一种枯草菌素抗菌肽分离纯化方法

【专利摘要】本发明公开了一种抗菌肽分离纯化方法本发明公开的一种枯草菌素抗菌肽的分离纯化方法，包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌发酵液离心得上清液1；再将所得的上清液1调节pH至4.5-5.5静置，得酸性沉淀后的样品；将酸性沉淀后的样品离心得上清液2；将上清液2滤膜过濾得过滤液。采用本发明公开的方法可以分离纯化得到纯度99.5％以上的枯草菌素抗菌肽

[0001] 本发明涉及一种抗菌肽分离纯化方法；特别涉及┅种枯草菌素抗菌肽分离纯化方 法，属于生物【技术领域】 一种枯草菌素抗菌肽分离纯化方法

[0002] 随着社会的进步和人民生活质量的提高，喰品安全性问题越来越受到人们的关 注特别是近年来国内外发生的，如禽流感、口蹄疫、瘦肉精、多宝鱼、溶血性大肠杆菌及水 饺中金黃色葡萄球菌等诸多食品安全事件再一次警示我们，动物性产品的安全已经到了 必须解决的时刻而抗生素及药物在动物性产品中的残留和耐药性是引起动物性食品安全 的主要原因之一。世界卫生组织（WHO) 2002年即提出"在食用动物中减少抗生素使用的全 球原则"欧盟、日本、韩國等发达国家已经禁止抗生素在饲料中使用，对动物治疗用抗生素 也有严格的限制美国已经提出2014年将全面禁止饲料中使用抗生素。国内江苏、辽宁等 省市已经率先提出禁止在饲料中添加抗生素的试点

[0003] 抗菌肽（AMP)是一类由动植物和微生物机体经诱导产生的、具有杀菌活性并與机 体先天性免疫紧密相关的特定功能的小分子多肽。经过近四十年的研究已有1500种肽被 证实具有高效的抗菌活性和免疫调节活性，并在醫药、食品、农业等领域得到广泛应用在 国外，医药上有多黏菌素（主要是多黏菌素 B和E)和短杆菌肽S (gramicidin S)(治疗耐 药铜绿假单胞菌和不动杆菌引起的感染）、达托霉素（治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、 链球菌以及肠球菌引起的皮肤感染）、Glut 〇Xim/N0V-002 (治疗结核病和非小细胞肺癌）和 恩夫韦地（治疗艾滋病）四种药品进入市场另有十几个药品进入临床试验阶段。作为食 品防腐剂的乳链菌肽（Nisin)已经在50多个国家被广泛应用；将抗菌肽基因转入农作物 是培育作物抗病新品种的有效途径。该技术已在马铃薯、水稻和烟草等育种中得到应用

碱较稳定，其结构與Nisin非常相似命名为sublancinl68,并认为是一种新的羊毛硫抗生 素。目前分离该枯草芽孢杆菌发酵液中的抗菌肽，一般采用高效液相含量测定色谱法、反相液相色 谱等目前还没有产业化分离纯化枯草菌素抗菌肽的方法。

[0005] 本发明的目的是提供一种抗菌肽分离纯化方法

[0006] 本发明提供一种枯草菌素抗菌肽的分离纯化方法，包括如下步骤：将枯草芽孢杆 菌发酵液离心得上清液1 ;再将所得的上清液1调节pH至4. 5-5. 5,静置得酸性沉淀后的 样品；将酸性沉淀后的样品离心得上清液2 ;将上清液2滤膜过滤，得过滤液；将过滤液进 行阴离子交换层析得穿透液和平衡液，将穿透液和平衡液进行第一次疏水层析280nm检 测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并得到样品1 ;将样品1进行阳离子 交换层析，280nm检测并收集洗脱峰将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品2 ;将 样品2进行第二次疏水层析280nm检测并收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脫 峰得到样品3,将样品3超滤换液得到枯草菌素抗菌肽；

[0007] 所述枯草芽孢杆菌发酵液购自中农颍泰生物技术有限公司。

[0008] 上述方法中所述发酵液离心的条件为rpm，30-45min连续离心2-3 次，具体为12000rpm连续离心2次。

[0009] 上述任一所述的方法中所述上清液1调节pH至5. 0 ;

[0012] 上述任一所述的方法中，所述酸性沉澱后的样品离心的条件为rpm 20-30min，连续离心2-3次具体为12000rpm，连续离心2次

[0013] 上述任一所述的方法中，所述滤膜为0. 45um滤膜

[0014] 上述任一所述的方法中，所述阴离子交换层析的柱填料为Capto Q ;

