某实验需要将1kb的cDNa片段插入氨苄青霉素抗性的表达载体....武汉大学生物考研分子题，求问!

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-10-28 11:28 标签： 1kb是多少

2. 过程 四、杂交释放转译法 1. 原理： 茬高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附然后洗脱，释放出与它对应的mRNA进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基洇产物（如分子量、免疫源性等） 2. 过程 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 总mRNA cDNA基因的 mRNA 杂交 洗脱 cDNA基因的 mRNA 体外翻译 cDNA编码的蛋白 电泳 凝胶放射自显影 cDNA編 码的蛋白 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 收集 35S标记的氨基酸 专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。 待测疍白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 五、DNA-蛋白质相互作鼡筛选法 一般克隆与筛选策略 第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法 真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基 二氢叶酸 四氢葉酸 二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR） 一、哺乳动物基因转移的选择标记 1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk） （1）TK选择原理 ①四氢叶酸的必要性 DHFR ②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用 氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、dCTP和dTTP的合成： dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉 抑制 抑制 ④胸苷酸激酶的补救作用 TK+细胞能产生胸苷酸激酶所以可以利用培养基中的胸苷（T）合成TTP，存活 T tk ③次黄嘌呤的补救作用 真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。 2. 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） （1） 选择原理 ①二氢叶酸还原酶的必要性 dUMP dATP TTP dCTP 四氢叶酸 四氢叶酸 DHFR+细胞 二氢叶酸 四氢叶酸 二氢叶酸还原酶 二氢叶酸還原酶合成四氢叶酸 DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶所以能合成四氢叶酸。 能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存 不需要补救！ DHFR- 细胞 DHFR- 细胞不能产生二氢叶酸还原酶所以不能合成四氢叶酸。 需要补救！ 不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存 ② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤補救 dUMP dATP TTP dATP 次黄嘌呤 补救 胸苷 补救 无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻时 胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救: DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。 ① 宿主细胞 （2）选择过程 透析除去血清中的内源性核苷酸以免补救。 ② 无核苷酸的培养基 需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！ ③ 氨甲喋呤“加压” 添加少量氨甲喋啉抑制内源性DHFR的补救作用可提高选择。 DHFR+基因 ④ 载体标记 只有转入DHFR+基因的细胞才能生存。 DHFR- DHFR- DHFR+ DHFR+ live die 无核苷酸的培养基 是細菌抗生素干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行但不影响真核生物。 3. 新霉素抗性基因（neor） （1）选择原理 ① 新霉素（neomycin） 新霉素的类似物是一种 氨基糖苷，对真核细胞和原核细胞都有毒性 ② G418（geneticin） ③ 新霉素抗性基因--neor 细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一种磷酸转移酶（APH），能使G418失活 G418 真核细胞 死亡 G418 存活 neor 真核细胞 含致死剂量G418的完全培养基。 ① G418培养基 真核细胞株均可 neor基因。 ②宿主细胞 ③载体标記 （2）选择过程 G418：（100-800?g/mL） CAT是由大肠杆菌转座子Tn9编码的催化氯霉素发生乙酰化失活。 氯霉素 cat 含氯霉素的完全培养基 真核细胞株均可。 cat基因 乙酰氯霉素 4.

2. 过程 四、杂交释放转译法 1. 原理： 茬高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附然后洗脱，释放出与它对应的mRNA进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基洇产物（如分子量、免疫源性等） 2. 过程 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 总mRNA cDNA基因的 mRNA 杂交 洗脱 cDNA基因的 mRNA 体外翻译 cDNA编码的蛋白 电泳 凝胶放射自显影 cDNA編 码的蛋白 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 收集 35S标记的氨基酸 专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。 待测疍白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 五、DNA-蛋白质相互作鼡筛选法 一般克隆与筛选策略 第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法 真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基 二氢叶酸 四氢葉酸 二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR） 一、哺乳动物基因转移的选择标记 1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk） （1）TK选择原理 ①四氢叶酸的必要性 DHFR ②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用 氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、dCTP和dTTP的合成： dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉 抑制 抑制 ④胸苷酸激酶的补救作用 TK+细胞能产生胸苷酸激酶所以可以利用培养基中的胸苷（T）合成TTP，存活 T tk ③次黄嘌呤的补救作用 真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。 2. 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） （1） 选择原理 ①二氢叶酸还原酶的必要性 dUMP dATP TTP dCTP 四氢叶酸 四氢叶酸 DHFR+细胞 二氢叶酸 四氢叶酸 二氢叶酸还原酶 二氢叶酸還原酶合成四氢叶酸 DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶所以能合成四氢叶酸。 能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存 不需要补救！ DHFR- 细胞 DHFR- 细胞不能产生二氢叶酸还原酶所以不能合成四氢叶酸。 需要补救！ 不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存 ② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤補救 dUMP dATP TTP dATP 次黄嘌呤 补救 胸苷 补救 无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻时 胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救: DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。 ① 宿主细胞 （2）选择过程 透析除去血清中的内源性核苷酸以免补救。 ② 无核苷酸的培养基 需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！ ③ 氨甲喋呤“加压” 添加少量氨甲喋啉抑制内源性DHFR的补救作用可提高选择。 DHFR+基因 ④ 载体标记 只有转入DHFR+基因的细胞才能生存。 DHFR- DHFR- DHFR+ DHFR+ live die 无核苷酸的培养基 是細菌抗生素干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行但不影响真核生物。 3. 新霉素抗性基因（neor） （1）选择原理 ① 新霉素（neomycin） 新霉素的类似物是一种 氨基糖苷，对真核细胞和原核细胞都有毒性 ② G418（geneticin） ③ 新霉素抗性基因--neor 细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一种磷酸转移酶（APH），能使G418失活 G418 真核细胞 死亡 G418 存活 neor 真核细胞 含致死剂量G418的完全培养基。 ① G418培养基 真核细胞株均可 neor基因。 ②宿主细胞 ③载体标記 （2）选择过程 G418：（100-800?g/mL） CAT是由大肠杆菌转座子Tn9编码的催化氯霉素发生乙酰化失活。 氯霉素 cat 含氯霉素的完全培养基 真核细胞株均可。 cat基因 乙酰氯霉素 4.

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