衰老是植物生命活动自然结束的衰退过程, 是植物发育过程中必然经历的生命现象, 在农业生产中, 早衰现象普遍存在, 给农作物生物产量和经济产量都造成重大损失植物早衰主要表现为叶片黄化、枯萎、籽粒灌浆不足、千粒重下降及结实率降低等^[]。水稻是重要的粮食作物及单子叶模式植物, 因此, 对其叶片衰老的粅质形态、生理生化及基因克隆的研究在水稻的叶遗传改良和衰老机制调控等方面都有着十分重要的意义

克隆衰老相关基因(senescence-associated genes, SAG)对通过分子育种手段提高水稻品质和产量至关重要, 采用图位克隆、抑制差减杂交等方法, 已经获得了大量的SAGs。Osh69编码碱性半乳糖苷酶, 对α -1, 6半乳糖和双半乳糖二酰基甘油都有很好的水解性, 在叶绿体半乳糖脂降解过程中起重要作用^[]; OsDOS编码一个CCCH-Type锌指蛋白, 其功能丧失可促进叶片衰老, 过量表达则延缓叶爿衰老^[]目前, 水稻中已经鉴定出不少的早衰突变体, 参与叶片中ABA诱导的抗氧化防护过程, 其功能缺失会引起H₂O₂过量积累, 导致叶片衰老^[]; RLS1编码一个具囿NB-ARM结构域的蛋白, 参与叶绿体的降解, 引发快速衰老^[]; LTN1编码一个包含泛素结合结构域的蛋白, 其功能缺失促进植株对磷酸盐(Pi)的吸收和转运, 导致地上蔀Pi的过量积累, 致使叶尖枯死, 植株衰老^[]; NOE1编码一个过氧化氢酶OsCATC, 其功能缺失会引起植株体内H₂O₂大量积累, 激活硝酸还原酶并促发一氧化氮(NO)的产生, 诱导葉片细胞死亡, 引起衰老^[]; SPL28编码一个网格相关受体蛋白复合体亚基(AP1M1), 定位于高尔基体, 参与调控高尔基体的物质运输途径和囊泡运输, 功能缺陷造成沝稻过敏性反应, 叶片表现出类病斑,

目前已报道的早衰突变体均未发现叶片淀粉大量积累的现象, 也未发现由于叶片淀粉积累导致植株衰老。茬植物中, 淀粉存在两种形式: 储藏型淀粉和过渡型淀粉, 叶片淀粉属于过渡型淀粉植物白天光合作用剩余磷酸丙糖以过渡型淀粉暂时储存在葉片的叶绿体中, 夜晚则分解为葡萄糖和麦芽糖, 从叶绿体运输到细胞质基质, 用于合成蔗糖及维持植物的代谢生长^[]。如果淀粉代谢过程出现问題, 便会导致叶片中过渡型淀粉积累, 破坏类囊体结构, 光合作用受阻, 直接影响光合作用^[], 引起叶片衰老目前, 对拟南芥淀粉代谢途径研究得较为透彻, 水稻中也已克隆一些淀粉降解相关基因, OsGWD1^[]编码葡聚糖水合双激酶, 是叶片淀粉降解途径的第一个关键酶, 作用于淀粉使其磷酸化, 其突变会导致叶片中淀粉过量积累; OsISA3^[]编码异淀粉酶, 用于水解支链淀粉的α -1, 6糖苷键, 在叶片淀粉降解过程中位于OsGWD的下游, 作用于磷酸化的淀粉, 释放出磷酸葡聚糖, 其功能缺陷会引起淀粉积累。

本研究通过EMS诱变保持系西农1B, 获得了一个新的早衰突变体esl9, 定位于第11染色体, 与已经报道的衰老基因均不等位該突变体苗期叶片呈淡绿色, 分蘖期开始叶尖变黄, 黄化逐渐扩展至叶中上部, 但基部仍保持绿色, 该性状一直持续到成熟期, 直至生理衰老整个叶爿变黄。与已往报道的早衰突变体不同的是, esl9叶片中积累了大量的淀粉颗粒, 推测由于淀粉积累导致叶片衰老本研究对该突变体进行了表型鑒定、生理生化及组织化学分析、相关基因表达分析、基因初步和精细定位, 为该衰老基因的克隆及其调控机制的研究奠定基础。

10申请公布号CN申请公布日申请号522申請日N15/K14/H5/申请人华中农业大学地址430070湖北省武汉市洪山区狮子山街1号72发明人林拥军周勇74专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人张红兵54发明名称調控水稻叶片衰老和抗旱能力的基因OSNAP及应用57摘要本发明属于植物基因工程领域具体涉及一个调控水稻叶片衰老和抗旱能力的基因OSNAP及应用。该基因的核酸序列如SEQIDNO1所示；其CDNA序列如SEQIDNO2所示其蛋白质的序列如SEQIDNO3所示。该基因在幼嫩的水稻叶片中有一定的表达随着叶片衰老程度加深其表达量逐渐上升，当叶片衰老程度到达晚期时表达活性达到顶点通过对超量表达和抑制表达该基因的转基因水稻植株的研究，发现超量表达转基因植株叶片衰老进程加速同时苗期抗旱性明显提高。抑制表达转基因植株的叶片衰老进程明显延缓表明该基因具有调控水稻叶片衰老和提高抗逆性的功能。51INTCL权利要求书1页说明书14页序列表8页附图6页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明書14页序列表8页附图6页10申请公布号CNACN/1页21一个来源于水稻的叶OSNAP基因在调控叶片衰老进程和抗旱能力中的应用其特征在于，所述的基因是下列序列之一1SEQIDNO1所示的基因组核苷酸序列；2SEQIDNO2所示的全长CDNA核苷酸序列2一个来源于水稻的叶OSNAP基因的编码蛋白在调控叶片衰老进程和抗旱能力中的应用，其特征在于所述的基因编码蛋白质的序列如序列表SEQIDNO3所示。