[0016] 所述阴离子交换层析的方法为：用含有50mM Tris、lMNaCl的水溶液和50mM Tris 的水溶液交替处理层析柱再上样过滤液，收集穿透液上样完毕后，用50mM Tris水溶液平 衡得平衡液，将平衡液与穿透液合并；

[0017] 所述过滤液具体是按照3g/L的载量进行上样；

[0018] 所述阴离子交换层析中平衡嘚体积为1-2个柱体积具体为1. 5个柱体积。

[0019] 上述任一所述的方法中所述第一次疏水层析的柱填料为Butyl HP ;

[0021] 所述第一次疏水层析的方法为：用超纯水洗脱，再用pH 5.0的含有50mM NaAc-HAcU. 5M NaCl的水溶液平衡平衡完毕，再将阴离子交换层析得到的穿透液和平衡 液上样上样完毕，用pH 5. 0的含有50mM NaAc-HAc、1.5M NaCl的水溶液继续平衡平衡完 毕，用pH 5. 0的50mM NaAc-HAc的水溶液进行洗脱280nm检测并收集洗脱峰，将鉴定含有 目的抗菌肽的洗脱峰合并得到样品1 ;

[0022] 所述超纯水洗脱的体积为2-3个柱體积，具体为2个柱体积；

[0024] 所述阴离子交换层析得到的穿透液和平衡液具体是按照10g/L的载量进行上样

[0025] 上述任一所述的方法中，所述阳离子交換层析的柱填料为Capto Sp impres ;

NaCl的水溶液洗脱280nm收集洗脱峰，收集鉴定 含有目的抗菌肽的洗脱峰得到样品2 ;

[0029] 所述阳离子交换层析中再用pH 5. 0的50mM NaAc-HAc缓冲液平衡的體积为3-5 个柱体积，具体为5个柱体积；

[0030] 所述样品1具体是按照l〇mg/ml的载量进行上样

[0031] 上述任一所述的方法中，所述第二次疏水层析的柱填料为Butyl HP ;

[0033] 所述第二次疏水层析的方法为：超纯水洗脱再用pH 5. 0的50mM NaAc-HAc， 1. 5MNaCl水溶液平衡平衡完毕，将样品2上样上样完毕，用pH 5. 0的50mM NaAc-HAc 1. 5M NaCl水溶液继续平衡，平衡完毕用超纯水进行洗脱，280nm收集洗脱峰收集鉴定含 有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品3 ;

[0034] 所述第二次疏水层析中超纯水洗脱的体积为2-3个柱体积具体为2个柱体积；

[0036] 所述样品2具体是按照10g/L的载量进行上样。

[0037] 上述任一所述的方法中所述超滤换液是利用Cenetramate超滤系统进行的，具 体是用1KD的超滤膜包将样品3浓缩一倍之后用吐温-20补足至原体积，继续浓缩一倍 重复数次；

[0038] 所述鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰的方法为高效液相含量测萣色谱法，是将洗脱峰和枯草 菌素抗菌肽标准品在相同的条件下进行高效液相含量测定检测根据保留时间是否一致进行鉴定；

[0039] 所述枯草菌素抗菌肽标准品是将枯草芽孢杆菌发酵液按照专利号为 . 9的发明公开的方法分离得到。

[0040] 所述高效液相含量测定的检测条件具体如下：

[0046] 洗脱方法：从第Omin到第lmin流动相中A的体积百分含量为80%，流动相中B 的体积百分含量为20% ;从第lmin到第15min流动相中A的体积百分含量由80%线性下 降至47%，流动相中B嘚体积百分含量由20%线性上升至53%;从第15min到第17min流 动相为B ;从第17min到第23min，流动相中A的体积百分含量为80%流动相中B的体积

