：用于提高燃料、化学品和氨基酸产生的副产物蓄积减少的酵母微生物的制作方法
本发明提供了重组微生物以及产生此类微生物的方法还提供了通过使合适的底物与重組微生物和由其得到的酶制剂接触来产生包括燃料、化学品和氨基酸的有益代谢产物的方法。以电子方式提交的文本文件描述与此以电子方式提交的文本文件的内容全文以引用方式并入本文计算机可读格式的序列表副本(文件名GEV0_045_03W0_SeqList_ST25.
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微生物将丙酮酸转化成有益代谢产物(包括燃料、化学品和氨基酸)的能力近年来已在文献中得到广泛描述。參见例如Alper等2009, Nature Microbiol. Rev.
7:715-723。重组工程技术已使得可以創建表达能够产生许多有用产物的生物合成途径的微生物这些产物例如缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和泛酸(维生素B5)。此外已在表达异源玳谢途径的微生物中通过重组方法产生了燃料，诸如异丁醇(參见例如Donaldson等的W0/以及Liao等的W0/)。虽然工程化微生物代表了可再生生产燃料、化学品囷氨基酸的可能有用的工具但是其中许多这些微生物不能满足商业相关要求，原因是它们的性能特征低下包括低生产率、低滴度和低嘚率。在许多现有微生物中观察到的性能欠佳的主要原因之ー是不可取地将途径中间体转化成了不需要的副产物本发明人已鉴定出多种副产物，包括23-ニ羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)
ニ羟基-2-甲基-丁酸、异丁酸、3-甲基-1-丁酸、2-甲基-1-丁酸和丙酸，它们衍生自用于产生燃料、化学品和氨基酸的生粅合成途径的多种中间体这些副产物的蓄积会对多种发酵反应中所期望代谢产物的合成和得率产生负面影响。迄今为止尚未表征负责產生这些不需要的副产物的酶活性。更具体地讲本申请表明，3-酮酸还原酶(3-KAR)和醛脱氢酶(ALDH)的活性使得由重要的生物合成途径中间体形成这些副产物
本发明由研究这些酶活性而得来，并表明3-KAR和/或ALDH酶的抑制能显著減少或消除不需要的副产物的形成并同时提高有益代谢产物的得率和滴度。本申请此外还表明增强3-KAR和/或ALDH酶活性可用于增加多种副产物的产生，诸如23- ニ羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)、2-こ基-2，3-ニ羟基丁酸、23-ニ羟基-2-甲基-丁酸、异丁酸、3-甲基-I- 丁酸、2-甲基-I-
丁酸和丙酸。发明概述 本发明人已发现不需要的副产物可在多个发酵过程中蓄积，包括候选生物燃料-異丙醇的发酵这些不需要的副产物的蓄积因途径中间体的不可取转化所致，这些中间体包括3-酮酸、こ酰乳酸和2-こ酰-2-羟基丁酸和/或酸诸洳异丁醛、I-
丁醛、I-丙醛和丙酮、2-甲基-1-丁醛和3-甲基-1-丁醛。这些中间体向不需要的副产物的转化会抑制3-酮酸-和/或醛衍生产物的最佳的生产率和嘚率因此，本发明人已开发了在3-酮酸和/或醛作为途径中间体的过程中减少3-酮酸和/或醛中间体向各种发酵副产物转化的方法在第一方面，本发明涉及重组微生物其包含3-酮酸和/或醛为其中间体的生物合成途径，其中所述重组微生物(a)基本上不含催化3-酮酸向3-羟基酸转化的酶；(b)基本上不含催化醛向酸副产物转化的酶；(c)被工程化以降低或消除催化3-酮酸向3-羟基酸转化的酶的表达或活性；和/或(d)被工程化以降低或消除催囮醛向酸副产物转化的酶的表达或活性在一个实施方案中，3-酮酸为こ酰乳酸在另ー个实施方案中，3-酮酸为
2-こ酰-2-羟基丁酸在一个实施方案中，本发明涉及重组微生物其包含使用3-酮酸(こ酰乳酸)作为中间体的生物合成途径，其中所述重组微生物被工程化以降低或消除催化こ酰乳酸向相应的3-羟基酸(DH2MB)转化的酶的表达或活性在一些实施方案中，催化こ酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)在一个实施方案中，本发奣涉及重组微生物其包含使用3-酮酸(2-こ酰-2-羟基丁酸)作为中间体的生物合成途径，其中所述重组微生物被工程化以降低或消除催化こ酰乳酸姠相应3-羟基酸(2-こ基-23-
ニ羟基丁酸)转化的酶的表达或活性。在一些实施方案中催化2-こ酰-2-羟基丁酸向2-こ基-2，3-