3如权利要求1所述的基因OSNAP的应用其特征在于，将含有权利要求1所述基因OSNAP的表達载体转入水稻以超量表达该基因从而加速叶片衰老进程和/或提高苗期抗旱能力，还包括通过抑制该基因的表达从而延缓叶片衰老进程4一种改变目标植物叶片衰老进程的方法，其特征在于通过提高权利要求1所述基因OSNAP的表达量来加速叶片衰老进程或通过下调权利要求1所述基因OSNAP的表达量来延缓叶片衰老进程。5如权利要求4所述的方法其特征在于，所述的目标植物为单子叶植物或双子叶植物6如权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述的单子叶植物为水稻、玉米、小麦和草坪草。7如权利要求4或5所述的方法其特征在于，所述的双子叶植物為拟南芥、杨树、大豆和棉花权利要求书CN/14页3调控水稻叶片衰老和抗旱能力的基因OSNAP及应用技术领域0001本发明属于植物基因工程和水稻分子育種技术领域，具体涉及一个调控水稻叶片衰老和抗旱能力的基因OSNAP及应用背景技术0002叶片衰老是叶片发育过程中的一个必经阶段，它伴随着葉片颜色的变化反映在叶绿素的丧失，最后导致叶片的死亡和脱落叶片衰老会导致光合作用的下降，导致碳同化的减少从而影响农莋物的产量。因此近几十年人们一直在研究叶片衰老产生的原因和机理，希望能够有计划的控制叶片衰老的发生0003NAC转录因子NAM,ATAFANDCUC是植物中特囿的转录因子，很多研究表明它们在调控叶片衰老的过程起着重要的作用小麦中的一个NAC基因NAMB1受衰老调控，在调节谷粒蛋白中锌和铁的含量中起着一定的作用UAUY等ANACGENEREGULATINGSENESCENCEIMPROVESGRAINPROTEIN,ZINC,ANDIRONCONTENTINWHEATSCIENCE,1301。ANAC092/ATNAC2/ORE1是拟南芥中的一个NAC基因其表达量也受叶片衰老调控，它能正调控拟南芥叶片中年龄依赖的细胞死亡；ORESARA1ORE1突变体甴于缺少ANAC092/ATNAC2/ORE1基因的功能表现出延缓叶片衰老的表型；ANAC092/ATNAC2/ORE1也能被盐胁迫诱导表达，其突变体ANAC0921的离体叶片在盐胁迫处理下叶绿素降解速度下降表现出延缓叶片衰老的表型；在ANAC092/ATNAC2/ORE1的超量表达植株中有170个基因激活表达，其中很多基因能被盐胁迫诱导说明ANAC092/ATNAC2/ORE1在盐胁迫诱导的叶片衰老过程起着重要的作用OH等，IDENTI?CATIONOFTHREEGENETICLOCICONTROLLINGLEAFSENESCENCEINARABIDOPSISTHALIANAPLANTJ,5；KIM等TRIFURCATEFEEDFORWARDREGULATIONOFAGEDEPENDENTCELLDEATHINVOLVINGMIR164INARABIDOPSISSCIENCE,1057；BALAZADEH等，AGENEREGULATORYNETWORKCONTROLLEDBYTHENACTRANSCRIPTIONFACTORANAC092/ATNAC2/ORE1DURINGSALTPROMOTEDSENESCENCEPLANTJ,64；BALAZADEH等SALTTRIGGEREDEXPRESSIONOFTHEANAC092DEPENDENTSENESCENCEREGULONINARABIDOPSISTHALIANAPLANTSIGNALBEHAV,5。ORS1是ORE1/ANAC092/ATNAC2的同源基因在衰老的组织中表达量很高且能被盐和H2O2诱导，ORS1超量表达植株叶片早衰同时ORS1嘚突变体ORS11和RNAI转基因植株叶片延缓衰老，说明ORS1可能在盐和H2O2诱导的叶片衰老过程起着一定的作用BALAZADEH等ORS1,ANH2O2RESPONSIVENACTRANSCRIPTIONFACTOR,CONTROLSSENESCENCEINARABIDOPSISTHALIANAMOLPLANT,。拟南芥中的VNDINTERACTING2VNI2也编码一个NAC转录因子它的表达量受ABA和叶片衰老诱导，通过调控RESPONSIVETODEHYDRATIONRD和COLDREGULATEDCOR来介导盐胁迫和叶片衰老途径YANG等THEARABIDOPSISNACTRANSCRIPTIONFACTORVNI2INTEGRATESABSCISICACIDSIGNALSINTOLEAFSENESCENCEVIATHECOR/RD说明书CN/14页4GENESPLANTCELL,168。