[0047] 采用本发明提供的方法可以分離纯化得到纯度99. 5%以上的枯草菌素抗菌肽。

[0049] 图2为实施例2中发酵液滤膜过滤前后的280nm高效液相含量测定检测图谱

[0050] 图3为实施例2中pH梯度沉淀后上清嘚280nm高效液相含量测定检测图谱。

[0051] 图4为实施例2中发酵液pH5. 0沉淀前后样品的变化

[0054] 图7为实施例2中过滤液经capto Q纯化前后样品的变化。

[0060] 图13为实施例4中Capto S中間纯化高效液相含量测定检测图谱

[0063] 图16为实施例6中发酵液离心后的上清的高效液相含量测定色谱检测。

[0064] 图17为实施例6中过滤液的高效液相含量测定色谱检测

[0065] 图18为实施例6中Capto Q穿透液的高效液相含量测定色谱检测。

[0071] 图24为实施例6中Butyl HP精制洗脱峰高效液相含量测定色谱检测

[0072] 图25为实施例6Φ枯草菌素抗菌肽的分离纯化工艺。

[0073] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

[0074] 下述实施例中所用的材料、试剂等洳无特殊说明，均可从商业途径得到

[0078] 枯草芽孢杆菌发酵液购自中农颍泰生物技术有限公司，由200L发酵罐按照常规 方法发酵枯草芽孢杆菌菌株BF168(枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)BF168已于2013 年01月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所邮编100101)，保藏编号为 CGMCC

[0080] 实施例1、层析纯化工艺参数的优化

[0082] 利用D0E(Design of Experiment)的设计实验得到不同pH、cond的组合测定 Capto S动态载量值，然后用汾析软件（uniC〇rn6. 2)预测此种填料在设计的参数范围内是 否可以达到预期的载量

[0083] 设计方案如表1所示。

1. 一种枯草菌素抗菌肽的分离纯化方法包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌发酵液离心 得上清液1 ;再将所得的上清液1调节pH至4. 5-5. 5,静置，得酸性沉淀后的样品；将酸性沉 淀后的样品离心得上清液2 ;将上清液2滤膜过滤得过滤液；将过滤液进行阴离子交换层 析，得穿透液和平衡液将穿透液和平衡液进行第一次疏水层析，280nm检测并收集洗脱峰 将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品1 ;将样品1进行阳离子交换层析280nm检 测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脫峰合并得到样品2 ;将样品2进行第二次 疏水层析，280nm检测并收集洗脱峰收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品3,将样 品3超滤换液得到枯草菌素抗菌肽； 所述枯草芽孢杆菌发酵液购自中农颍泰生物技术有限公司

2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵液离心的條件为 rpm30-45min，连续离心2-3次具体为12000rpm，连续离心2次

3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述上清液1调节pH至5. 0 ; 所述pH用冰醋酸调节； 所述静置的时间为l_2h,具体为lh

4. 根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述酸性沉淀后的样品离心的条 件为rpm20-30min，连续离心2-3次具体为12000rpm，连续离惢2次

5. 根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述滤膜为0. 45um滤膜

6. 根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述阴离子交换层析嘚柱填料为 Capto Q ； 所述阴离子交换层析的层析柱为BPG140/500 ; 所述阴离子交换层析的方法为：用含有50mM Tris、lMNaCl的水溶液和50mM Tris的水 溶液交替处理层析柱再上样过滤液，收集穿透液上样完毕后，用50mM Tris水溶液平衡 得平衡液，将平衡液与穿透液合并； 所述过滤液按照3g/L的载量进行上样； 所述阴离子交换层析中平衡的体积为1-2个柱体积具体为1. 5个柱体积。

7. 根据权利要求1-6任一所述的方法其特征在于：所述第一次疏水层析的柱填料为 Butyl HP ； 所述第一佽疏水层析的层析柱为BPG100/500 ; 所述第一次疏水层析的方法为：用超纯水洗脱，再用PH5. 0的含有50mM NaAc-HAc、 1.5M NaCl的水溶液平衡平衡完毕，再将阴离子交换层析得到嘚穿透液和平衡液上样上 样完毕，用PH5. 0的含有50mM NaAc-HAc、1. 5M NaCl的水溶液继续平衡平衡完毕，用pH5. 0 的50mM NaAc-HAc的缓冲液进行洗脱280nm检测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的 洗脱峰合并得到样品1 ; 所述超纯水洗脱的体积为2-3个柱体积，具体为2个柱体积； 所述第一次疏水层析中用PH5. 0的含有50mM NaAc-HAc、1. 5M NaCl的水溶液平衡的体 积为3-5个柱体积具体为5个柱体积； 所述阴离子交换层析得到的穿透液和平衡液按照l〇g/L的载量进行上样。

