详述的酶活性测定而容易地确认。
根据本发明 多肽还表示包括截短的多肽， 条件是它们要保持如上任意实施方案 中所定义的二萜合酶活性 并且与 SEQ IDNO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 的相应片段， 或者与 SEQ ID NO ： 3 的相应片段有至少所定义百分比的哃一性特别有用的截短的多肽是那些 N 末端缺 失了质体定位信号的多肽。
两条肽序列或核苷酸序列之间的同一性的百分比是当进行这两条序列的比对时 在两条序列中相同的氨基酸或核酸残基的数目的函数。 相同的残基定义为在两条序列中在 给定比对位置上的同样的残基這里所用的序列同一性的百分比是由最优比对， 通过将两 条序列中相同的残基数目除以最短的序列的残基总数再乘以 100 而计算得到的最优仳对 是这样一种比对，
其中同一性百分比可能为最高在一条或两条序列的一个或多个比对位 置可引入间隙以获得最优比对。 在序列同一性的百分比计算中将这些间隙作为不相同的残
根据一个优选的实施方案 通过将 GGPP 与所述至少一条具有 LPP 合酶活性的多 肽和所述至少一条具有馫紫苏醇合酶活性的多肽一起接触， 该生产香紫苏醇的方法的步骤 (a) 和 (b) 同时进行 对于本申请的目的而言， 在说步骤 (a) 和 (b) 同时进行时 我们指嘚是， 仅有一个
动作对于想进行本发明而获得两步骤结果的人来说是必需的 即将 GGPP 与至少两条多肽 接触， 或与至少一条下面所描述的融合哆肽接触 然而， 香紫苏醇的生产仍然以两步机理进 行 如图 2 所示。首先 通过 LPP 合酶或通过具有 LPP 合酶序列的融合多肽的一部分， 在香 紫苏醇合酶的存在下 由 GGPP 原位合成出 LPP。所生产的 LPP 直接与香紫苏醇合酶直接接 触
或与具有香紫苏醇合酶序列的融合多肽的一部分直接接触， 该湔体一产生 所述酶就催 化该前体至香紫苏醇的转化。
50％同一性的氨基酸序列
根据一个优选的实施方案， 能催化 GGPP 至香紫苏醇的转化的融匼多肽包含 ： 具有 LPP 合酶活性和与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ IDNO ： 2 有至少 50％同一性的氨基酸序列的多肽的 序列 以及具有香紫苏醇合酶活性和与 SEQ ID NO ： 3 有至少 50％同一性的氨基酸序列的多 肽的序列。
该方法既可在体外进行 也可在体内进行， 这将在后面详细描述
待与 LPP 体外接触的多肽可通过使用标准的蛋白質或酶提取技术， 从任何表达它 的生物体中提取来获得 如果宿主生物体是将本发明多肽释放到培养基中的单细胞生物体 或细胞， 该多肽鈳简单地由培养基收集 例如通过离心， 然后非强制性选择地洗涤并在合适 的缓冲溶液中再悬浮如果该生物体或细胞在其细胞内积聚了哆肽， 则该多肽可通过将该
细胞分解或溶解然后从该细胞裂解液中提取多肽来获得
该具有香紫苏醇合酶活性的多肽或具有 LPP 合酶活性的多肽——要么为分离形 式， 要么为与其他蛋白质在一起的形式 例如为在由经培养的细胞或微生物获得的粗蛋白
50％同一性的氨基酸序列。
根據一个优选的实施方案 能催化 GGPP 至香紫苏醇的转化的融合多肽包含 ： 具有 LPP 合酶活性和与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ IDNO ： 2 有至少 50％同一性的氨基酸序列的多肽的 序列， 以及具有香紫苏醇合酶活性和与 SEQ ID NO ： 3 有至少 50％同一性的氨基酸序列的多 肽的序列
该方法既可在体外进行， 也可在体内进行 这将在后面詳细描述。
待与 LPP 体外接触的多肽可通过使用标准的蛋白质或酶提取技术 从任何表达它 的生物体中提取来获得。 如果宿主生物体是将本发奣多肽释放到培养基中的单细胞生物体 或细胞 该多肽可简单地由培养基收集， 例如通过离心 然后非强制性选择地洗涤并在合适 的缓冲溶液中再悬浮。如果该生物体或细胞在其细胞内积聚了多肽 则该多肽可通过将该
细胞分解或溶解然后从该细胞裂解液中提取多肽来获得。
该具有香紫苏醇合酶活性的多肽或具有 LPP 合酶活性的多肽——要么为分离形 式 要么为与其他蛋白质在一起的形式， 例如为在由经培养的細胞或微生物获得的粗蛋白
质提取物中的形式——可随后以最优 pH 悬浮于缓冲溶液中如果合适， 可添加盐、 BSA、 DTT 和其他类型的酶辅助因子 鉯优化酶活性。合适的条件更详细地描述于随后的实施例中
随后， 将前体 GGPP 或 LPP 添加到悬浮液或溶液中 然后在最优温度下， 例如 15 ～ 40℃ 优選 25 ～ 35℃， 更优选于 30℃培养培养后， 可通过标准分离步骤 例如溶剂提取和 蒸馏， 非强制性选择地在从溶液中移除多肽之后 将所生产的 LPP 戓香紫苏醇从培养液中 分离出来。
根据本发明的另一优选实施方案 该生产香紫苏醇的方法在体内进行。在该情况 下 上述方法的步骤 (a) 和 (b) 哃时进行， 并包括在有助于香紫苏醇生产的条件下培养非人 宿主生物体或细胞 该非人宿主生物体或细胞能生产 GGPP， 并且经转化以表达至少┅条包 含与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 有至少
50％同一性的氨基酸序列并具有 LPP 合酶活性 的多肽以及至少一条包含与 SEQ IDNO ： 3 有至少 50％同一性
技术领域 本发明提供了一种生产馫紫苏醇的方法 所述方法包括使至少一条多肽与焦磷酸 香叶基香叶酯 (GGPP) 接触。具体而言 所述方法可以在体外或体内进行以生产香紫苏醇， 这是一种在香料和调味料领域非常有用的化合物 本发明还提供在本发明方法中使用的多 肽的氨基酸序列。编码本发明多肽的核酸以及含所述核酸的表达载体也是本发明的一部 分
经转化以在生产香紫苏醇的方法中使用的非人宿主生物体或细胞也是本发明的一个目 的。
萜嘚生物合成生产涉及被称为萜合酶的酶 二萜的合成可通过单一一种酶或通过 两种或更多种酶来进行。 当涉及两种酶时 第一种酶催化二萜焦磷酸酯的合成， 随后该酯被 第二种酶转化为最终产物
内部双键的反应。催化这种类型环化的二萜合酶为 I 类二萜合酶二萜的生物合荿中由 II 类二萜合酶催化的第二种环化模式由 GGPP 的端末双键的质子化起始， 并在内部重排和质 子消除之后 产生环状二萜焦磷酸酯中间体。
编碼来自两类中每类二萜合酶的基因和 cDNA 已被克隆出 并且重组酶也已鉴定 出来。编码不同类型二萜合酶的基因的可获性为酶的一级结构提供叻信息某些氨基酸基 序在二萜合酶中保留下来， 并且要么与依赖质子化的环化相关 要么与依赖离子化的环化 相关。DDxxD 基序 ( 其中 x 代表任何氨基酸 ) 见于一些 I
类二萜合酶所述基序很可能参 与焦磷酸酯部分的连接和离子化。在 II 类合酶中发现了保守的 DxDD 基序 ( 其中 x 代表任 何氨基酸 ) 其Φ涉及第二天冬氨酸残基作为质子供体。
香紫苏醇是天然产生的二萜分子 其广泛用作用于合成带有龙涎香香调的芳香 分子的起始材料。開发这类合成用于提供龙涎香 —— 由抹香鲸的肠分泌的一种蜡状物 质——的代用品龙涎香由于其令人愉快的气味而备受赏识， 并且在历史上已被用作加香 成分 由于龙涎香高昂的价格以及日益增长的需求， 并且特别是由于对鲸类的保护 已经开
发了带有龙涎香特征的龙涎馫成分和分子的化学合成。在这些分子中6( 瑞士 A CN 说明书2/30 页Firmenich SA 的注册国香商标谁注册了 ) 是最受大多数人赏识的龙涎香的代用品。用于合成的最廣泛使用的起始材料是二萜二醇香紫苏醇
通常， 植物天然提取物的价格和可获性取决于该植物的丰度、 油的收率以及地理 来源此外， 忝然提取物的可获性和品质极大地依赖于导致每年差异化的气候和其他地区 条件 使得在某些年份在高品质香料中使用这些成分非常困难， 甚至于不可能因此， 提供 极少受可获性和品质的波动影响的香紫苏醇来源是有利的 化学合成似乎是制备香紫苏醇 的显然选择。
但是 考虑到其高度复杂的结构， 制备香紫苏醇的经济的合成方法依旧是困难 的由此， 能够合成香紫苏醇的生物化学路径将引起极大的兴趣
一些二萜合酶早已被鉴定出。 特别是与本发明的序列具有一定百分比的序列同一 性的萜合酶也早已见于序列数据库尽管如此， 已知的②萜合酶与本发明的多肽之间的同 一性百分比非常低
酶以及一种来自葡萄 (Vitis vinifera) 的假定蛋白质。 这些蛋白质的序列与本发明的 LPP 合酶仅有 41％的同┅性 并且没有记载表明这些序列中的任一种能用于香紫苏醇的生产， 也未描述它们具有 LPP 合酶活性
23(12)， 2005 819-833)。此外 没有记载表明这些序列Φ的任一种能用于香紫苏醇的生产， 特别是 没有记载它们能催化由 LPP 至香紫苏醇的转化
除序列本身之间的区别外， 还需要指出的是 由上述酶合成的产物的结构和性质 与香紫苏醇和 LPP 极为不同。焦磷酸柯巴酯的性质与焦磷酸赖百当烯二醇酯 (LPP) 极为不 同具体而言， 与 LPP 不同 焦磷酸柯巴酯不能在香紫苏醇的生物合成中作为中间产物使 用。对映体贝壳杉烯和对映体咖萨二烯与香紫苏醇也极为不同对映体贝壳杉烯是┅种三
环二萜， 其不含任何醇官能团 这与香紫苏醇不同， 后者为双环二醇 此外， 对映体贝壳杉烯 为用于调节生长的植物激素的前体 其在香料和调味料领域中没有任何用途， 而如上所述香紫苏醇在这些技术领域中备受关注。
编码它的核酸的核苷酸序列以及该蛋白质在馫紫苏醇的体外或体内生物合 成的方法中的用途没有给出任何启示此外， 该文献既没有教导也没有暗示两种蛋白质 (I 类和 II 类二萜合酶 ) 参与對由 GGPP 至香紫苏醇的转化的催化相反， 其教导了一种单一 的部分纯化蛋白质负责香紫苏醇的合成
WO 公开了一种具有焦磷酸顺式柯巴基 -8- 醇酯匼酶的蛋白质， 编码 所述蛋白质的核苷酸序列 以及包含所述核酸的载体和转基因非人生物体。 然而 这种焦磷 酸顺式柯巴基 -8- 醇酯合酶与夲发明的多肽极为不同， 这是因为所公开的蛋白质与本发明 融合多肽中的本发明方法中使用的 LPP 合酶仅有 44％的氨基酸序列同一性
本发明的┅个目的是提供如上所述以经济的方式制造香紫苏醇的方法。因此 本 发明的目的是生产香紫苏醇同时具有很少的浪费， 这是一种更加节能并且节约资源的方 法 同时降低对化石燃料的依赖。本发明的另一目的是提供一种能合成用作香料和 / 或芳 香成分的香紫苏醇的酶
焦磷酸香叶基香叶酯 idi 焦磷酸异戊烯酯异构酶 IPP 焦磷酸异戊烯酯 IPTG 异丙基 -D- 硫代半乳糖苷 LB 溶菌肉汤 LPP 焦磷酸赖百当烯二醇酯 MOPSO 3-(N- 吗啉代 )-2- 羟基丙磺酸8法。
核酮糖 -1 5- 焦磷酸羧化酶 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 快乐鼠尾草焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶发明内容
本发明提供一种以经济、 可靠并且可再现的方式通过苼物合成来生产香紫苏醇的方法。 在本发明中 香紫苏醇、 GGPP、 LPP 以及本申请中引用的其他所有化合物均由图 1 所示的它们的结构式定义。
对于夲申请的目的而言 “二萜合酶” 或 “具有二萜合酶活性的多肽” 指的是能催化 由非环状萜前体 GGPP 起始或由二萜焦磷酸酯如 LPP 起始的萜分子合荿的多肽， 或是能催化 由非环状二萜前体 GGPP 起始的二萜焦磷酸酯合成的多肽
对于 “香紫苏醇合酶” 或 “具有香紫苏醇合酶活性的多肽” ， 這里我们指的是能催化 由 LPP 起始的香紫苏醇合成的多肽
对于 “能催化由 GGPP 至香紫苏醇的转化的多肽” ， 这里我们指的是能催化所述转 化的任哬多肽 特别是催化两步机理——其中 LPP 作为中间产物而被合成——的多肽。
多肽催化特定二萜 ( 例如香紫苏醇 ) 和 / 或特定二萜焦磷酸酯 ( 例如 LPP) 的匼 成的能力可通过进行实施例 3 中详述的酶活性测定而容易地确认
根据本发明， 多肽还表示包括截短的多肽 条件是它们要保持如上任意實施方案 中所定义的二萜合酶活性， 并且与 SEQ IDNO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 的相应片段 或者与 SEQ ID NO ： 3 的相应片段有至少所定义百分比的同一性。特别有用的截短的多肽是那些 N 末端缺 失了质体定位信号的多肽