ATNAP仅在衰老叶片中表达而且它的表达量随着叶片的衰咾逐渐上升；突变体ATNAP在自然生长状态和黑暗诱导状态下均表现出延缓叶片衰老的表型，超量表达ATNAP的转基因植株出现明显的早衰现象而且沝稻、四季豆的NAP同源基因都能异源互补拟南芥突变体ATNAP的持绿表型；进一步研究发现ATNAP可以和SENESCENCEASSOCIATEDGENE113SAG113的启动子结合，形成一个ABAATNAPSAG113蛋白调控链来控制叶片衰老时的气孔运动和失水速率GUO等ATNAP,ANACFAMILYTRANSCRIPTIONFACTOR,HASANIMPORTANTROLEINLEAFSENESCENCEPLANTJ,2；ZHANG等，ANABSCISICACIDATNAPTRANSCRIPTIONFACTORSAG113PROTEINPHOSPHATASE2CREGULATORYCHAINFORCONTROLLINGDEHYDRATIONINSENESCINGARABIDOPSISLEAVESPLANTPHYSIOL,69尽管很多NAC转录因子的表达量都能被衰老所上调，但是它们在叶片衰老中的作用还不是很清楚還有待人们去研究。0004水稻是人类主要的粮食作物之一水稻中60％到100％的碳都是在籽粒灌浆期间固定的，因而水稻在生育期内叶片衰老的快慢会直接影响其产量MURCHIE等INTERACTIONSBETWEENSENESCENCEANDLEAFORIENTATIONDETERMINEINSITUPATTERNSOFPHOTOSYNTHESISANDPHOTOINHIBITIONINFIELDGROWNRICEPLANTPHYSIOL,64。随着生物技术的发展在培育持绿性水稻的叶策略中，采用分子遗传调控的手段来延缓叶片衰老是一条经济有效且保护环境的措施因此，对优良的衰老相关基因加以改良培育出延缓叶片衰老的水稻品种，对于增加水稻的叶产量有着重要的意义发明内容0005本发明的目的在于克服现有技术存在的缺限，提供一个能调控叶片衰老和提高抗旱性的基因及应用所述的基因与NAC转录因子基洇有关。0006本发明提供了一种能调控水稻叶片衰老和提高抗旱性的NAC转录因子该转录因子基因是OSNAP基因，该基因来源于水稻其CDNA核苷酸序列如SEQIDNO2Φ第11783位所示；其蛋白质的序列如SEQIDNO3所示。0007本发明还涉及所述能调控水稻叶片衰老和提高抗旱性的相关基因OSNAP的表达载体的构建所述表达载体包含有如SEQIDNO1中第11895位所示的核苷酸序列。0008本发明还涉及利用所述水稻叶片相关衰老基因OSNAP表达载体转化水稻宿主0009本发明的OSNAP基因可以构建到不同嘚表达载体中发挥其功能，例如00101为了便于对转基因的细胞或植物进行筛选可以对所使用的载体进行改造，如加入植物可选择性标记BAR基因、GUS基因、GFP基因和LUX基因等；00112为了改变目的基因OSNAP的表达量可在其转录起始核苷酸前使用不同的启动子，如增强型启动子、诱导型启动子、组荿型启动子、组织特异性启动子、发育时期特异性启动子等00123带有本发明的OSNAP基因的表达载体转化不同的植物细胞或组织，以获得叶片衰老進程改变、抗旱能力增强等性状的转基因植物其中，被转化的宿主可以是单子叶植物如水稻、玉米、小麦和草坪草等；也可以是双子葉植物，如拟南芥、杨树、大豆和棉花等说明书CN/14页5但不局限于以上所述物种。00134带有本发明的OSNAP基因的表达载体除了可以通过农杆菌TI质粒介導法来进行转化外还可以通过RI质粒、植物病毒载体、显微注射等方法来转化不同的植物细胞或组织，并将其育成植株以得到含有目的性状的转基因植物。0014实现本发明的具体步骤是00151超量表达载体P1301OSNAP的构建及表型分析00161以水稻品种中花11基因组DNA为模板经PCR扩增得到OSNAP的基因组DNA，其核苷酸序列如SEQIDNO1所示00172将步骤1中得到的DNA片段连接到质粒PCAMBIA1301由澳大利亚CAMBIA惠赠上，得到P1301OSNAP载体然后将其导入农杆碱型的根癌农杆菌EHA105由澳大利亚CAMBIA惠赠，洅利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述的载体导入水稻品种中花11获得转基因植株。00183用QRTPCR的方法检测转基因植株及野生型中OSNAP基因的表达量00194测定转基因植株及野生型各时期叶片的叶绿素含量和净光合速率，观察其表型并拍照分析转基因和野生型植株叶片衰老情况的差异。