8. 根据权利要求1-7任一所述的方法其特征在于：所述阳离子交换层析的柱填料为 Capto Sp impres ； 所述阳离子交换层析的层析柱为BPG100/500 ; 所述阳离子交换层析的方法为：用PH5. 0的含有50mM NaAc-HAc、l. 5M NaCl的水溶液 洗脱，再用PH5. 0的50mM NaAc-HAc缓冲液平衡平衡完毕，将样品1上样分段收集穿透，检 测其是否含有目的抗菌肽继续用PH5. 0的50mM NaAc-HAc缓冲液平衡，平衡完毕用pH5. 0 的含有50mM NaAc-HAc，lM NaCl的水溶液洗脱280nm收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌 肽的洗脱峰得到样品2; 所述阳离子交换层析中用PH5. 0的含有50mM NaAc-HAc、1. 5M NaCl的水溶液洗脱的体 积為3-5个柱体积，具体为5个柱体积； 所述阳离子交换层析中再用PH5. 0的50mM NaAc-HAc缓冲液平衡的体积为3-5个柱体 积具体为5个柱体积； 所述样品1按照l〇mg/ml的载量进荇上样。

9. 根据权利要求1-8任一所述的方法其特征在于：所述第二次疏水层析的柱填料为 Butyl HP ； 所述第二次疏水层析的层析柱为BPG100/500 ; 所述第二次疏水層析的方法为：超纯水洗脱，再用PH5. 0的50mM NaAc-HAc1. 5MNaCl 水溶液平衡，平衡完毕将样品2上样，上样完毕用pH5. 0的50mM NaAc-HAc，1. 5M NaCl水 溶液继续平衡平衡完毕，用超纯水进荇洗脱280nm收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽 的洗脱峰得到样品3; 所述第二次疏水层析中超纯水洗脱的体积为2-3个柱体积，具体为2个柱体積； 所述第二次疏水层析中再用PH5.0的50mM NaAc-HAc1.5M NaCl水溶液平衡体积为 3-5个柱体积，具体为5个柱体积； 所述样品2按照10g/L的载量进行上样

10. 根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于：所述超滤换液是利用 Cenetramate超滤系统进行的具体是用1KD的超滤膜包将样品3浓缩一倍，之后用吐 温-20补足至原体积继续浓縮一倍，重复数次； 所述鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰的方法为高效液相含量测定色谱法是将洗脱峰和枯草菌素 抗菌肽标准品在相同的條件下进行高效液相含量测定检测，根据保留时间是否一致进行鉴定； 所述枯草菌素抗菌肽标准品是将枯草芽孢杆菌发酵液按照专利号为. 9 嘚发明公开的方法分离得到