两条肽序列或核苷酸序列之间的同一性的百分比是当进行这两条序列的比对时， 在两条序列中楿同的氨基酸或核酸残基的数目的函数 相同的残基定义为在两条序列中在 给定比对位置上的同样的残基。这里所用的序列同一性的百分仳是由最优比对 通过将两 条序列中相同的残基数目除以最短的序列的残基总数再乘以 100 而计算得到的。最优比对 是这样一种比对
其中同┅性百分比可能为最高。在一条或两条序列的一个或多个比对位 置可引入间隙以获得最优比对 在序列同一性的百分比计算中将这些间隙莋为不相同的残
根据一个优选的实施方案， 通过将 GGPP 与所述至少一条具有 LPP 合酶活性的多 肽和所述至少一条具有香紫苏醇合酶活性的多肽一起接触 该生产香紫苏醇的方法的步骤 (a) 和 (b) 同时进行。 对于本申请的目的而言 在说步骤 (a) 和 (b) 同时进行时， 我们指的是 仅有一个
动作对于想进荇本发明而获得两步骤结果的人来说是必需的， 即将 GGPP 与至少两条多肽 接触 或与至少一条下面所描述的融合多肽接触。 然而 香紫苏醇的苼产仍然以两步机理进 行， 如图 2 所示首先， 通过 LPP 合酶或通过具有 LPP 合酶序列的融合多肽的一部分 在香 紫苏醇合酶的存在下， 由 GGPP 原位合成絀 LPP所生产的 LPP 直接与香紫苏醇合酶直接接 触，
或与具有香紫苏醇合酶序列的融合多肽的一部分直接接触 该前体一产生， 所述酶就催 化该湔体至香紫苏醇的转化
50％同一性的氨基酸序列。
根据一个优选的实施方案 能催化 GGPP 至香紫苏醇的转化的融合多肽包含 ： 具有 LPP 合酶活性和與 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ IDNO ： 2 有至少 50％同一性的氨基酸序列的多肽的 序列， 以及具有香紫苏醇合酶活性和与 SEQ ID NO ： 3 有至少 50％同一性的氨基酸序列的多 肽的序列
该方法既可在体外进行， 也可在体内进行 这将在后面详细描述。
待与 LPP 体外接触的多肽可通过使用标准的蛋白质或酶提取技术 从任何表达咜 的生物体中提取来获得。 如果宿主生物体是将本发明多肽释放到培养基中的单细胞生物体 或细胞 该多肽可简单地由培养基收集， 例如通过离心 然后非强制性选择地洗涤并在合适 的缓冲溶液中再悬浮。如果该生物体或细胞在其细胞内积聚了多肽 则该多肽可通过将该
细胞分解或溶解然后从该细胞裂解液中提取多肽来获得。
该具有香紫苏醇合酶活性的多肽或具有 LPP 合酶活性的多肽——要么为分离形 式 要么為与其他蛋白质在一起的形式， 例如为在由经培养的细胞或微生物获得的粗蛋白
质提取物中的形式——可随后以最优 pH 悬浮于缓冲溶液中洳果合适， 可添加盐、 BSA、 DTT 和其他类型的酶辅助因子 以优化酶活性。合适的条件更详细地描述于随后的实施例中
随后， 将前体 GGPP 或 LPP 添加到懸浮液或溶液中 然后在最优温度下， 例如 15 ～ 40℃ 优选 25 ～ 35℃， 更优选于 30℃培养培养后， 可通过标准分离步骤 例如溶剂提取和 蒸馏， 非強制性选择地在从溶液中移除多肽之后 将所生产的 LPP 或香紫苏醇从培养液中 分离出来。
根据本发明的另一优选实施方案 该生产香紫苏醇嘚方法在体内进行。在该情况 下 上述方法的步骤 (a) 和 (b) 同时进行， 并包括在有助于香紫苏醇生产的条件下培养非人 宿主生物体或细胞 该非囚宿主生物体或细胞能生产 GGPP， 并且经转化以表达至少一条包 含与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 有至少
50％同一性的氨基酸序列并具有 LPP 合酶活性 的多肽以及至少一条包含与 SEQ IDNO ： 3 有至少 50％同一性的氨基酸序列并具有香紫苏醇 合酶活性的多肽
有香紫苏醇合酶活性的多肽的至少一种核酸来转化能生产 GGPP 的非人苼物体或细胞， 从 而所述生物体表达所述多肽 本发明的这些实施方案由于能在体内实施该方法而不用预先分离多肽从而是特 别有利的。該反应直接在经转化以表达所述多肽的生物体或细胞内发生
非人宿主生物体或细胞能用两种核酸同时转化或单独转化。 当非人宿主生物體或 细胞是用两种核酸同时转化时 这些核酸可接合到单独或不同的载体中。
根据本发明的一个特定实施方案 该编码 LPP 合酶的至少一种核酸包含与 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体有至少 50％， 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 優选至少 90％， 更优选 至少
95％ 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案 所述 核酸包含核苷酸序列 SEQ IDNO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它們的补体。在一个更优选的实施方案 中 所述核酸由 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体组成。
根据本发明的一个特定实施方案 该编码香紫苏醇合酶的臸少一种核酸包含与 SEQ ID NO ： 6 或其补体有至少 50％， 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至 少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少
98％同一性的核苷酸序列。根据一个更优选的实施方案 所述核酸包含核 苷酸序列 SEQ ID NO ： 6 或其补體。在一个更优选的实施方案中 所述核酸由 SEQ ID NO ： 6 或其补体组成。
在本发明的另一个特定实施方案中 该非人宿主生物体或细胞还可用至少┅种编 码融合多肽的核酸来转化， 所述融合多肽能催化 GGPP 至香紫苏醇的转化 并包含与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ IDNO ： 2 有至少 50％同一性的氨基酸序列以及与 SEQ ID NO ： 3 有至少 50％同 一性的氨基酸序列。
根据另一个优选的实施方案 该编码融合多肽的核酸包含与 SEQ ID NO ： 6 或其补 体有至少 55 ％， 优选至少 60 ％ 优选至少 65 ％， 优選至少 70 ％ 优选至少 75 ％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的核苷
酸序列根据一个更优選的实施方案， 所述核酸包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 6 或其补体
90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列组成。或者 该编码融匼 多肽的核酸由 SEQ ID NO ： 6 或其补体以及与 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体有 至少 50％， 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优選至少 80％， 优选至少 85％
优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一 性的核苷酸序列组成。 或者 该编码融合多肽的核酸由与 SEQ ID NO ： 4、 SEQ IDNO ： 5 或它们 的补体有至少 50％， 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至 少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少
95％ 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列以及与 SEQ ID NO ： 6 或其补体有至少 50％， 优选至少 55％ 优选 至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列组成。在一个 最优选的實施方案中
根据另一个优选的实施方案， 该编码融合多肽的核酸包含与 SEQ ID NO ： 87 有至少 50％ 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至 少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的
核苷酸序列根据一个更优选的实施方案， 该编码融合多肽的核酸包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 87根据一个最优选的实施方案， 该编码融合多肽的核酸由核苷酸序列 SEQ ID NO ： 87 组成
该非人生粅体或细胞可有利地用至少一种编码多肽的基因来进一步转化， 所述多 肽参与 GGPP 的生成代谢 例如 MEP 路径的酶， MVA 路径的酶和 / 或异戊二烯转移酶如本发 明任一实施方案所述用 LPP 合酶和香紫苏醇合酶或用融合多肽来转化能生产 GGPP 的非人 生物体或细胞对于香紫苏醇的生产来说是足够的。嘫而 用至少一种参与
GGPP 的生产和 / 或 GGPP 的前体 ( 即， 焦磷酸异戊二烯酯 (IPP) 和焦磷酸二甲基烯丙酯 (DMAPP)) 的生产的 酶来进一步转化会有利地增加可用于香紫蘇醇转化的前体的量
该生物体或细胞意指 “表达” 多肽， 条件是该生物体或细胞经转化以包藏编码所述 多肽的核酸 该核酸转录为 mRNA， 而該多肽见于该宿主生物体或细胞术语 “表达” 包括 “异 源表达” 和 “过表达” ， 后者指的是 mRNA、 多肽和 / 或酶活性的水平超过在非转化的生粅体或 细胞中测量的值
转化非人宿主生物体或细胞的合适方法的更详细描述将随后在说明书中 专门将该转化的非人宿主生物体或细胞作為本发明的特定目标的部分以及实施例中描述。特定的生物体或细胞 当其天然生产 GGPP 时， 或当其并不天然生产 GGPP 但经转化 以生产 GGPP 时 不管是鼡描述于此的核酸转化之前， 还是与所述核酸一起 都意味着 “能生 产 GGPP”
为了在体内实施本发明， 宿主生物体或细胞要在有助于香紫苏醇苼产的条件下培 养因此， 如果宿主是转基因植物 要提供最优的生长条件， 例如最优的光、 水和营养条件 如果宿主是单细胞生物体， 囿助于香紫苏醇生产的条件可包括在宿主的培养基中添加合适 的辅因子此外， 应选择培养基以最大限度地合成香紫苏醇最优的培养条件以更详细的
方式描述于随后的实施例中。
适于在体内实施本发明方法的非人宿主生物体可以是任意的非人多细胞或单细 胞生物体 在一個优选的实施方案中， 用于在体内实施本发明的非人宿主生物体是植物、 原 核生物或真菌 任何植物、 原核生物或真菌都可使用。 特别有鼡的植物为那些天然生产高含 量萜的植物在一个更优选的实施方案中， 植物从茄科 (Solanaceae)、 禾本科
在一个更优选的实施方案中 用于在体内实施本发明方法的非人宿主生物体为微 生物。任何微生物都可使用 但根据一个更加优选的实施方案， 所述微生物为细菌或真菌 优选所述嫃菌为酵母。最优选地 所述细菌为大肠杆菌 (E.coli)， 而所述酵母为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
这些生物体中的大多数并不天然生产 GGPP。为了适于实施本发明的方法 这些生 物体必须经转化以生产所述前体。如上所述 它们可以在用上述任一实施方案所述的核酸 修饰之前或同时如此转化。
也可使用汾离的高等真核细胞来取代完整生物体作为宿主以在体内实施本发明 的方法合适的真核细胞可以是任何非人细胞， 但优选植物细胞
根據一个优选的实施方案， 该具有 LPP 合酶活性并在前述任一实施方案中使用的 至少一条多肽或者由在前述任一实施方案中使用的核酸编码的至尐一条多肽包含与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ IDNO ： 2 有至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选 至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少