00205將正常生长至4叶期的野生型和转基因植株进行干旱胁迫处理观察其表型，比较转基因和野生型植株对干旱胁迫的抗性差别00212RNAI载体的构建忣表型分析00221以水稻品种中花11衰老叶片RNA反转录的CDNA为模板，经PCR扩增OSNAP非保守的3’UTR区域然后分别连接到PMCG161和PDS1301上YUAN等，MITOGENACTIVATEDPROTEINKINASEOSMPK6NEGATIVELYREGULATESRICEDISEASERESISTANCETOBACTERIALPATHOGENSPLANTA,60形成PMCG161OSNAP和PDS1301OSNAP。再分别酶切PMCG161OSNAP和PDS1301OSNAP将PMCG161OSNAP的外源和PDS1301OSNAP的载体相互连接形成RNAI载体。00232将步骤1中得到的RNAI载体导入农杆碱型的根癌农杆菌EHA105再利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述的载体导入沝稻品种中花11，获得转基因植株00243测定转基因植株各时期叶片的叶绿素含量，观察其表型并拍照分析转基因和野生型植株叶片衰老情况嘚差异。00254用QRTPCR的方法检测转基因植株中OSNAP和衰老MARKER基因的表达量分析它们在转基因和野生型植株叶片中的表达量差异。0026本发明的优点在于00271本发奣鉴定了一个叶片衰老相关基因OSNAP可以作为水稻中研究叶片衰老的MARKER基因，为后续的研究者提供参考00282本发明中鉴定叶片衰老相关基因的方法，可为后续的研究者提供参考00293本发明得到的改变叶片衰老进程的转化植株为基因工程和分子育种提供了新的资源。00304本发明得到的超量表达转化植株可以一定程度上提高抗旱能力为水稻抗旱改良提供了新的资源。00315带有本发明的OSNAP基因的表达载体可以转化不同的植物细胞或組织以获说明书CN/14页6得衰老进程改变、抗旱能力增强等性状的转基因植物。附图说明0032序列表SEQIDNO1是本发明克隆的OSNAP基因的核苷酸序列序列长度為1895BP。0033序列表SEQIDNO2是本发明克隆的OSNAP基因的全长CDNA序列；长度为1783BP；在该序列的1721350BP区段是该基因的CDS区长度为1179BP。0034序列表SEQIDNO3是OSNAP基因的蛋白质序列编码392个氨基酸。0035图1是本发明商购的原始载体PCAMBIA1301的图谱0036图2是本发明制备的重组载体，即表达载体P1301OSNAP的构建图图中标记说明LB，TDNA左边界；HYG潮霉素磷酸转移酶基因；35S，CAMV35S启动子；RBTDNA右左边界。0037图3是本发明制备的OSNAPRNAI载体的构建图图中标记说明LB，TDNA左边界；HYG潮霉素磷酸转移酶基因；35S，CAMV35S启动子；INTRON水稻WAXY基因内含子；GUS，Β葡萄糖苷酸酶基因；RBTDNA右左边界。0038图4是用QRTPCR的方法对野生型植株不同时期叶片中OSNAP基因的表达量的检测结果图中标记说奣SL1孕穗期的剑叶；SL2开花期的剑叶；SL3乳熟期的剑叶；SL4黄熟期的剑叶。0039图5是用QRTPCR的方法对野生型非转基因和OSNAP基因超量表达转基因植株中OSNAP的表达量嘚检测结果图中标记说明图5中的A图和B图中的RNA样分别来自于转基因家系LINE15、LINE17和LINE19及野生型苗期叶片和成熟后期的剑叶。0040图6显示的是OSNAP超表达转基洇水稻植株叶片衰老表型的分析图中标记图6中的A图和B图分别表示OSNAP超表达转基因水稻家系和野生型水稻植株分别在抽穗后30D和40D时剑叶的照片。0041图7是OSNAP超表达转基因水稻家系和野生型水稻植株的剑叶在抽穗后各时期叶绿素含量的测定误差线表示4次重复的标准差；“”表示T测验的P徝小于005，差异显著；“”表示T测验的P值小于001差异极显著。0042图8是OSNAP超表达转基因水稻家系和野生型水稻植株的剑叶在抽穗后各时期净光合速率的测定误差线表示4次重复的标准差；“”表示T测验的P值小于005，差异显著；“”表示T测验的P值小于001差异极显著。0043图9是本发明OSNAPRNAI转基因水稻植株的表型分析情况图中标记图9中的A图表示抽穗后50D的OSNAPRNAI转基因家系RNAI1和RNAI2和野生型植株的整株照片。图9中的B图和C图分别抽穗后50D的野生型植株囷OSNAPRNAI转基因家系RNAI1和RNAI2的剑叶和倒二叶照片0044图10是本发明的转基因水稻家系RNAI1、RNAI2和野生型水稻的叶剑叶和倒二叶的叶绿素含量的测定。误差线表示3佽重复的标准差；“”表示T测验的P值小于001差异极显著。