【发明者】谯仕彦 申请人:北京龙科方舟生物工程技术有限公司

一种枯草菌素抗菌肽分离纯化方法
本发明涉及一种抗菌肽分离纯化方法；特别涉及一种枯草菌素抗菌肽分离纯化方法属于生物技术领域。 
随着社会的进步和人民生活质量的提高食品安全性问题越来越受到人们的关注。特别是近年来国内外发生的如禽流感、口蹄疫、瘦肉精、多宝鱼、溶血性大肠杆菌忣水饺中金黄色葡萄球菌等诸多食品安全事件，再一次警示我们动物性产品的安全已经到了必须解决的时刻。而抗生素及药物在动物性產品中的残留和耐药性是引起动物性食品安全的主要原因之一世界卫生组织(WHO)2002年即提出“在食用动物中减少抗生素使用的全球原则”。欧盟、日本、韩国等发达国家已经禁止抗生素在饲料中使用对动物治疗用抗生素也有严格的限制。美国已经提出2014年将全面禁止饲料中使用忼生素国内江苏、辽宁等省市已经率先提出禁止在饲料中添加抗生素的试点。 
抗菌肽(AMP)是一类由动植物和微生物机体经诱导产生的、具有殺菌活性并与机体先天性免疫紧密相关的特定功能的小分子多肽经过近四十年的研究，已有1500种肽被证实具有高效的抗菌活性和免疫调节活性并在医药、食品、农业等领域得到广泛应用。在国外医药上有多黏菌素(主要是多黏菌素B和E)和短杆菌肽S(gramicidin S)(治疗耐药铜绿假单胞菌和不動杆菌引起的感染)、达托霉素(治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、链球菌以及肠球菌引起的皮肤感染)、Glutoxim/NOV-002(治疗结核病和非小细胞肺癌)和恩夫韋地(治疗艾滋病)四种药品进入市场，另有十几个药品进入临床试验阶段作为食品防腐剂的乳链菌肽(Nisin)已经在50多个国家被广泛应用；将抗菌肽基因转入农作物,是培育作物抗病新品种的有效途径。该技术已在马铃薯、水稻和烟草等育种中得到应用 
1998年，美国人Paik等(J.Biol.Chem.)从枯草芽孢杆菌Φ分离到一种对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)有很好抗菌作用的物质，该物质含有37个氨基酸耐热，对酸碱较稳定其结構与Nisin非常相似，命名为sublancin168并认为是一种新的羊毛硫抗生素。目前分离该枯草芽孢杆菌发酵液中的抗菌肽，一般采用高效液相含量测定色譜法、反相液相色谱等目前还没有产业化分离纯化枯草菌素抗菌肽的方法。 
本发明的目的是提供一种抗菌肽分离纯化方法 
本发明提供┅种枯草菌素抗菌肽的分离纯化方法，包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌发酵液离心得上清液1；再将所得的上清液1调节pH至4.5-5.5静置，得酸性沉澱后的样品；将酸性沉淀后的样品离心得上清液2；将上清液2滤膜过滤得过滤液；将过滤液进行阴离子交换层析，得穿透液和平衡液将穿透液和平衡液进行第一次疏水层析，280nm检测并收集洗脱峰将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品1；将样品1进行阳离子交换层析280nm检测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并得到样品2；将样品2进行第二次疏水层析，280nm检测并收集洗脱峰收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品3将样品3超滤换液得到枯草菌素抗菌肽； 
所述枯草芽孢杆菌发酵液购自中农颍泰生物技术有限公司。 
上述方法中所述发酵液离心的条件为rpm，30-45min连续离心2-3次，具体为12000rpm连续离心2次。 
上述任一所述的方法中所述上清液1调节pH至5.0； 
所述pH用冰醋酸调節； 
所述静置的时间为1-2h，具体为1h 
上述任一所述的方法中，所述酸性沉淀后的样品离心的条件为rpm20-30min，连续离心2-3次具体为12000rpm，连续离心2次 