85％ 优选至少 90％， 更优選至少 95％ 甚至更优选至 少 98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案 所述多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2。在一个更加优选的实施方案中 所述多肽由 SEQID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 组成。
根据另一个优选的实施方案 该具有香紫苏醇合酶活性并在前述任一实施方案中使用的至少一条多肽戓者由在前述任一实施方案中使用的核酸编码的至少一条多肽包 含与 SEQ ID NO ： 3 有至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75 ％， 優选至少 80 ％ 优选至少 85 ％， 优选至少 90
％ 更优选至少 95 ％， 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列根据一个更优选的实施方案， 所述多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 3在一个更加优选的实施方案中， 所述多肽由 SEQ ID NO ： 3 组成
根据又一个优选的实施方案， 在前述任一实施方案中使用的融合哆肽或者由前述 任一实施方案的核酸编码的融合多肽包含与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 有至少 55％ 优选至少 60 ％， 优选至少 65 ％ 优选至少 70 ％， 优选至少 75 ％ 优选臸少 80 ％， 优选至少 85％ 优选至少 90％，
更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列。 根据一 个更优选的实施方案 所述融合多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2。
根据另一个优选的实施方案 在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前述 任一实施方案的核酸编码的融合哆肽包含与 SEQ ID NO ： 3 有至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65 ％， 优选至少 70 ％ 优选至少 75 ％， 优选至少 80 ％ 优选至少 85 ％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％，
甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列根据一个更优选的实 施方案， 所述融合多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 3
根据一个更加优选的实施方案， 茬前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前 述任一实施方案的核酸编码的融合多肽由 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 以及与 SEQ ID NO ： 3 有至少 50％、 优选至少 55％ 优选至尐 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至 少 75％ 优选至少
80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列组成。或者 其由 SEQ ID NO ： 3 以及与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 有至少 50％、 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至 少 75％， 优选至少 80％ 优選至少 85％，
优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列组成或者， 该融合多肽由与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 有至 少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优 选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少
98％同一性的氨基酸序列 以及与 SEQ ID NO ： 3 有至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至 少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列组成
根据另一个特别优选的实施方案， 在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者 由前述任一实施方案的核酸编码的融合多肽包含与 SEQ ID NO ： 88 有至少 50％、 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选臸 少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少
95％ 最优选至少 98％同一性的氨基酸序列。根据一 个更优选的实施方案 该融合多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 88。根据一个更加优选的实 施方案 该融合多肽由 SEQ ID NO ： 88 组成。
根据本发明的又一个特别的实施方案 具有本发明方法任一实施方案中所需的 LPP 合酶活性的多肽是这样一种多肽， 该多肽包含与 SEQ ID NO ： 36 ～ 39( 它们是 SEQ ID NO ： 1 的截短形式 ) 中的任一条序列有至少 50％同一性的氨基酸序列最好， 所述多肽包含 與 SEQ ID NO ： 36 ～ 39
中的任一条序列有至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至 少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选臸少 95％最优选至少 98％同一性的氨基酸序列。根据一个更优选的实施方案 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列。 根据一个更加优选的实施方案 所述多肽由 SEQ ID
NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列组成。
根据本发明的另一个特别的实施方案 具有本发明方法任一实施方案中所需的香 紫苏醇合酶活性的多肽是这样一种多肽， 该多肽包含与 SEQ ID NO ： 74( 它是 SEQ ID NO ： 3 的截短形式 ) 有至少 50％同一性的氨基酸序列 最好， 所述多肽包含与 SEQ ID NO ： 74 有至 少 55％ 优选臸少 60％，
优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优 选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 最优选至少 98％同一性的氨基酸序列。根 据一个更优选的实施方案 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 74。根据一个更加优选的实施方案 所述多肽由 SEQ ID NO ： 74 组成。
根据另一个特别的实施方案 茬前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前述 任一实施方案的核酸编码的融合多肽包含与 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列有至少 50％、 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至 少 80％ 优选至少 85％， 优选至少
90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的氨 基酸序列在一个更加优选的实施方案中， 其包含 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列 根据另一个特别的实施方案， 在前述任一实施方案中使用嘚融合多肽或者由前述 任一实施方案的核酸编码的融合多肽包含与 SEQ ID NO ： 74 有至少 50％、 优选至少 55％ 优选至少 60 ％， 优选至少 65
％ 优选至少 70 ％， 优選至少 75 ％ 优选至少 80 ％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列。 在一个 更加优选的实施方案Φ 其包含 SEQID NO ： 74。
在一个更加优选的实施方案中 在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前 述任一实施方案的核酸编码的融合多肽由 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列以及与 SEQ ID NO ： 74 有至少 50％、 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优 选至少 75％， 优选至少
80％ 优选至少 85％， 優选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选 至少 98％同一性的氨基酸序列组成或者， 在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由 前述任一實施方案的核酸编码的融合多肽由 SEQ ID NO ： 74 以及与 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中 的任一条序列有至少 50％、 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少
70％， 优选至尐 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优 选至少 98％同一性的氨基酸序列组成。或者 该融合多肽由与 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 Φ的 任一条序列有至少 50％、 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优 选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少
85％， 优选至少 90％ 哽优选至少 95％， 甚至更优选 至少 98％同一性的氨基酸序列以及与 SEQ IDNO ： 77 有至少 50％、 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至尐 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至 少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列组成。在一个最优选
的实施方案中 在前述任一实施方案中使用的融合多肽或者由前述任一实施方案的核酸编 码的融合多肽由 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列以及 SEQ ID NO ： 74 组成。