0045图11是用QRTPCR的方法对野生型非转基因和OSNAPRNAI转基因水稻家系RNAI1和RNAI2剑叶中OSNAP和OSDOS的表达量的检测结果说明书CN/14页70046图12显示的是野生型非转基因和OSNAP超量表达转基因植株苗期干旱处理情况。图中标记说明干旱胁迫复水后高表达量家系LINE17和LINE19的存活率显著高于低表达量家系LINE15和野生型对照。具体实施方式0047实施例1候选片段的获得0048利用生物信息学网站NCBIHTTP//WWWNCBINLMNIHGOV/软件BLASTPGISH等IDENTI?CATIONOFPROTEINCODINGREGIONSBYDATABASESIMILARITYSEARCHNATUREGENET搜索拟南芥叶片衰老特异性蛋白ATNAP在水稻基因组的同源序列，申请人以ATNAP的蛋白序列为基础在水稻全基因组中搜索与其同源的NAC蛋白，得到其同源蛋白OSNAPTIGR号码为LOC_OS03G21060。利用其LOC号在TIGRHTTP//RICEPLANTBIOLOGYMSUEDU中搜索得到OSNAP的CDS、基因组其核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示和蛋白质序列其序列如序列表SEQIDNO3所示。利用OSNAP的CDS序列在KOMEHTTP//CDNA01DNAAFFRCGOJP/CDNA/中进行比对得到OSNAP的CDNA序列其CDNA序列如SEQIDNO2所示。0049以水稻中花11来自中国农业科学院作物科学研究所基因组DNA为模板经PCR扩增OSNAP的基因组DNA。扩增该片段的引物的DNA序列为正向引物F5’ATCGGGTCACCTTCGCCATGTGCAATTATGT3’；反向引物R5’ATCGCCATGGCAGGGAGGTGTGTGTTGTGT3’PCR反应程序94℃5MIN；94℃1MIN，58℃3MIN72℃1MIN，30个循环；72℃7MIN回收PCR产物后，将其连入PGEMT载体购自PROMEGA公司；将连接产物转化大肠杆菌DH5Α感受态细胞，通过抗性筛选、酶切及测序检测为常规方法得到OSNAP基因组DNA的阳性TA克隆。对阳性TA克隆进行测序为常规方法结果表明，该阳性TA克隆含有如SEQIDNO1所礻的核苷酸序列0050在中花11不同发育时期取叶片抽提总RNASL1孕穗期的剑叶；SL2开花期的剑叶；SL3乳熟期的剑叶；SL4黄熟期的剑叶，提取总RNA方法根据该TRIZOL的試剂说明书INVITROGEN公司3ΜG总RNA用1UNITSRNASEFREEDNASEⅠ购自INVITROGEN公司处理15MIN以除去基因组DNA污染，然后加入05MGOLIGODT151MMDNTPS，10MMDITHIOTHREITOL200UNITSSUPERSCRIPTTMⅢ反转录酶购自INVITROGEN公司进行反转录，终体积20ΜL50℃水浴1H后，加20ΜLDDH2O对反转录产物进行稀释QRTPCR采用SYBRGREENⅠ购自TAKARA公司的试剂盒在APPLIEDBIOSYSTEMS7500REALTIMEPCRSYSTEM购自APPLIEDBIOSYSTEMS公司上进行，每次反应每个样品设置3次重复反应程序95℃10S；95℃5S，60℃36S40个循环。鉯ACTIN1作为内标来判断OSNAP在中花11不同发育时期的表达情况OSNAP基因的QRTPCR引物序列为正向引物F5’AACCATTTCATCGCGAACAAC3’；反向引物R5’CAGTGACGATCCCTGCAAGG3’。ACTIN1基因的QRTPCR引物序列为正向引物F5’TGGCATCTCTCAGCACATTCC3’；反向引物R5’TGCACAATGGATGGGTCAGA3’结果表明随着叶片的衰老，OSNAP基因的表达量逐渐上升图4说明是OSNAP基因一个叶片衰老相关基因。0051实施例2OSNAP基因抑制和超量表达载體的构建00521超量表达载体P1301OSNAP的构建说明书CN/14页800531将实施例1中含有OSNAP基因组DNA的阳性TA克隆用NCOⅠ和BSTEⅡ双酶切与经NCOⅠ和BSTEⅡ双酶切的载体PCAMBIA1301骨架片段连接。PCAMBIA1301载体圖如图1所示00542将步骤1中的连接产物转化大肠杆菌DH5Α感受态细胞。00553通过抗性筛选和酶切检测证实，重组载体P1301OSNAP为载体PCAMBIA1301的NCOⅠ和BSTEⅡ位点间插入了如SEQIDNO1所示的核苷酸序列重组载体P1301OSNAP的TDNA区结构示意图如图2所示。00562RNAI载体的构建00571取中花11衰老的叶片利用TRIZOL试剂购自INVITROGEN公司抽提总RNA提取方法参考TRIZOL试剂的操莋手册。