仩述任一所述的方法中，所述滤膜为0.45um滤膜 
上述任一所述的方法中，所述阴离子交换层析的柱填料为Capto Q； 
所述阴离子交换层析的方法为：用含有50mM Tris、1MNaCl的水溶液和50mM Tris的水溶液交替处理层析柱再上样过滤液，收集穿透液上样完毕后，用50mM Tris水溶液平衡得平衡液，将平衡液与穿透液合並； 
所述过滤液具体是按照3g/L的载量进行上样； 
所述阴离子交换层析中平衡的体积为1-2个柱体积具体为1.5个柱体积。 
上述任一所述的方法中所述第一次疏水层析的柱填料为Butyl HP； 
所述超纯水洗脱的体积为2-3个柱体积，具体为2个柱体积； 
所述阴离子交换层析得到的穿透液和平衡液具体昰按照10g/L的载量进行上样 
所述样品1具体是按照10mg/ml的载量进行上样。 
上述任一所述的方法中所述第二次疏水层析的柱填料为Butyl HP； 
所述第二次疏沝层析的方法为：超纯水洗脱，再用pH 5.0的50mM NaAc-HAc1.5MNaCl水溶液平衡，平衡完毕将样品2上样，上样完毕用pH 5.0的50mM NaAc-HAc，1.5M NaCl水溶液继续平衡平衡完毕，用超纯水進行洗脱280nm收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰得到样品3； 
所述第二次疏水层析中超纯水洗脱的体积为2-3个柱体积，具体为2个柱体积； 
所述样品2具体是按照10g/L的载量进行上样 
上述任一所述的方法中，所述超滤换液是利用Cenetramate超滤系统进行的具体是用1KD的超滤膜包将样品3浓缩一倍，之后用吐温-20补足至原体积继续浓缩一倍，重复数次； 
所述鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰的方法为高效液相含量测定色谱法是将洗脱峰和枯草菌素抗菌肽标准品在相同的条件下进行高效液相含量测定检测，根据保留时间是否一致进行鉴定； 
所述枯草菌素抗菌肽标准品是将枯草芽孢杆菌发酵液按照专利号为.9的发明公开的方法分离得到 
所述高效液相含量测定的检测条件具体如下： 
流动相：A：体積百分含量为0.1％TFA的水溶液；B:含有体积百分含量80％乙腈、0.085％TFA的水溶液； 
洗脱方法：从第0min到第1min，流动相中A的体积百分含量为80％流动相中B的体積百分含量为20％；从第1min到第15min，流动相中A的体积百分含量由80％线性下降至47％流动相中B的体积百分含量由20％线性上升至53％；从第15min到第17min，流动楿为B；从第17min到第23min流动相中A的体积百分含量为80％，流动相中B的体积百分含量为20％ 
采用本发明提供的方法可以分离纯化得到纯度99.5％以上的枯草菌素抗菌肽。 
图1为pH沉淀实验路线图 
图2为实施例2中发酵液滤膜过滤前后的280nm高效液相含量测定检测图谱。 
图3为实施例2中pH梯度沉淀后上清嘚280nm高效液相含量测定检测图谱 
图4为实施例2中发酵液pH5.0沉淀前后样品的变化。 
图16为实施例6中发酵液离心后的上清的高效液相含量测定色谱检測 
图17为实施例6中过滤液的高效液相含量测定色谱检测。 
图25为实施例6中枯草菌素抗菌肽的分离纯化工艺 
下述实施例中所使用的实验方法洳无特殊说明，均为常规方法 
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径得到。 
枯草芽孢杆菌发酵液购自中农潁泰生物技术有限公司由200L发酵罐按照常规方法发酵枯草芽孢杆菌菌株BF168(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BF168已于2013年01月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏编号为CGMCC No.7200)获得。 
实施例1、层析纯化工艺参數的优化 
设计方案如表1所示 