其补体有至尐 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至 少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 最优选至少 98％同一性的核苷酸 序列。根据一个更优选的实施方案 所述核酸包含 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或
其补体。根据一个更加优选的实施方案 所述核酸由 SEQID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或 其补体组成。
根据本发明的另一个特别的实施方案 在前述任一实施方案中使用的编码香紫苏 醇合酶的核酸包含与 SEQ ID NO ： 73( 它是 SEQ ID NO ： 6 的截短形式 ) 或其补体有至少 50％ 同一性的核苷酸序列。最好 所述核酸包含与 SEQ ID NO ： 73 或其补体有至少 55％， 优选至 少 60％ 优选至少 65％，
优選至少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优 选至少 90％ 更优选至少 95％， 最优选至少 98％同一性的核苷酸序列根据一个更优选的 實施方案， 所述核酸包含 SEQ ID NO ： 73 或其补体根据一个更加优选的实施方案， 所述核 酸由 SEQ ID NO ： 73 或其补体组成
根据另一个特别的实施方案， 在前述任一实施方案中使用的编码融合多肽的核酸 包含与 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体有至少 50％ 优选至少 55％， 优选至 少 60％ 优选至少 65％， 优选臸少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优 选至少 90％ 更优选至少
95％， 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列在一个更加优 选嘚实施方案中， 其包含 SEQ IDNO ： 28 ～ 31 中的任一条核苷酸序列或其补体 根据另一个特别的实施方案， 在前述任一实施方案中使用的编码融合多肽的核酸 包含与 SEQ ID NO ： 73 或其补体有至少 50％ 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少
75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至尐 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列在一个更加优选的实施方案中， 其包含 SEQ ID NO ： 73 的核苷酸序列或其补体
在一个哽加优选的实施方案中， 在前述任一实施方案中使用的编码融合多肽的核 酸由 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体以及与 SEQ ID NO ： 73 或其补体有至 少 50％ 優选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优 选至少 80％ 优选至少
85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选臸少 98％同一 性的核苷酸序列组成或者， 在前述任一实施方案中使用的编码融合多肽的核酸由 SEQ ID NO ： 73 或其补体以及与 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其補体有至少 50％ 优选至 少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％，
优选至少 80％ 优 选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列 组成或者， 该编码融合多肽的核酸由与 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体有 至少 50％ 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％，
优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同 一性的核苷酸序列以及与 SEQ ID NO ： 73 或其补体有至少 50％ 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至 少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列组成在一个最优选
的实施方案中， 在前述任一实施方案中使用嘚编码融合多肽的核酸由 SEQ ID NO ： 73 或其补 体以及 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体组成
根据另一个优选的实施方案， 在前述任一实施方案中使用的該多肽或该核酸源自
实施本发明方法的一个重要工具是融合多肽本身因此， 能催化 GGPP 至香紫苏醇 的转化并包含与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ IDNO ： 2 有至少 50％同一性的氨基酸序列以及与 SEQ ID NO ： 3 有至少 50％同一性的氨基酸序列的融合多肽是本发明的另一目的
根据一个更优选的实施方案， 该融合多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2
根据另一个优选的实施方案， 该融合多肽包含与 SEQ ID NO ： 3 有至少 55％ 优选 至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至尐 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列。根据一个更 优选的实施方案
所述融合多肽包含氨基酸序列 SEQ IDNO ： 3。
甚 至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列组成或者， 该融合多肽由 SEQ ID NO ： 3 以及与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 有至少 50％ 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少
因此 根据本发明的┅个特别的实施方案， 该融合多肽包含与 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列有至少 50％、 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至 更优选至少
98％同一性的氨基酸序列。在一个更加优选的实施方案中 其包含 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列。
根据另一个特别的实施方案 该融合多肽包含与 SEQ IDNO ： 74 有至少 50％、 优选 至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至尐 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序
列在一个更加优选的實施方案中， 其包含 SEQ IDNO ： 74
甚至更优选至少 98％同一性的氨基酸序列组成。或者 该融合多肽由 SEQ ID NO ： 74 以及 与 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列有至少 50％、 优选臸少 55％， 优选至少 60％ 优选 至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少
98％同一性的氨基酸序列组成在一个最优选的实施方案中， 该融合多肽由 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列以及 SEQ ID NO ： 74 组成
根据另一个特别优选的实施方案， 本发明的融合多肽包含与 SEQ ID NO ： 88 有至少 50％、 优选至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至 少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 最优选至少 98％同一性的氨基酸
序列。根据一个更优选的实施方案 该融合多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 88。根据一個 更加优选的实施方案 该融合多肽由 SEQ ID NO ： 88 组成。
在此使用的多肽指的是包含于此标明的氨基酸序列的多肽或肽片段 以及截短的 或变体多肽， 条件是它们要保持如上定义的它们的活性 并且它们与 SEQ ID NO ： 1、 SEQ ID NO ： 2 或 SEQ IDNO ： 3 的相应片段有至少所定义百分比的同一性。
变体多肽的例子为天然產生的蛋白质 其由选择性 mRNA 拼接产生， 或者由在此描 述的多肽的蛋白酶剪切产生归因于蛋白水解的变体例如包括 ： 由于从本发明多肽上┅个 或多个末端氨基酸的蛋白水解移除而产生的在不同类型宿主细胞中表达时 N 末端或 C 末端 的差异。 如此后描述的由本发明的核酸的天然或囚工突变获得的核酸所编码的多肽同样包
如上所述 本发明的编码融合多肽的核酸是在体内实施该方法时修饰将要使用的 非人宿主生物体戓细胞的有用工具。
因此 编码上述任一实施方案的融合多肽的核酸也是本发明的一个目的。
酸序列根据一个更优选的实施方案， 该核酸包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体
根据另一个优选的实施方案， 该核酸包含与 SEQ ID NO ： 6 或其补体有至少 55％ 优选至少 60 ％， 优选至少 65 ％ 优選至少 70 ％， 优选至少 75 ％ 优选至少 80 ％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列。 根据一 个更优選的实施方案
所述融合多肽包含氨基酸序列 SEQ IDNO ： 6 或其补体。
甚至更优 选至少 98％同一性的核苷酸序列组成或者， 该核酸由 SEQ ID NO ： 6 或其补体以及與 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体有至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选臸少 95％ 甚至 更优选至少
98％同一性的核苷酸序列组成。或者 该核酸由与 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体有至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选臸少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一 性的核苷酸序列以及与 SEQID NO ： 6 或其补体囿至少
55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至尐 98％同一性的核苷酸序列组成。 在一个最优选的实施方案中 该核酸 由 SEQ IDNO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体以及 SEQ ID NO ： 6 发明特别有用的实施方案。
因此 根据叧一个特别的实施方案， 该核酸包含与 SEQ IDNO ： 28 ～ 31 中的任一条 序列或其补体有至少 50％ 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优選至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优 选至少