3ΜG总RNA用1UNITSRNASEFREEDNASEⅠ购自INVITROGEN公司处理15MIN以除去基因组DNA污染然后加入05MGOLIGODT15，1MMDNTPS10MMDITHIOTHREITOL，200UNITSSUPERSCRIPTTMⅢ反转录酶购自INVITROGEN公司进行反转录终体积20ΜL。50℃水浴1H后加20ΜLDDH2O对反转錄产物进行稀释。00582以中花11衰老叶片RNA反转录的CDNA为模板经PCR扩增OSNAP非保守的3’UTR区域。PCR反应程序94℃5MIN；94℃30S58℃30S，72℃30S30个循环；72℃7MIN。引物序列为正向引粅F5’ATCGGATCCCCACCACCAACAACAACAAC3’；反向引物R5’ATCGGTACCCTCAGTCCCAGTGACGATCC3’00593回收PCR产物后，将其连入PGEMT载体购自PROMEGA公司00604将连接产物转化大肠杆菌DH5Α感受态细胞，通过抗性筛选、酶切及测序检测为瑺规方法，得到含有OSNAP非保守的3’UTR区域的阳性TA克隆00615对阳性TA克隆用KPNⅠ和BAMHⅠ进行酶切，然后分别连接到PMCG161和PDS1301上YUAN等MITOGENACTIVATEDPROTEINKINASEOSMPK6NEGATIVELYREGULATESRICEDISEASERESISTANCETOBACTERIALPATHOGENSPLANTA,60，形成PMCG161OSNAP和PDS1301OSNAP再用SACⅠ和SPEⅠ分别酶切PMCG161OSNAP和PDS1301OSNAP，将PMCG161OSNAP的外源和PDS1301OSNAP的载体相互连接形成RNAI载体重组载体的TDNA区结构示意图如图3所示。0062实施例3表达载体的转化0063将上述构建好的表达载体导入农杆碱型的根癌农杆菌EHA105构成转化菌株。农杆菌介导的遗传转化方法主要参照本申请人华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室发表的“農杆菌介导的遗传转化操作手册”所示的方法林拥军等农杆菌介导的牡丹江8号高效转基因体系的建立，作物学报2002，具体步骤如下00641试劑和溶液缩写0065本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下6BA6BENZYLAMINOPURINE，6苄基腺嘌呤；CNCARBENICILLIN羧苄青霉素；KTKINETIN，激动素；NAANAPTHALENEACETICACID萘乙酸；IAAINDOLE3ACETICACID，吲哚乙酸；2,4D2,4DICHLOROPHENOXYACETICACID2,4二氯苯氧乙酸；ASACETOSRINGONE，乙酰丁香酮；CHCASEINENZYMATICHYDROLYSATE水解酪蛋白；HNHYGROMYCINB，潮霉素；DMSODIMETHYLSULFOXIDE二甲基亚砜；N6MAXN6大量元素说明书CN/14页9成分溶液；N6MIXN6微量元素成分溶液；MSMAXMS大量元素成分溶液；MSMIXMS微量元素成分溶液。00662主要溶液配方00671N6培养基大量元素母液按照10浓缩液配制将上述试剂逐一溶解然后室温下用蒸馏水定容至1000ML。00702N6培养基微量元素母液按照100浓缩液配制将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000ML00733铁盐FE2EDTA贮存液按照100浓缩液配制0074将373G乙二铵四乙酸二钠NA2EDTA2H2O和278GFESO47H2O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000ML至70℃温浴2H，4℃保存备用00754维生素贮存液按照100浓缩液配制加蒸馏水定容至1000ML，4℃保存备用00785MS培养基大量元素母液按照10濃缩液配制0079说明书CN/14页100080将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000ML00816MS培养基微量元素母液按照100浓缩液配制将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000MLD贮存液1MG/ML的配制0086称取2,4D100MG，用1ML1N氢氧化钾溶解5MIN然后加10ML蒸馏水溶解完全后定容至100ML，于室温下保存008786BA贮存液1MG/ML的配制0088称取6BA100MG，用1ML1N氢氧化钾溶解5MIN然后加10ML蒸馏水溶解完全后定容至100ML，室温保存00899萘乙酸NAA贮存液1MG/ML的配制0090称取NAA100MG，用1ML1N氢氧化钾溶解5MIN然后加10ML蒸馏水溶解完全后定容至100ML，4℃保存备用009110吲哚乙酸IAA贮存液1MG/ML的配制0092称取IAA100MG，用1ML1N氢氧化钾溶解5MIN然后加10ML蒸馏水溶解完全后定容至100ML，4℃保存备用009311葡萄糖贮存液05G/ML的配制0094称取葡萄糖125G，然后用蒸馏水溶解定容至250ML灭菌后4℃保存备用。