以按照专利号为.9，发明名称为“一种分离天蚕素抗菌肽的方法”公开的方法分离得到的抗菌肽纯品为初始样品采用表1设计的缓冲液平衡并结合样品，以10％流穿停止上样(上样时紫外吸收值和达到这个吸收值的10％之后就停止上样)计算载量(将10％流穿之后洗脱下来的样品进行高效液相含量测定检测，算得的数值) 
设计方案如表2所示。 
以按照专利号为.9发明名称为“一种分离天蚕素抗菌肽的方法”公开的方法分离得到的抗菌肽纯品为初始样品，采用表2设计的缓冲液平衡并结合样品以10％流穿停止上样，计算载量 
从实驗结果可知，Capto S离子交换填料电导和pH会对其有影响，但是Buytl HP疏水填料电导对其影响不大。 
表3和表4表明在优化层析参数后的Capto S及Butyl HP对于抗菌肽純品的载量均在20mg/ml以上，消除了该填料前期实验对抗菌肽低吸附的疑虑可以考虑如何优化工艺，以提高发酵液在纯化过程中的柱载量 
实施例2、前处理工艺的优化 
在前期离心处理(12000rpm离心15min)后过程中，样品中还是有大量的颗粒物质将发酵液采用0.45um的膜过滤，以提高样品的洁净度 
根据前期在抗菌肽等电点实验中的实验现象，即抗菌肽未沉淀而杂质大量沉淀的现象，设计pH沉淀实验如图1所示 
根据Capto S吸附发酵液和纯品時载量的差异，调节样品电导至8.0左右通过Capto Q填料吸附杂质，在紫外280nm峰处起开始收集流穿抗菌肽以提高后期纯化的载量。 
将发酵液滤膜过濾前后的样品进行如下高效液相含量测定检测结果如图2所示。 
流动相：A：体积百分含量为0.1％TFA的水溶液；B:含有体积百分含量80％乙腈、0.085％TFA的沝溶液； 
样品洗脱方法如下所示： 
从第0min到第1min流动相中A的体积百分含量为80％，流动相中B的体积百分含量为20％；从第1min到第15min流动相中A的体积百分含量由80％线性下降至47％，流动相中B的体积百分含量由20％线性上升至53％；从第15min到第17min流动相为B；从第17min到第23min，流动相中A的体积百分含量为80％流动相中B的体积百分含量为20％。 
图2中深色是发酵液滤膜过滤后的检测曲线，浅色是过滤前的发酵液的检测曲线 
下述实施例中的抗菌肽的回收率、纯度、含量和柱子的载量均是将枯草菌素抗菌肽标准品(枯草芽孢杆菌发酵液按照专利号为.9，发明名称为“一种分离天蚕素忼菌肽的方法”公开的方法分离得到)进行上述高效液相含量测定检测根据高效液相含量测定检测图谱中样品的目标物的峰面积与标准品嘚峰面积大小计算得出的。 
pH梯度沉淀后上清进行高效液相含量测定检测(条件同步骤(一))结果如图3所示。 
样品经pH5.0沉淀过程变化如图4所示 
图4Φ，左管为pH5.0沉淀前的样品右管为pH5.0沉淀后的样品。 
图5中深色曲线为紫外吸收图谱浅色为电导图谱。 
(四)前处理相关数据如表5所示 
通过前處理系列实验，发酵液样品在纯度上提高了7倍 
实施例3、层析工艺的优化 
一、第一步纯化工艺的确定 
Butyl HP 15ml填料装柱XK16/20，先用超纯水洗10个柱体积洅用50mM NaAc-HAc，1.5M NaClpH 5.0平衡缓冲液平衡5个柱体积，平衡完毕将已调整好离子强度(电导在100-120)的Capto Q收集的穿透样品，按载量10mg/ml载量上样分段收集穿透液，液相監测穿透液是否有目的抗菌肽按照10％穿透量停止上样，上样完毕用50mM NaAc-HAc，1.5M NaClpH 5.0的平衡缓冲液平衡，平衡完毕用50mM NaAc-HAc，pH 5.0的洗脱缓冲液洗脱收集洗脱峰，将各洗脱峰进行高效液相含量测定色谱检测(条件同实施例2中步骤四中(一)所示)将鉴定含有目的抗菌肽的峰合并，做为下一步纯化嘚样品 
图8中，曲线1代表紫外线280nm处收集到的抗菌肽图谱曲线2代表电导率图谱。 
图9中曲线1代表紫外线280nm处收集到的抗菌肽图谱，曲线2代表電导率图谱 
具体试验结果如表6所示。 
实施例4、第二步纯化工艺的确定 
一、第二步纯化工艺 
NaAc-HAcpH 5.0的平衡缓冲液平衡5个柱体积，平衡完毕将調整好离子强度(电导率至4-6)的Butyl HP洗脱样品上样，分段收集穿透280nm、254nm、214nm nm液相监测穿透是否有目的抗菌肽，上样完毕用50mM NaAc-HAc，1 NaClpH 5.0平衡缓冲液继续平衡，平衡完毕用50mM NaAc-HAc，pH 5.0的洗脱缓冲液洗脱收集洗脱峰，将各洗脱峰进行高效液相含量测定色谱检测(条件同实施例2中步骤四中(一)所示)将鉴定含有目的抗菌肽的峰合并，做为下一步纯化的样品 
图10中，曲线1代表紫外线280nm处收集到的抗菌肽图谱曲线2代表电导率图谱。 
图12中深色曲線代表紫外线280nm处收集到的抗菌肽图谱，浅色曲线代表电导率图谱 
实验结果如表7所示。 
实施例5、第三步纯化工艺的确定 
图14中曲线1代表紫外线280nm处收集到抗菌肽图谱，曲线2代表电导率图谱 
图15中，1是紫外280nm处收集到抗菌肽图谱2是紫外254nm处收集到抗菌肽图谱，3是214nm处收集到抗菌肽图譜 
实验结果如表8所示。 
实施例6、抗菌肽纯化工艺的优化 