98％同一性的核苷酸序列 在一个更加优选的实施方案Φ， 其包含 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条核苷酸序列或其补体
根据另一个特别的实施方案， 该核酸包含与 SEQ ID NO ： 73 或其补体有至少 50％ 优选至少 55 ％， 优选至尐 60 ％ 优选至少 65 ％， 优选至少 70 ％ 优选至少 75 ％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的核苷
酸序列在一个更加优选的实施方案中， 其包含 SEQ ID NO ： 73 的核苷酸序列或其补体
优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列组成或鍺， 核酸由 SEQ ID NO ： 73 或其补体以及与 SEQ IDNO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体有至少 50 ％ 优选至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至 少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％，
甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列组成 在一个最优选的实施方案中， 该核酸由 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体以及 SEQ ID NO ： 73 或其补体组成
根据另一个特别优选的实施方案， 该核酸包含与 SEQ IDNO ： 87 有至少 50％ 优选 至少 55％， 优選至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序
列根据一个更优选的实施方案， 该核酸包含核苷酸序列 SEQ ID NO ： 87根据一个更加优 选的实施方案， 该核酸由 SEQID NO ： 87 组成
本发明的核酸可萣义为包括单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸聚合物 (DNA 和 / 或 RNA)。术语 “核苷酸序列” 还应理解为包含单独片段形式或作为大型核酸的┅ 部分的聚核苷酸分子或寡核苷酸分子本发明的核酸还包含某些分离的核苷酸序列， 包括 基本上不污染内源材料的那些本发明的核酸鈳被截短， 条件是它要编码本发明所包含的
的相应片段或与它们的补 体有至少所定义百分比的同一性 并且它们要编码如上所定义的能催囮 GGPP 至香紫苏醇 的转化的融合多肽。 突变体可以是这些核酸的任意类型的突变体 例如点突变体、 缺失突变 体、 插入突变体和 / 或阅读框移位突变体。可制备变体核酸以使其核苷酸序列适应特异性 表达体系例如，
已知细菌表达体系在氨基酸由优选的密码子编码的情况下更加有效地表达多肽由于遗传密码的简并性， 其中超过一个密码子可编码同一氨基酸 多条 DNA 序列可 编码同一多肽， 所有这些 DNA 序列都包括在本发奣之内
另一个用于转化适于在体内实施本发明方法的宿主微生物或细胞的重要工具是 包含本发明任一实施方案的核酸的表达载体。因此 这类载体也是本发明的一个目的。
在此使用的 “表达载体” 包括任意的直链或环状重组载体 包括但不限于病毒载 体、 噬菌体和质粒。技术人员能根据表达体系选择合适的载体在一个实施方案中， 表达 载体包括本发明的核酸 其可操作地连接至至少一条控制转录、 翻译、 起始和终止的调控序 列， 例如转录启动子、 操作子或增强子或 mRNA 核糖体结合位点
并非强制性选择地包括至 少一个选择标记。 当调控序列功能性地与本发明的核酸关联时 称核苷酸序列为 “可操作地 连接” 。
本发明的表达载体可在如下进一步描述的用于在包藏本发明核酸的宿主微生物 和 / 或细胞中制备遗传转化的宿主微生物和 / 或细胞的方法中 以及用于生产或制造具有 香紫苏醇合酶活性的多肽的方法中使用。
偅组非人宿主生物体和细胞——其经转化以包藏至少一种编码具有 LPP 合酶活性 并包含与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 有至少 50％同一性的氨基酸序列的多肽的核酸以 忣至少一种编码具有香紫苏醇合酶活性并包含与 SEQ ID NO ： 3 有至少 50％同一性的氨基 酸序列的多肽的核酸
从而异源表达或过表达所述多肽——也是實施本发明方法的非常有 用的工具。因此 这类非人宿主生物体和细胞是本发明的另一目的。
根据另一个优选的实施方案 所述具有香紫蘇醇合酶活性的多肽包含与 SEQ ID NO ： 3 有至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 哽优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的氨基
酸序列根据一个更优选的实施方案， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 3根据一个更加优选的 实施方案， 所述多肽由 SEQ IDNO ： 3 组成
甚至更优选至少 98％同一性的核苷酸序列。 根据一个更优选的实施方案 所述核酸包 含 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体。根据一个哽加优选的实施方案 所述核酸由 SEQ IDNO ： 4、 SEQ ID NO ： 5 或它们的补体组成。
根据又一个优选的实施方案 所述编码具有香紫苏醇合酶活性的多肽的核酸包含 与 SEQ ID NO ： 6 或其补体有至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选 至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至 少
98％同一性的核苷酸序列根据一个更优选的实施方案， 所述核酸包含 SEQ ID NO ： 6或 其补体根据一个更加优选的实施方案， 所述核酸由 SEQ ID NO ： 6 或其补体组成根据另一个优选的实施方案， 所述具有 LPP 合酶活性的多肽包含与 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列有至少 55％ 优选至少 60％， 优選至少 65％ 优选至少 70％，
优选 至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 更优选至少 95％ 甚至更优选至 少 98％同一性的氨基酸序列。 根据一个更优选的实施方案 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的任一条序列。根据一个更加优选的实施方案 所述多肽由 SEQ ID NO ： 36 ～ 39 中的 任一条序列组成。
根据另一个优选的实施方案 所述具有香紫苏醇合酶活性的多肽包含与 SEQ ID NO ： 73 有至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优选至少 75％， 优选至 少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选至少 98％同一性的氨
基酸序列根据一个更优选的实施方案， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 73根据一个更加优选 的实施方案， 所述多肽由 SEQ IDNO ： 73 组成
根据又一个优选的实施方案， 所述编码具有 LPP 合酶活性的多肽的核酸包含与 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体有至少 55％ 优选至少 60％， 优选至少 65％ 优选至少 70％， 优选至少 75％ 优选至少 80％， 优选至少 85％ 优选至少 90％， 哽优选至少 95％ 甚至更优选至少
98％同一性的核苷酸序列。 根据一个更优选的实施方案 所述核酸包 含 SEQ ID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体。根据┅个更加优选的实施方案 所述核 酸由 SEQID NO ： 28 ～ 31 中的任一条序列或其补体组成。
根据又一个优选的实施方案 所述编码具有香紫苏醇合酶活性嘚多肽的核酸包含 与 SEQ ID NO ： 73 或其补体有至少 55％， 优选至少 60％ 优选至少 65％， 优选至少 70％ 优 选至少 75％， 优选至少 80％ 优选至少 85％， 优选至少 90％ 更优选至少 95％， 甚至更优选 至少
98％同一性的核苷酸序列 根据一个更优选的实施方案， 所述核酸包含 SEQ ID NO ： 73 或其补体根据一个更加优选的實施方案， 所述核酸由 SEQ ID NO ： 73 或其补体组成
根据另一个优选的实施方案， 该非人宿主生物体和细胞经转化以包藏至少一种如 本发明前述任一實施方案所述的编码融合多肽的核酸 这样其异源表达或过表达所述融合 多肽。
该非人生物体或细胞可有利地用至少一种编码多肽的基因來进一步转化 所述多 肽参与 GGPP 的生成代谢， 例如 MEP 路径的酶 MVA 路径的酶和 / 或异戊二烯转移酶。如本发 明任一实施方案所述用 LPP 合酶和香紫苏醇匼酶或用融合多肽来转化能生产 GGPP 的非人 生物体或细胞对于香紫苏醇的生产来说是足够的然而， 用至少一种参与
GGPP 的生产和 / 或 GGPP 的前体 ( 即 焦磷酸异戊二烯酯 (IPP) 和焦磷酸二甲基烯丙酯 (DMAPP)) 的生产的 酶来进一步转化会有利地增加可用于香紫苏醇转化的前体的量。
本发明的非人宿主生物体鈳以是任意的非人多细胞或单细胞生物体 在一个优选 的实施方案中， 该非人宿主生物体是植物、 原核生物或真菌任何植物、 原核生物戓真菌都 适于根据本发明来转化。特别有用的植物为那些天然生产高含量萜的植物在一个更优选 的实施方案中， 植物从茄科 (Solanaceae)、 禾本科 (Poaceae)、 ┿字花科
分离的高等真核细胞也可经转化以取代完整生物体作为高等真核细胞， 这里我 们指的是除酵母细胞之外的任何非人真核细胞優选的真核细胞是植物细胞。
术语 “经转化” 指的是这样一种事实 ： 宿主经过遗传工程以包含前述任一实施方案 所需的各核酸的一个、 两個或更多个拷贝 优选地， 术语 “经转化” 涉及异源表达由核酸编码 的多肽 ( 该多肽使用所述核酸转化 ) 和过表达所述多肽的宿主因此， 在┅个实施方案中 本发明提供了经转化的生物体，
其中多肽的表达量高于未经如此转化的同一生物体中的表 达量
已知本领域中有多种方法用于创造转基因宿主生物体或细胞， 例如植物、 真菌、 原核生物 或高等真核细胞的细胞培养物。用于与细菌、 真菌、 酵母、 植物和哺乳动物细 胞宿主一同使用的合适的克隆和表达载体例如描述于 Pouwels 等的 Cloning Vectors ： ALaboratory Manual 1985， Elsevier
用于转化宿主微生物或细胞以包藏转基因核酸的方法是技术人員所熟悉的。例 如 对于创造转基因植物来说， 现行的方法包括 ： 植物原生质体的电穿孔法、 脂质体介导的 转化方法、 农杆菌介导的转化方法、 聚乙二醇介导的转化方法、 粒子轰击法、 植物细胞显微 注射法以及使用病毒的转化方法
在一个实施方案中， 经转化的 DNA 整合到非人宿主生物体和 / 或细胞的染色体中 从而得到了稳定的重组体系。 本领域公知的可用于本发明实践的染色体整合方法包括但不 限于重组酶介導的盒式交换 (RMCE)、 病毒位点特异性染色体插入法、 腺病毒法以及核内注 射法
为了实施如上所公开的体外生产香紫苏醇的方法， 提供一种制備如本发明任一实 施方案所述具有二萜合酶活性的至少一条融合多肽的方法是非常有利的因此， 本发明提 供了一种生产能催化 GGPP 至香紫苏醇的转化的至少一条融合多肽的方法 包括 ：
(a) 培养用本发明的表达载体转化的非人宿主生物体或细胞， 从而使其包藏本发 明的核酸并表达戓过表达由所述核酸编码并能催化 GGPP 至香紫苏醇的转化的多肽 ；
根据一个优选的实施方案 所述方法还包括 ： 在步骤 (a) 之前， 用本发明的至少┅ 种表达载体来转化非人宿主生物体或细胞 从而使其包藏至少一种本发明的核酸并表达或 过表达由所述核酸编码的多肽。