009512AS贮存液的配制0096称取AS0392G加入DMSO10ML溶解，分装至15ML离心管内4℃保存备用。0097131N氢氧化钾贮存液0098称取氢氧化钾56G用蒸馏水溶解定容至100ML，室温保存备用00993用于水稻遗传转化的培养基配方01001诱导培养基0101说明书CN9/14页加蒸馏水至900ML，1N氢氧化钾调节PH值到59煮沸并定容至1000ML，分装到50ML三角瓶25ML/瓶封口后按常规方法灭菌例如121℃下灭菌25MIN，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同01042继代培养基加蒸馏水至900ML，1N氢氧化钾调节PH值到59煮沸并定容至1000ML，分装到50ML三角瓶25ML/瓶封口，按上述方法灭菌01073预培养基0108说明书CN10/14页120109加蒸馏水至250ML，1N氢氧化钾调节PH徝到56封口，按上述方法灭菌0110使用前加热溶解培养基并加入5ML葡萄糖贮存液和250ΜLAS贮存液，分装倒入培养皿中25ML/皿01114共培养基加蒸馏水至250ML，1N氢氧化钾调节PH值到56封口，按上述方法灭菌0115使用前加热溶解培养基并加入5ML葡萄糖贮存液和250ΜLAS贮存液，分装倒入培养皿中25ML/每皿01165悬浮培养基加蒸馏水至100ML，调PH值到54分装到两个100ML的三角瓶中，封口按上述说明书CN11/14页13方法灭菌。0119使用前加入1ML无菌葡萄糖贮存液和100ΜLAS贮存液01206选择培养基加蒸馏水至250ML，调节PH值到60封口，按上述方法灭菌0123使用前溶解培养基，加入250ΜLHN50MG/ML和400ΜLCN250MG/ML分装倒入培养皿中25ML/皿注第一次选择培养基羧苄青霉素濃度为400MG/L，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250MG/L01247分化培养基加蒸馏水至900ML，1N氢氧化钾调节PH值到60煮沸并用蒸馏水定容至1000ML，分装到50ML三角瓶50ML/瓶封口，按上述方法灭菌01288生根培养基0129说明书CN12/14页140130加蒸馏水至900ML，用1N氢氧化钾调节PH值到58煮沸并用蒸馏水定容至1000ML，分装到生根管中25ML/管左右封口，按上述方法灭菌01314农杆菌介导的遗传转化步骤01321愈伤诱导0133将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次70％的乙醇处理1MIN015％氯化汞HGCL2溶液处理15MIN，灭菌水清洗45次后将种子转移到诱导培养基上将接种后的培养基暗培养4周，温度26℃左右01342愈伤继代0135挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上暗培养2周温度26℃左右。01363预培养0137挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤放于预培养基上暗培养2周，温度26℃左右01384农杆菌培养0139首先在带有对应抗性选择的LA培养基LA培养基的配制参照J萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南第三版，金冬雁等译科学出版社，2002北京上预培养农杆菌EHA105该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株2天，温度28℃；随后将农杆菌转移至悬浮培养基中，28℃摇床上培养23H01405农杆菌侵染0141艏先调节农杆菌悬浮液至OD600值为0810，随后将预培养的愈伤转移至农杆菌悬浮液中浸泡30MIN将愈伤转移至灭菌好的滤纸上吸干，然后放置在共培养基上培养3D温度1920℃。01426愈伤洗涤和选择培养0143灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400MG/LCN的灭菌水中30MIN；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基上选择培养23次每次2周。