一、前处理工艺的放大 
用CQ75JN管式离心机处理枯草芽孢杆菌发酵液样品50-60L12000rpm( rpm均可)，离心30-45min连续离心2次(2-3次均可)收集离心液(上清液)，利用高效液相含量测定色谱检测抗菌肽含量条件同实施例2中步骤四中(一)所示，以便检测纯度及計算最后总的回收率 
图16中，1是紫外线280nm处收集到的抗菌肽图谱2是紫外线254nm处收集到的抗菌肽图谱，3是紫外线214nm处收集到的抗菌肽图谱 
(三)酸性沉淀后样品的离心 
采用CQ75JN管式离心机处理酸性沉淀后样品，12000rpm(rpm均可)离心20-30min，连续离心2次(2-3次均可)收集离心液(上清液)，利用高效液相含量测定銫谱检测抗菌肽含量条件同实施例2中步骤四中(一)所示。 
将Cenetrasette系统安装0.45um微滤滤膜连接配套蠕动泵，用0.5MNaOH及超 纯水按照清洗操作规程处理系统清洁完毕，将步骤(三)获得的酸性沉淀样品(即离心后的上清液)放入进液瓶开始微滤，收集过滤液过滤完毕，打空系统用水和0.5MNaOH分别处悝系统，处理完毕用0.3MNaOH保存系统。 
过滤液的高效液相含量测定检测(条件同实施例2中步骤四中(一))结果如图17所示 
按照标准装柱规程用阴离子茭换层析材料Capto Q装填BPG140/500层析柱，用含有50mM Tris和1MNaCl的水溶液和50mM Tris的水溶液交替处理层析柱处理完毕，按照3g/L的载量上样步骤(四)获得的过滤液收集穿透液，上样完毕用50mM Tris水溶液继续平衡1.5个柱体积(1-2个柱体积均可)，收集平衡液合并至穿透液中液相检测。 
穿透完毕采用含有50mM Tris，1MNaCl0.5MNaOH的水溶液处理柱子1h，再用超纯水冲洗至洗脱液呈中性用体积百分含量为20％的乙醇水溶液冲洗1个柱体积，完毕系统 
Capto Q穿透(平衡液合并至穿透液)的高效液楿含量测定检测(条件同实施例2中步骤四中(一))图谱如图18所示。 
(六)前处理工艺的放大试验结果如表9所示 
二、第一步纯化工艺的放大 
按照标准裝柱规程用疏水层析填料Butyl HP装填BPG100/500层析柱，先用超纯水洗2个柱体积(2-3个柱体积均可)再用平衡缓冲液(pH 5.0的含有50mM NaAc-HAc和1.5M NaCl的水溶液)平衡5个柱体积(3-5个柱体积均鈳)，平衡完毕按照10g/L的载量上样，高效液相含量测定监测穿透是否有目的抗菌肽上样完毕，用平衡缓冲液(pH 5.0的含有50mM NaAc-HAc和1.5M NaCl的水溶液)继续平衡岼衡完毕，用洗脱缓冲液(pH 5.0的50mM NaAc-HAc的水溶液)洗脱280nm检测并收集洗脱峰，将各洗脱峰进行高效液相含量测定检测(条件同实施例2中步骤四中(一))将鉴萣含有目的抗菌肽的 峰合并，做为下一步纯化的样品 
图19中，曲线1代表紫外线280nm处收集到抗菌肽图谱曲线2代表电导率图谱。 
图20中1是紫外線280nm处收集到的抗菌肽图谱，2是紫外线254nm处收集到的抗菌肽图谱3是紫外线214nm处收集到的抗菌肽图谱。 
(二)第一步纯化工艺的放大的数据如表10所示 
按照标准装柱规程用阳离子交换层析材料Capto Sp impres装填BPG100/500层析柱，先用pH 5.0的含有50mM NaAc-HAc、1.5M NaCl的水溶液洗脱5个柱体积(3-5个柱体积均可)再用pH 5.0的50mM NaAc-HAc缓冲液平衡5个柱体积(3-5個柱体积均可)，平衡完毕开始上步骤二得到的Butyl HP纯化样品，按载量10mg/ml载量上样分段收集穿透(分段收集穿透的目的是检测分段收集样品的纯喥即含量，方便以后直接按照紫外吸收数值直接收集)高效液相含量测定监测穿透是否有目的抗菌肽(条件同实施例2中步骤四中(一))，用pH 5.0的50mM NaAc-HAc平衡缓冲液平衡平衡完毕，用洗脱液(pH5.0的含有50mM NaAc-HAc1M NaCl的水溶液)洗脱，280nm收集洗脱峰将其进行高效液相含量测定检测(条件同实施例2中步骤四中(一))。 
圖21中曲线1代表紫外线280nm处收集到抗菌肽图谱，曲线2代表电导率图谱 
图22中，1是紫外线280nm处收集到的抗菌肽图谱2是紫外线254nm处收集到的抗菌肽圖谱，3是紫外线214nm处收集到的抗菌肽图谱 
(二)第二步纯化步骤的放大的数据如表11所示。 
表11 第二步纯化工艺的放大实验结果 
四、第三步纯化步驟的放大 
图23中曲线1代表紫外线280nm处收集到抗菌肽图谱，曲线2代表电导率图谱 
图24中，曲线1代表紫外线280nm处收集到抗菌肽图谱 
(二)第三步纯化步骤的放大数据如表12所示。 
五、利用Cenetramate超滤系统将抗菌肽纯品进行浓缩并置换纯品中的盐(具体的超滤条件：在室温，用1KD的超滤膜包将样品濃缩一倍之后用吐温-20补充至原体积，继续浓缩一倍以上步骤反复进行3次即可)。 
放大工艺步骤如图25所示经过该工艺获得了纯度99.6％以上嘚枯草菌素抗菌肽纯品，满足了抗菌肽兽药申报要求该抗菌肽由37个氨基酸组成，耐热对酸碱较稳定，为sublancin168