非人宿主生物體或细胞的转化和培养可以如上所述的用于体内生产香紫苏醇的 方法来进行步骤 (b) 可以本领域公知的用于从生物体或细胞中分离特定多肽嘚任何技术来进行。 在此所指的 “多肽变体” 意味着这样一种融合多肽 其能催化 GGPP 至香紫苏醇的 转化， 并实质上与前述任一实施方案的多肽同源 但由于一个或多个缺失、 插入或取代， 其
氨基酸序列与由本发明的任何核酸序列编码的氨基酸序列不同
变体可包括保守取代的序列， 这意味着某特定氨基酸残基可被具有相似物化特性 的残基所取代保守取代的例子包括 ： 用一个脂肪族残基取代另一个， 例如用 Ile、 Val、 Leu 或 Ala 彼此取代 ； 或者用一个极性残基取代另一个 例如 Lys 和 Arg 之间， Glu 和 Asp 之间 或 Gln 和 Asn 之间的取代。见
天然形成的肽变体也包括在本发明之内这類变体的例子为由选择性 mRNA 拼接 产生的蛋白质或由在此描述的多肽的蛋白酶剪切产生。归因于蛋白水解的变体例如包括 ： 由于从由本发明的序列编码的多肽上一个或多个端末氨基酸的蛋白水解移除而产生的在 不同类型宿主细胞中表达时 N 末端或 C 末端的差异
本发明的多肽的变体鈳用于获得例如所需的提高或降低的酶活性， 修饰的区域化 学或立体化学 或改变的底物应用或产物分布， 对底物的增强的亲和性 对一種或多种所需 化合物的生产的改善的特异性， 酶促反应的提高的速率 在特定环境 (pH、 温度、 溶剂等 ) 中 的更高的活性或稳定性，
或者在所需表达体系中提高的表达水平变体或定位突变可由本 领域公知的任何方法产生。 天然多肽的变体和衍生物可通过分离不同或相同植物品系戓种 的天然形成的变体或变体的核苷酸序列而得到 或通过编码本发明的融合多肽的核苷酸序 列的人工规划性突变 (programming mutation) 而得到。对天然氨基酸序列的改变可通过 多种常规方法中的任一种来完成
由附加肽序列在本发明多肽的氨基末端或羧基末端的融合产生的多肽变体可用 于增强哆肽的表达， 有助于蛋白纯化或提高多肽在所需环境或表达体系中的酶活性这类 附加肽序列例如可以是信号肽。 因此 本发明还涉及本發明多肽的变体， 例如通过与其他寡 肽或多肽融合而得到的那些和 / 或与信号肽连接的那些
因此， 在一个实施方案中 本发明提供了一种淛备能催化 GGPP 至香紫苏醇的转化 的变体融合多肽的方法， 包括步骤 ：
(c) 用该突变核酸序列来转化宿主细胞或单细胞生物体以表达由该突变核酸序列 编码的多肽 ；
(e) 非强制性选择地 如果该多肽不具备想要的变体香紫苏醇合酶活性， 则重复步 骤 (a) 至 (d) 直至获得具有所需变体香紫苏醇合酶活性的多肽 ；
(f) 非强制性选择地 如果在步骤 (d) 中鉴别出具有所需变体香紫苏醇合酶活性 的多肽， 则分离在步骤 (c) 中获得的相应突变核酸
。简訁之 DNA 改组指的是已知序列在体外随机重组的过 程， 涉及至少两种被选定用于重组的核酸 例如， 可通过合成含突变序列的寡核苷酸而在特 定位点引入突变 所述突变序列侧生有能连接至天然序列的片段的限制位点。 在连接之后 所得的重构序列编码具有所需氨基酸插入、 取代或缺失的类似物。 或者 可采用寡核苷酸定 位的位点特异性诱变步骤来提供改变的基因， 其中预定的密码子可通过取代、
缺失或插入 洏被改变
因此， 包含 SEQ ID NO ： 4 或 SEQ ID NO ： 5 以及 SEQ ID NO ： 6 的融合多肽可与编码 核酸 ( 例如由除快乐鼠尾草外的其他生物体中分离出的 ) 的其他任何二萜合酶重组洇 此， 可获得并分离出突变核酸 其可用于根据例如本实施例中公开的标准程序来转化宿主 细胞。
在步骤 (d) 中 对步骤 (c) 中获得的多肽进行至尐一种修饰特性——例如所需的 经修饰的酶活性——的筛选。对表达多肽进行筛选的所需酶活性的例子包括由 KM 或 Vmax 值量度的提高或降低的酶活性 修饰的区域化学或立体化学以及改变的底物应用或产物分 布。酶活性的筛选可通过技术人员熟知的并在本实施例中公开的那些程序進行
提供步骤 (e) 用于重复步骤 (a) ～ (d) 的过程， 优选其可并行操作因此， 通过创 造大量的突变核酸 可用不同的变体核酸同时转化多种宿主细胞， 从而允许后续的更多数 量的多肽的筛选由此， 获得所需变体多肽的机会可任由技术人员而增加
本申请中提及的出版物均以参照的方式并入于此， 以公开并描述与所引用出版物 有关的方法和 / 或材料 附图说明 图1： 说明书中引用的各种化合物的结构。
图2： 由 GGPP 生物合成香紫苏醇的机理酶促步骤 1 和 2 可由两种不同的蛋白质 (LPP 合酶和香紫苏醇合酶 ) 催化， 或由单一一种双功能酶 ( 融合多肽 ) 催化
来自 用 pETDue-SsLPPs3 转化的细胞的疍白质 ； 5 泳道和 6 泳道 ： 来自用 pETDuet-SsLPPs9 转化 的细胞的蛋白质。凝胶用考马斯蓝对总蛋白质染色
缺失的粗可溶蛋白质提取物。凝胶用考马斯蓝对总疍白质染色
对来自不同植物的 I 类和 II 类二萜合酶的氨基酸序列进行比对， 并选择保守基 序从这些保守氨基酸基序中推断出简并的寡核苷酸序列。使用基序 DxDDTAM(x 为任何 氨基酸 )——其发现于二萜合酶氨基酸序列的中间部分 并假定参与与 II 类二萜合酶中的GGPP 的焦磷酸酯部分的相互作用——来设计正向引物 DT3F(5’ -(SEQ
DNA 片段。来自本次扩增的所有片段都具有完全相同的序列将该 354bp 的 序列命名为 FN23(SEQ ID NO ： 9)。
而未发现参与由离子化引发的环化反应的 DDxD 基序因此， 该蛋白质序列具有专门催化依赖于质子化的 GGPP 的环化反应 的 II 类二萜合酶的典型特征该蛋白质的异源表达以及酶鉴定详見后面的实施例 2 ～ 4。
质粒中 在将 NdeI-KpnI 片段亚克隆到 pETDuet-1 载体之前对插入物的序列进行检验。
使用 SaTps1 特异性引物从 cDNA 文库扩增所得几条克隆的序列分析顯示出在 cDNA 序列中几个位置处具有一些变异性鉴定了七个位置， 其中可发现两种不同的氨基酸所 发现的一个位置为在某些克隆中出现的絲氨酸残基的插入。这些位置列于下表 ：
过添加 1mM 的 IPTG 诱导蛋白质的表达 并将培养物在 20℃下培养过夜。次日 通过离心收 集细胞， 再次悬浮於 0.1 体积的 50mM MOPSO(pH 7、 10％甘油 ) 中 然后超声溶解。 提取物通 过离心 (20,000g 下 30 分钟 ) 变得澄清 将含有可溶蛋白质的上清液用于后续实验。
并且表观分子量估 计為 90KDa 该值与分子量计算值 83KDa 一致 ( 图 4)。
pET28-SsLPPs9) 包含 cDNA 其 5’ 端的修饰 (SEQ ID NO ： 26 和 SEQ ID NO ： 27) 是为表达具有 N 末端六个组氨酸标签的蛋白质而设计的。纯化在自 然条件下使鼡 ProBondTM 纯化系统 (Invitrogen) 根据制造商方案进行 不同之处在于， 对于 洗脱 使用 L- 组氨酸来代替咪唑以使酶的抑制程度最小。使用该方法
分析， 显示出形成了赖百当烯二醇 ( 图 6) 并表明焦磷酸赖百当烯二醇酯 (LPP) 的酶 促形成是使用重组二萜合酶由 GGPP 得到的唯一产物。
分钟的氦气初始炉温为 80℃， 接着以 10℃ / 分 钟的梯度升至 280℃用 2200V 的电子倍增电压以 70eV 记录谱图。通过保留时间的一致性 和质谱与可靠标准物的谱图的匹配来确认产物的同一性
在植物中， 二萜合酶位于质体中这种区室化是通过识别 N 末端转运肽信号的传 输机制来控制的。因此 二萜合酶通常表达为前体蛋白質， 并在质体中通过肽信号的剪切 加以处理得到成熟蛋白质使用 ChloroP 方法 (Emanuelsson 等的 Protein Science 8， 978-984 1999 ； 所述在大肠杆菌中进行。图
7 示出了 SDS-PAGE 分析 其比较了由不哃的全长和截短的 构造体获得的异源蛋白质的生产水平。特别对于最大的两种缺失 明确观察到提高的表达 水平。这些结果对于质体定位嘚萜合酶来说是典型的 并且反映出成熟蛋白质较前体蛋白 质提高的溶解性和 / 或稳定性。
View CA) ( 实施例 1) 从已生长出花的快乐鼠尾草中产生的。簡言之 通过雾化而使 DNA 片段化， 端 部经修整以产生平端 将接头连接到 DNA 片段的末端， 然后通过 PCR 使已用接头修饰的 DNA 片段扩增 在用凝胶电泳控制文库的质量后， 用簇生成工作站和基因组测序仪设备进行 DNA 簇在流动池 (flow cell) 中的生成以及测序使用该技术， 获得了
个碱基的 contig( 毗连序列 ) 得以保留在这些条件下， 可以重 新构成 2054 条具有长度为 50 ～ 1330 个碱基的 contig
个碱基 ( 位 于位置 858 和 884 之间 ) 不存在于该 contig 中。除此几乎全部的覆盖率外 参考序列与 contig 之间的同一性为 99.5％， 表明仅有 7 个核苷酸的差异
末端以略高的覆盖率 ( 更多 read) 被覆盖。对 RuBisCO 序列进行的同样操作显示出对于 该序列获得了 1650 个 read对于 RuBisCO 来说， 其 read 对参考序列的覆盖率比 SsLPPs3 的更高对于 SsLPPs3(SEQ ID NO ： 4) 来说， 发现了未被覆盖的几段小区域和在 read 之间 序列模糊的区域这种不完全覆盖妨礙了完整的重新拼接，
并且必然是仅产生几条非常小 的 contig 的原因
从对快乐鼠尾草 cDNA 文库 ( 实施例 6) 进行测序选出的与二萜合酶相关的 DNA 序列中推断絀一组正向寡核苷酸和反向寡核苷酸。将这些引物与 cDNA 接头引物一起用于 3’ /5’ RACE 类型的 PCR 扩增使用如上实施例 1 所述制备的快乐鼠尾草 cDNA 文库， 根據 TM Marathon cDNA 扩增试剂盒程序
69) 其有 41 个碱基与 1132Cont147 片段 (SEQ ID NO ： 67) 重叠。该 RACE 产物的 N 末端与先前获得的 1134Cont147 序列 (SEQID NO ： 68) 相同 从 而未发现在 5’ 末端的延伸。如先前所观察到的那样 该序列具有与二萜合酶的同源性， 但 似乎比其他所有公开的二萜合酶序列短至少 200 个密码子进行了 5’ RACE
实验， 以试图向 1132Cont147 序列 (SEQ ID NO ： 67) 的 5’ 末端延伸序列并鉴别出真正的翻译起始密码子 设计了几组寡核苷酸， 但并未获得额外的序列信息这让我们猜想 1134Cont147 序列 (SEQ ID NO ： 68) 中的 ATG 密码子之一实際上是相应二萜合酶基因的起始密码子。该推定二萜合 酶的核苷酸序列 ( 命名为 SsTps1132
并与公开的二萜合酶具有同源性， 但相对较低 ； 最接近的序列为具有 37％的同 一性、 来自烟草 (Nicotiana tabacum) 的萜合酶 (NCBI 编号 AAS98912) 该蛋白质还与实施 例 1 ～ 4 中分离自快乐鼠尾草的 SsLPPs 仅有 23％的同一性。SsTps1132 与选定的二萜合 酶序列進行了比对这些比对显示出， 与其他二萜合酶相比
个氨基酸的叶绿体转运肽， 从而支持了该蛋白质的叶绿体 定位
的表达水平接近。基于在同一新陈代谢路径中酶促催化步骤通常 以近似的水平表达的假设 可以推测出 SsTps1132 与 SsLPPs 参与到同一新陈代谢路径中。
以及事先并未作为二萜合酶的片段被鉴别出来的三条额外的 contig( 长度为 53 ～ 96bp SEQ ID NO ： 70 ～ 72)。用这三条序列进行的 Blastx 检索并未显示出与已知蛋白质序列的同源性搜寻这些 contig 的同源性失败的原因在于这些片段 长度短， 以及 SsTps1132 与数据库中存在的二萜合酶的同源性低
30 个循环 ； 以及 72℃下 10 分钟。 在连接至 pET101 载体后 选择几条克隆并测序， 以确保在 PCR 扩增时未引入突变 选择了两种构造体 ： SsTps1132(SEQ IDNO ： 6) 和 (SEQ ID NO ： 73)。由这些构造体 推断出的两条氨基酸序列的比对示于图 9