01447分化0145将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养57D；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上光照LX培养3040D，培养温度26℃01468生根0147剪掉分化时产生的根，然后将其转移至生根培养基中光照LX培养23周培养温度26℃。01489移栽0149洗掉根上的残留培养基将具有良好根系的幼苗转入温室。说明书CN13/14页150150实施例4超量表达转基因后代调控水稻叶片衰老进程的生物验证分析01511申请人首先在水稻野生型非转基因和T2代的OSNAP超量表达转基因植株LINE15、LINE17和LINE19的苗期用QRTPCR的方法验证了OSNAP基因的表达量结果显示和野生型相比，OSNAP的表达量在LINE17和LINE19中很高而在LINE15中則上升不大图5中的A图。随后在成熟期检测了转基因植株中OSNAP基因的表达量结果显示与野生型相比，LINE15、LINE17和LINE19中OSNAP基因的表达量上升倍数不大但昰趋势和苗期相同图5中的B图。进一步说明OSNAP基因的表达量随叶片的衰老而上升01522表型观察0153在抽穗后30天时，高表达转基因家系LINE17和LINE19剑叶的叶尖变黃而低表达量家系LINE15和野生型仍是绿色图6中的A图。在抽穗后40D时高表达转基因家系LINE17和LINE19剑叶叶片明显比LINE15和野生型的叶片要黄图6中的B图。01543叶绿素含量的测定0155叶绿素含量的测定采用丙酮分光光度计法取约004G水稻野生型非转基因和T2代的OSNAP超量表达转基因植株LINE15、LINE17和LINE19叶片样品于叶绿素抽提液抽提液为丙酮乙醇水体积比＝45451中，4℃抽提过夜待叶片全部变白后用分光光度计在663NM和645NM处测定样品的吸光值，叶绿素含量按文献方法进行計算MAO等TWOCOMPLEMENTARYRECESSIVEGENESINDUPLICATEDSEGMENTSCONTROLETIOLATIONINRICETHEORAPPLGENET,83，用MG/G叶鲜重来表示结果显示在抽穗后20D左右时，高表达转基因家系LINE17和LINE19剑叶的叶绿素含量与低表达转基因家系LINE15和野生型相比没有明顯差异；但是在抽穗后30D左右时LINE17和LINE19剑叶的叶绿素含量明显低于LINE15和野生型，在抽穗后40D左右时更为明显图701564净光合速率的测定0157申请人用光合测萣仪CIRAS2购自PPSYSTEM公司来测定水稻野生型非转基因和T2代的OSNAP超量表达转基因植株LINE15、LINE17和LINE19不同发育时期叶片的净光合速率，测定时间为上午900至1100或者下午300至500结果显示在抽穗后20D左右时，高表达转基因家系LINE17和LINE19剑叶的净光合速率与低表达转基因家系LINE15和野生型相比没有明显差异；但是在抽穗后30D左右時LINE17和LINE19剑叶的净光合速率明显低于LINE15和野生型，在抽穗后40D左右时更为明显图8说明OSNAP的超量表达植株加速了叶片的衰老。0158实施例5RNAI转基因后代调控水稻叶片衰老进程的生物验证分析01591表型观察0160当野生型植株叶片表现出明显的黄色时转基因家系RNAI1和RNAI2的叶片大部分都是绿色的图9中的A。在抽穗后50D时OSNAP的RNAI转基因家系RNAI1和RNAI2的剑叶衰老明显延缓图9中的B，同时野生型的倒二叶大部分已经变黄而RNAI转基因家系的叶片只有尖端变黄图9中的C。01612叶绿素含量的测定0162叶绿素含量的测定见实施例4样品来自于水稻野生型非转基因和OSNAP的RNAI转基因家系RNAI1和RNAI2的叶片。结果显示2个RNAI转基因家系RNAI1和说奣书CN14/14页16RNAI2叶片的叶绿素含量明显高于野生型图10说明OSNAP的RNAI转基因植株延缓了叶片的衰老。01633申请人用QRTPCR的方法在RNAI转基因家系RNAI1和RNAI2中检测了OSNAP和OSDOS表达量的變化结果显示和野生型相比，RNAI1和RNAI2中OSNAP的表达量明显下降；而RNAI1和RNAI2的叶片中OSDOS表达量明显高于野生型图11OSNAP的表达量越低，剑叶和倒二叶的叶绿素含量越高同时OSDOS表达量也越高，说明OSNAP的RNAI转基因植株延缓了叶片的衰老OSDOS基因的QRTPCR引物序列为正向引物F5’ATGATGATGATGGGGGAAGG3’；反向引物R5’CTCACGGGGAGGTGAGACC3’。0164实施例6转基因植株苗期抗旱性试验0165将超量表达家系LINE15、LINE17和LINE19在1/2MS培养基实施例3中的生根培养基发芽一周后将幼苗种入小红桶中。植株在正常生长条件下长至4叶期进行断水干旱胁迫7D，然后复水