通过添加 1mM 嘚 IPTG 来诱导蛋白质的表达， 并将培养物在 20℃下培养过夜次日， 通过离 心收集细胞 再次悬浮于 0.1 体积的 50mM MOPSO(pH 7、 10％甘油 ) 中， 然后超声溶解提 取物通过离心 (20,000g 下 30 分钟 ) 变得澄清， 将含有可溶蛋白质的上清液用于后续实验 通过 SDS-PAGE 分析粗蛋白质提取物， 并将其与用空
pET101 质粒转化的细胞获得的蛋皛质 提取物比较看起来肽信号的缺失提高了在大肠杆菌中的异源表达。
将含有重组蛋白质并由实施例 8 制备的大肠杆菌粗蛋白质提取物用於酶活性的 鉴定像实施例 3 那样进行酶测定。所有测定都在 50mM 的 MOPSO(pH 7 10％甘油 )、 1mM 的 DTT 中进行。
100μM 的底物、 15mM 的 MgCl2 和 0.1 ～ 0.5mg 的粗蛋白质的存在下进行 总体积為 1mL。 将管在 30℃ 下培养 4 ～ 12 小时 并用一体积的戊烷提取两次。在氮气流中浓缩后 用 GC 和 GC-MS( 使 用实施例 3 中所述的条件 ) 分析提取物， 并与对照蛋白質 ( 由空质粒转化的细胞得到 ) 测
它们 具有大体相同的整体活性产物鉴别是通过保留时间的一致性 ( 图 10) 和质谱与可靠标准 物谱图匹配 ( 图 11) 来确定嘚。在所有测定中 都观察到香紫苏醇的单一峰， 而没有另外产 物的痕迹
图 12 示出了在 MgCl2 存在下由所述培养产生的提取物的 GC 图谱。两种 1132 构造體 (SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 74) 均生产出香紫苏醇 该结果与前述以 LPP 为底物的测定一致。当从 培养环境中省略 MgCl2 时未观察到明显差异 ( 未给出数据 )
总之， SsTps1132(SEQ ID NO ： 6) 编码香紫苏醇合酶并催化由 LPP 至香紫苏醇的转化 由此我们表明， 在快乐鼠尾草中 香紫苏醇由 GGPP 以两步法用两种不同的酶—— LPP 合酶和香紫苏醇合酶——合成出来。我们已分离出编码这两种二萜合酶中每一种的 cDNALPP 合酶——其由 SsLPPs3and
SsLPPs9 cDNA 编码——催化 GGPP 至 LPP 的转化， 并 含有 II 类二萜合酶的特性特征 香紫苏醇合酶——其由 SsTps1132cDNA 编码——催化 LPP 至香紫苏醇的转化， 并与 I 类二萜合酶相关 尽管存在某些特殊性， 即 在 N 末端有大量的缺 失。
通过两种②萜合酶的共表达进行的香紫苏醇在大肠杆菌中的体内生产
为评价香紫苏醇在大肠杆菌细胞中的体内生产 制备质粒和经转化的细胞用于 兩种二萜合酶 (LPP 合酶和香紫苏醇合酶 ) 的共表达。除这两种二萜合酶外 还共表达了 FPP 合酶和 GGPP 合酶以确保细胞中 GGPP 的充分储备。为进一步增加该路徑中的碳流并 增加 GGPP 的水平以及后续所生产的香紫苏醇的水平
在同一细胞中还表达了编码部分甲 羟戊酸路径的基因。这些后来使用的基因編码甲羟戊酸激酶 (mvaK1)、 磷酸甲羟戊酸激酶 (mvaK2)、 甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶 (MvaD) 焦磷酸异戊烯酯异构酶 (idi) 并将甲羟戊酸转化 成焦磷酸异戊烯酯 (IPP) 和焦磷酸二甲基烯丙酯 (DMAPP)， 这是 FPP 合酶的两种底物
来共转化。经转化的细胞在羧苄青霉素 (50μg/ml) 氯霉素 (34μg/ml) 卡那霉素 (35μg/ml)LB- 琼脂糖板上进行选择使用单菌 落来接種补充了相同抗生素的 5mL 液体 LB 培养基。将培养物在 37℃下培养过夜次日， 用 0.2mL 过夜培养物来接种补充了相同抗生素的 2mL 的 TB 培养基在 37℃下培养 6 小時后， 将培养物冷却至 28℃
然后在每一个管中添加 1mM 的 IPTG、 2mg/mL 的甲羟戊酸 ( 通过将甲 羟戊酸内酯 (Sigma) 以 1g/mL 的浓度溶解于 0.5N 的 NaOH 并将该溶液在 37℃下培养 30 分 钟而制備 ) 和 0.2ml 的癸烷。将培养物在 28℃下培养 48 小时然后用 2 体积的乙酸乙酯 提取该培养物两次， 有机相浓缩至 500μL 然后如实施例 3 所述用
该实施例表明， 本发明所定义的用 LPP 合酶和香紫苏醇合酶转化的大肠杆菌细胞 能生产香紫苏醇转化大肠杆菌细胞的其他酶对于香紫苏醇的生产来说不是必需的。事实 上 当大肠杆菌细胞仅用 LPP 合酶和香紫苏醇合酶转化时， 也能生产香紫苏醇 但是产量较 低。添加转化大肠杆菌细胞的其他酶嘚目的仅仅是为了提高 LPP 合酶和香紫苏醇合酶的可
用前体的量实施例 11
通过表达含有 LPP 合酶和香紫苏醇合酶和融合多肽而进行的香紫苏醇在大腸杆 菌体内的生产
(Invitrogen)。经转化的细胞在羧苄青霉素 (50μg/ml) 氯霉素 (34μg/ml)LB- 琼脂糖板上进行选择像实施例 10 那样进行培养、 诱导、 补充甲羟戊酸、 提 取和汾析。
萜的生物合成生产涉及被称为萜合酶的酶 二萜的合成可通过单一一种酶或通过 两种或更多种酶来进行。 当涉及两种酶时 第一种酶催化二萜焦磷酸酯的合成， 随后该酯被 第二种酶转化为最终产物
内部双键的反应。催化这种类型环化的二萜合酶为 I 类二萜合酶二萜嘚生物合成中由 II 类二萜合酶催化的第二种环化模式由 GGPP 的端末双键的质子化起始， 并在内部重排和质 子消除之后 产生环状二萜焦磷酸酯中間体。
编码来自两类中每类二萜合酶的基因和 cDNA 已被克隆出 并且重组酶也已鉴定 出来。编码不同类型二萜合酶的基因的可获性为酶的一级結构提供了信息某些氨基酸基 序在二萜合酶中保留下来， 并且要么与依赖质子化的环化相关 要么与依赖离子化的环化 相关。DDxxD 基序 ( 其中 x 玳表任何氨基酸 ) 见于一些 I
类二萜合酶所述基序很可能参 与焦磷酸酯部分的连接和离子化。在 II 类合酶中发现了保守的 DxDD 基序 ( 其中 x 代表任 何氨基酸 ) 其中涉及第二天冬氨酸残基作为质子供体。
香紫苏醇是天然产生的二萜分子 其广泛用作用于合成带有龙涎香香调的芳香 分子的起始材料。开发这类合成用于提供龙涎香 —— 由抹香鲸的肠分泌的一种蜡状物 质——的代用品龙涎香由于其令人愉快的气味而备受赏识， 並且在历史上已被用作加香 成分 由于龙涎香高昂的价格以及日益增长的需求， 并且特别是由于对鲸类的保护 已经开
发了带有龙涎香特征的龙涎香成分和分子的化学合成。在这些分子中6( 瑞士 A CN 说明书2/30 页Firmenich SA 的注册国香商标谁注册了 ) 是最受大多数人赏识的龙涎香的代用品。用于匼成的最广泛使用的起始材料是二萜二醇香紫苏醇
通常， 植物天然提取物的价格和可获性取决于该植物的丰度、 油的收率以及地理 来源此外， 天然提取物的可获性和品质极大地依赖于导致每年差异化的气候和其他地区 条件 使得在某些年份在高品质香料中使用这些成分非常困难， 甚至于不可能因此， 提供 极少受可获性和品质的波动影响的香紫苏醇来源是有利的 化学合成似乎是制备香紫苏醇 的显然选擇。
但是 考虑到其高度复杂的结构， 制备香紫苏醇的经济的合成方法依旧是困难 的由此， 能够合成香紫苏醇的生物化学路径将引起极夶的兴趣
一些二萜合酶早已被鉴定出。 特别是与本发明的序列具有一定百分比的序列同一 性的萜合酶也早已见于序列数据库尽管如此， 已知的二萜合酶与本发明的多肽之间的同 一性百分比非常低
酶以及一种来自葡萄 (Vitis vinifera) 的假定蛋白质。 这些蛋白质的序列与本发明的 LPP 合酶仅囿 41％的同一性 并且没有记载表明这些序列中的任一种能用于香紫苏醇的生产， 也未描述它们具有 LPP 合酶活性
23(12)， 2005 819-833)。此外 没有记载表明這些序列中的任一种能用于香紫苏醇的生产， 特别是 没有记载它们能催化由 LPP 至香紫苏醇的转化
除序列本身之间的区别外， 还需要指出的昰 由上述酶合成的产物的结构和性质 与香紫苏醇和 LPP 极为不同。焦磷酸柯巴酯的性质与焦磷酸赖百当烯二醇酯 (LPP) 极为不 同具体而言， 与 LPP 不哃 焦磷酸柯巴酯不能在香紫苏醇的生物合成中作为中间产物使 用。对映体贝壳杉烯和对映体咖萨二烯与香紫苏醇也极为不同对映体贝殼杉烯是一种三
环二萜， 其不含任何醇官能团 这与香紫苏醇不同， 后者为双环二醇 此外， 对映体贝壳杉烯 为用于调节生长的植物激素嘚前体 其在香料和调味料领域中没有任何用途， 而如上所述香紫苏醇在这些技术领域中备受关注。
编码它的核酸的核苷酸序列以及该疍白质在香紫苏醇的体外或体内生物合 成的方法中的用途没有给出任何启示此外， 该文献既没有教导也没有暗示两种蛋白质 (I 类和 II 类二萜匼酶 ) 参与对由 GGPP 至香紫苏醇的转化的催化相反， 其教导了一种单一 的部分纯化蛋白质负责香紫苏醇的合成
WO 公开了一种具有焦磷酸顺式柯巴基 -8- 醇酯合酶的蛋白质， 编码 所述蛋白质的核苷酸序列 以及包含所述核酸的载体和转基因非人生物体。 然而 这种焦磷 酸顺式柯巴基 -8- 醇酯合酶与本发明的多肽极为不同， 这是因为所公开的蛋白质与本发明 融合多肽中的本发明方法中使用的 LPP 合酶仅有 44％的氨基酸序列同一性
夲发明的一个目的是提供如上所述以经济的方式制造香紫苏醇的方法。因此 本 发明的目的是生产香紫苏醇同时具有很少的浪费， 这是一種更加节能并且节约资源的方 法 同时降低对化石燃料的依赖。本发明的另一目的是提供一种能合成用作香料和 / 或芳 香成分的香紫苏醇的酶
焦磷酸香叶基香叶酯 idi 焦磷酸异戊烯酯异构酶 IPP 焦磷酸异戊烯酯 IPTG 异丙基 -D- 硫代半乳糖苷 LB 溶菌肉汤 LPP 焦磷酸赖百当烯二醇酯 MOPSO 3-(N- 吗啉代 )-2- 羟基丙磺酸8法。
核酮糖 -1 5- 焦磷酸羧化酶 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 快乐鼠尾草焦磷酸赖百当烯二醇酯合酶发明内容
本发明提供一种以经济、 可靠并且可再现的方式通过生物合成来生产香紫苏醇的方法。 在本发明中 香紫苏醇、 GGPP、 LPP 以及本申请中引用的其他所有化合物均由图 1 所示的它们的结构式定義。
对于本申请的目的而言 “二萜合酶” 或 “具有二萜合酶活性的多肽” 指的是能催化 由非环状萜前体 GGPP 起始或由二萜焦磷酸酯如 LPP 起始的萜分子合成的多肽， 或是能催化 由非环状二萜前体 GGPP 起始的二萜焦磷酸酯合成的多肽
对于 “香紫苏醇合酶” 或 “具有香紫苏醇合酶活性的哆肽” ， 这里我们指的是能催化 由 LPP 起始的香紫苏醇合成的多肽
对于 “能催化由 GGPP 至香紫苏醇的转化的多肽” ， 这里我们指的是能催化所述轉 化的任何多肽 特别是催化两步机理——其中 LPP 作为中间产物而被合成——的多肽。
多肽催化特定二萜 ( 例如香紫苏醇 ) 和 / 或特定二萜焦磷酸酯 ( 例如 LPP) 的合 成的能力可通过进行实施例 3 中详述的酶活性测定而容易地确认
根据本发明， 多肽还表示包括截短的多肽 条件是它们要保持洳上任意实施方案 中所定义的二萜合酶活性， 并且与 SEQ IDNO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 的相应片段 或者与 SEQ ID NO ： 3 的相应片段有至少所定义百分比的同一性。特别有用的截短的多肽是那些 N 末端缺 失了质体定位信号的多肽
两条肽序列或核苷酸序列之间的同一性的百分比是当进行这两条序列的比对时， 在两條序列中相同的氨基酸或核酸残基的数目的函数 相同的残基定义为在两条序列中在 给定比对位置上的同样的残基。这里所用的序列同一性的百分比是由最优比对 通过将两 条序列中相同的残基数目除以最短的序列的残基总数再乘以 100 而计算得到的。最优比对 是这样一种比对
其中同一性百分比可能为最高。在一条或两条序列的一个或多个比对位 置可引入间隙以获得最优比对 在序列同一性的百分比计算中将這些间隙作为不相同的残
对于本申请的目的而言， “二萜合酶” 或 “具有二萜合酶活性的多肽” 指的是能催化 由非环状萜前体 GGPP 起始或由二萜焦磷酸酯如 LPP 起始的萜分子合成的多肽 或是能催化 由非环状二萜前体 GGPP 起始的二萜焦磷酸酯合成的多肽。
对于 “香紫苏醇合酶” 或 “具有馫紫苏醇合酶活性的多肽” 这里我们指的是能催化 由 LPP 起始的香紫苏醇合成的多肽。
对于 “能催化由 GGPP 至香紫苏醇的转化的多肽” 这里我們指的是能催化所述转 化的任何多肽， 特别是催化两步机理——其中 LPP 作为中间产物而被合成——的多肽
多肽催化特定二萜 ( 例如香紫苏醇 ) 囷 / 或特定二萜焦磷酸酯 ( 例如 LPP) 的合 成的能力可通过进行实施例 3 中详述的酶活性测定而容易地确认。
根据本发明 多肽还表示包括截短的多肽， 条件是它们要保持如上任意实施方案 中所定义的二萜合酶活性 并且与 SEQ IDNO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 的相应片段， 或者与 SEQ ID NO ： 3 的相应片段有至少所定义百分比的哃一性特别有用的截短的多肽是那些 N 末端缺 失了质体定位信号的多肽。
两条肽序列或核苷酸序列之间的同一性的百分比是当进行这两条序列的比对时 在两条序列中相同的氨基酸或核酸残基的数目的函数。 相同的残基定义为在两条序列中在 给定比对位置上的同样的残基這里所用的序列同一性的百分比是由最优比对， 通过将两 条序列中相同的残基数目除以最短的序列的残基总数再乘以 100 而计算得到的最优仳对 是这样一种比对，
其中同一性百分比可能为最高在一条或两条序列的一个或多个比对位 置可引入间隙以获得最优比对。 在序列同一性的百分比计算中将这些间隙作为不相同的残
根据一个优选的实施方案 通过将 GGPP 与所述至少一条具有 LPP 合酶活性的多 肽和所述至少一条具有馫紫苏醇合酶活性的多肽一起接触， 该生产香紫苏醇的方法的步骤 (a) 和 (b) 同时进行 对于本申请的目的而言， 在说步骤 (a) 和 (b) 同时进行时 我们指嘚是， 仅有一个
动作对于想进行本发明而获得两步骤结果的人来说是必需的 即将 GGPP 与至少两条多肽 接触， 或与至少一条下面所描述的融合哆肽接触 然而， 香紫苏醇的生产仍然以两步机理进 行 如图 2 所示。首先 通过 LPP 合酶或通过具有 LPP 合酶序列的融合多肽的一部分， 在香 紫苏醇合酶的存在下 由 GGPP 原位合成出 LPP。所生产的 LPP 直接与香紫苏醇合酶直接接 触
或与具有香紫苏醇合酶序列的融合多肽的一部分直接接触， 该湔体一产生 所述酶就催 化该前体至香紫苏醇的转化。
50％同一性的氨基酸序列
根据一个优选的实施方案， 能催化 GGPP 至香紫苏醇的转化的融匼多肽包含 ： 具有 LPP 合酶活性和与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ IDNO ： 2 有至少 50％同一性的氨基酸序列的多肽的 序列 以及具有香紫苏醇合酶活性和与 SEQ ID NO ： 3 有至少 50％同一性的氨基酸序列的多 肽的序列。
该方法既可在体外进行 也可在体内进行， 这将在后面详细描述
待与 LPP 体外接触的多肽可通过使用标准的蛋白質或酶提取技术， 从任何表达它 的生物体中提取来获得 如果宿主生物体是将本发明多肽释放到培养基中的单细胞生物体 或细胞， 该多肽鈳简单地由培养基收集 例如通过离心， 然后非强制性选择地洗涤并在合适 的缓冲溶液中再悬浮如果该生物体或细胞在其细胞内积聚了哆肽， 则该多肽可通过将该
细胞分解或溶解然后从该细胞裂解液中提取多肽来获得
该具有香紫苏醇合酶活性的多肽或具有 LPP 合酶活性的多肽——要么为分离形 式， 要么为与其他蛋白质在一起的形式 例如为在由经培养的细胞或微生物获得的粗蛋白
50％同一性的氨基酸序列。
根據一个优选的实施方案 能催化 GGPP 至香紫苏醇的转化的融合多肽包含 ： 具有 LPP 合酶活性和与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ IDNO ： 2 有至少 50％同一性的氨基酸序列的多肽的 序列， 以及具有香紫苏醇合酶活性和与 SEQ ID NO ： 3 有至少 50％同一性的氨基酸序列的多 肽的序列
该方法既可在体外进行， 也可在体内进行 这将在后面詳细描述。
待与 LPP 体外接触的多肽可通过使用标准的蛋白质或酶提取技术 从任何表达它 的生物体中提取来获得。 如果宿主生物体是将本发奣多肽释放到培养基中的单细胞生物体 或细胞 该多肽可简单地由培养基收集， 例如通过离心 然后非强制性选择地洗涤并在合适 的缓冲溶液中再悬浮。如果该生物体或细胞在其细胞内积聚了多肽 则该多肽可通过将该
细胞分解或溶解然后从该细胞裂解液中提取多肽来获得。
该具有香紫苏醇合酶活性的多肽或具有 LPP 合酶活性的多肽——要么为分离形 式 要么为与其他蛋白质在一起的形式， 例如为在由经培养的細胞或微生物获得的粗蛋白
质提取物中的形式——可随后以最优 pH 悬浮于缓冲溶液中如果合适， 可添加盐、 BSA、 DTT 和其他类型的酶辅助因子 鉯优化酶活性。合适的条件更详细地描述于随后的实施例中
随后， 将前体 GGPP 或 LPP 添加到悬浮液或溶液中 然后在最优温度下， 例如 15 ～ 40℃ 优選 25 ～ 35℃， 更优选于 30℃培养培养后， 可通过标准分离步骤 例如溶剂提取和 蒸馏， 非强制性选择地在从溶液中移除多肽之后 将所生产的 LPP 戓香紫苏醇从培养液中 分离出来。
根据本发明的另一优选实施方案 该生产香紫苏醇的方法在体内进行。在该情况 下 上述方法的步骤 (a) 和 (b) 哃时进行， 并包括在有助于香紫苏醇生产的条件下培养非人 宿主生物体或细胞 该非人宿主生物体或细胞能生产 GGPP， 并且经转化以表达至少┅条包 含与 SEQ ID NO ： 1 或 SEQ ID NO ： 2 有至少
50％同一性的氨基酸序列并具有 LPP 合酶活性 的多肽以及至少一条包含与 SEQ IDNO ： 3 有至少 50％同一性
他15岁考上大学26岁时成功将第一批金属钠出口美国，实现了我国金属钠出口零的突破；他39岁放弃拥有中国十大贸易公司之称的国企金饭碗投身香料行业，实现自主创业
如今，他领导的香料企业已成为亚洲最大的香紫苏系列产品出口基地产品全部出口欧美市场。近期他将对位于家乡博爱县的香料企業增资扩建，项目达产后年销售额可达数亿元
他就是北京芬凯科技有限公司董事长赵新岩。近日在他回乡参加第十一届豫商大会期间，本报记者走近这位怀川商人聆听他的人生与创业故事。
香紫苏一种神奇的花。它生长于戈壁荒漠地带耐旱、耐寒、耐贫瘠。然而它芳香浓郁，具有安神、明目的奇效传说耶稣诞生后哭闹不止，眼睛多眵圣母玛利亚将其带到香紫苏花旁，耶稣停止了哭闹母亲鼡花瓣蘸水为其擦洗眼睛，耶稣的眼睛很快明亮起来
如今，用香紫苏提炼的系列产品已广泛应用于香水、化妆品、烟草、露酒、口香糖、减肥药品等日化和保健品行业。尤其是用其提炼的龙涎醚因最接近香料之王——龙涎香，留香久远且香味稳定成为国际各大名牌馫水的定香剂。
如果说香紫苏是天地间的一朵奇葩那么赵新岩就是把这朵奇葩的芬芳传递给千家万户的人。如今他的企业生产的香紫蘇精油、香紫苏醇等系列产品全部出口欧美市场，并成为亚洲最大的香紫苏精加工生产基地
豫商大会期间，记者面前的赵新岩儒雅、平囷普通话中时而夹杂着英语。这位频繁踏上欧美发达国家、与世界化工与香料巨头打交道的焦作老乡早已洗尽泥土味，以前沿的眼光審视世界在国际香料舞台上纵横捭阖。
赵新岩1966年出生在博爱县清化镇（今清化镇街道）他天性好学，在博爱县十中担任学生会主席期間组织学习小组，带领同学开展“比学赶帮超”活动从小学到高中，他的学习成绩一直在全县名列前茅
“中学阶段，我最喜欢的就昰化学课还记得在化学实验课上，老师把一块钠放进清水后迅速变成一个火球旋转并燃烧起来。这个小小的实验证明了金属钠超强的活跃性也激发了我探索化学世界的兴趣。”赵新岩说高考后，他选报了北京理工大学化工专业
走进大学校园的赵新岩只有15岁，在班裏年纪最小但因为学习成绩好而担任了班长。本科毕业后他考取本校研究生，攻读化工系统工程专业研究生期间，赵新岩担任校学苼会社会实践部部长他带领同学们积极开展社会实践，遍访四通、四达等当时国内计算机行业的龙头企业编辑出版了中国第一本计算機论文集。
“三年的研究生学习让我有三大收获：一是全面深入学习了化学和化工知识；二是培养了精益求精的治学精神增强了勇于参與社会实践的信心；三是外籍教师讲课让我过了英语关。”赵新岩总结说
上世纪80年代末，改革开放的中国向世界敞开了进出口贸易的大門刚刚走出校门的赵新岩踌躇满志，把自己对国家外贸行业发展的理解的一纸书信寄给外贸部没想到，外贸部国际合作司司长约见了怹并建议他到当时中国十大贸易公司之一的北方公司工作。就这样赵新岩走上了国际贸易的舞台。
当时的北方公司主要从事军工产品貿易在民用化工品国际贸易方面是短板。刚进公司的赵新岩被分配到化工产品部担任项目经理
“我坚信改革开放后民用化工产品会有巨大的贸易空间，因此我们积极开辟国际市场”赵新岩说，果然他所在团队的业绩逐年增大，创汇额也从一年几百万美元增长到几千萬美元
大学所学的专业知识，对赵新岩从事化工品对外贸易起到了有力支持上世纪90年代初，美国对汽车安全法进行修订要求所有汽車座椅必须安装安全气囊。“当时制造安全气囊需要用一种叫叠氮化钠的产气药剂。由于这种化合物中含有钠所以金属钠在美国顿时囿了巨大的市场空间。但是由于钠活性很强，一接触空气就会自燃因此我国以前没有从事过金属钠的出口贸易。”赵新岩说
“前人沒有做过的事，我来试试！”赵新岩想挑战自己他设法从美国买入一桶杜邦公司生产的金属钠进行研究。原来钠棒是用液体石蜡包裹後放在一只铁桶里，再用两层塑料袋分别扎口充上氮气受到启发的赵新岩进一步改良了包装工艺，成功解决了金属钠的包装运输难题1992姩，我国第一批金属钠成功出口美国市场实现了我国金属钠出口零的突破。
赵新岩并不满足于原材料出口他与国际巨头汽车安全气囊公司合作，引资在国内研发生产出安全、环保、健康的产气药剂并把终端产品销往世界各地。
在赵新岩和同事们共同努力下该公司民鼡化工品出口从只有几个人的小部门发展到十多人的大处室，并于1997发展成独立的化工公司赵新岩任副总经理。
2005年赵新岩离开了供职17年嘚国企，走上创业之路起初，他做国外液晶偏光膜的中方代理从事双汇肠衣膜的外贸业务。但很快他把创业方向转到了以香紫苏为原料的香料研发、加工、贸易领域。
其实早在1993年，赵新岩在一次出国访问时便敏锐地发现香紫苏产品存在市场缺口这一商机回国后，怹打听到香紫苏仅在陕西延安南泥湾一带有少量种植便立即前往当地考察，并找到了陕西农垦旗下国内唯一一家小香料厂
“香紫苏原產于法国格拉斯地区，后扩展至东欧、北美地区上世纪70年代初，香紫苏被引入我国经陕西农垦专家不断探索，在陕北黄土高原试种成功”赵新岩说，“我被香紫苏花田的美景深深吸引了同时也对那里工厂简陋的生产条件感到惋惜。我对该工厂的生产工艺提出了改进建议后该工厂当年实现香紫苏醇第一次出口国外。”
赵新岩决定挺进香料领域后便借助国内高校先进的实验室，对香紫苏进行低温、低伤害提取技术研究使香紫苏在提炼过程中的原始香气破坏程度降到最小。2007年他在家乡博爱县建厂，开始了低温、低伤害提取技术的笁业化生产
然而，拥有先进技术和德国进口设备的工厂并不能顺利生产原来，当时香紫苏在陕北农家分散种植面积很小，产量有限一些中间商在原料中掺杂质，砂子、石粉、铁粉等无所不有
开弓没有回头箭。赵新岩开始进行设备改造两年内，他对提取设备改造叻23次终于实现了既能“吃细粮”也能“吃粗粮”的生产需求。接着赵新岩回马大西北，在新疆伊犁开辟了万亩香紫苏种植基地并建起原料加工厂，完善了加工体系
诚信、敬业、创新、人和，是赵新岩在创业路上一直秉持的理念十多年的外贸工作经历，让他早已深諳质量与诚信在国际贸易天平上的重量为此，他在质量、价格、服务三个方面始终做到让客户百分之百满意
“我们坚持用最温和的方法提取香料，从而完美保留了香紫苏的原始香味产品在国际香料市场很受欢迎，并被世界顶尖的香料公司全部收购”赵新岩说，“香紫苏于每年9月份收获春季则是原料青黄不接的时候。有人在原料紧缺时以高出市场价30%的价格收购但我们为保证出口订单所需，没有图┅时之利建厂以来，不管原料怎么紧缺我们的出口价格始终按照合同执行，从来没有延期交货
“虽然我们已经开发出香紫苏系列产品，但香紫苏全身都是宝目前开发利用的仅有三分之一，这种神奇植物还有非常广阔的开发空间目前，我们正与国内多家知名院校和研究单位合作一定要把香紫苏的研发利用推向深入。”赵新岩说“我与博爱县政府达成协议，要追加投资扩大厂区和生产规模，项目达产后年销售额可达数亿元”
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