ニ羟基丁酸转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)在一个实施方案中，本发明涉及重组微生物其包含使用醛作为中间体的生物合成途径，其中所述重组微生物被工程化以降低或消除催化醛向酸副产物转化的酶的表达或活性在一些实施方案中，催化醛向酸副产物转化的酶为醛脱氢酶(ALDH)在一个实施方案中，本发明涉及偅组微生物其包含使用3-酮酸和醛两者作为中间体的生物合成途径，其中所述重组微生物(a)被工程化以降低或消除催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化的酶的表达或活性；以及(b)被工程化以降低或消除催化醛中间体向酸副产物转化的酶的表达或活性在一个实施方案中，3-酮酸为こ酰乳酸而3-羟基酸副产物为DH2MB。在另ー个实施方案中3-酮酸为2-こ酰-2-羟基丁酸，而3-羟基酸副产物为2-こ基-23-
ニ羟基丁酸。在一些实施方案中催化こ酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。在一些其它实施方案中催化2-こ酰-2-羟基丁酸向2-こ基-2，3-ニ羟基丁酸转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)在一些其它实施方案中，催化醛向酸副产物转化的酶为醛脱氢酶(ALDH)在另ー些其它实施方案中，催化こ酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)而催化醛姠酸副产物转化的酶为醛脱氢酶(ALDH)。在另ー些其它实施方案中催化2-こ酰-2-羟基丁酸向2-こ基-2，3-
ニ羟基丁酸转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)而催化醛向酸副产物转化的酶为醛脱氢酶(ALDH)。在本文所述的多个实施方案中本发明的重组微生物可包括降低或缺失催化3_酮酸中间体向3-羟基酸副产物转囮中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达。在一个实施方案中催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达被降低至少约50%。在另ー个实施方案中所述催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋皛质的活性或表达与不包括降低或缺失催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化中涉及到的ー种或多种内源性蛋白质的活性或表达的重组微生粅相比，被降低至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%在一个实施方案中，3_酮酸中间体为こ酰乳酸而3-羟基酸副产物为DH2MB。在另ー个实施方案中3-酮酸中间体为2-こ酰-2-羟基丁酸，而3-羟基酸副产物为2-こ基-23-
在本文所述的多个实施方案中，催化3-酮酸中间体向3-羟基酸副产物转化中涉及到的蛋白质为酮还原酶在示例性实施方案中，酮还原酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)在另ー个实施方案中，该蛋白质为短链醇脱氢酶在又一个实施方案中，该蛋白质为中链醇脱氢酶在又一个实施方案中，该蛋白质为醛糖还原酶在又一个實施方案中，该蛋白质为D-轻基酸脱氢酶在又一个实施方案中，该蛋白质为乳酸脱氢酶在又一个实施方案中，该蛋白质选自由下列组成嘚组酿酒酵母(S.
YIL124W和YEL071W基因以及它们的同源物在一个实施方案中，内源性蛋白质为3-酮酸还原酶(3-KAR)在示例性的实施方案中，3-酮酸还原酶为酿酒酵毋YMR226C(SEQ ID NO: I)蛋白质其在本文中可与〃TMA29〃互换使用。在一些实施方案中内源性蛋白质可以为酿酒酵母YMR226C(SEQ IDNO: NO:22)马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces
marxianus) (SEQ ID NO:23)。在一个实施方案中重組微生物在编码3-酮酸还原酶的至少ー个基因中包括突变，从而导致由所述基因编码的多肽的3-酮酸还原酶活性降低在另ー个实施方案中，偅组微生物包括编码3-酮酸还原酶的基因的部分缺失从而导致由所述基因编码的多肽的
3-酮酸还原酶活性降低。在另ー个实施方案中重组微生物包括编码3-酮酸还原酶的基因的完全缺失，从而导致由所述基因编码的多肽的3-酮酸还原酶活性降低在又一个实施方案中，重组微生粅包括与编码3-酮酸还原酶的基因相关的调控区的修饰从而导致由所述基因编码的多肽的表达降低。在又一个实施方案中重组微生物包括转录调控子的修饰，
从而导致编码3-酮酸还原酶的基因的转录降低在又一个实施方案中，重组微生物在编码
3-酮酸还原酶的所有基因中都包括突变从而导致由所述基因编码的多肽的活性降低。在一个实施方案中3-酮酸还原酶活性或表达被降低至少约50%。在另ー个实施方案中3-酮酸还原酶活性或表达与不包括3-酮酸还原酶活性或表达降低的重组微生物相比，被降低至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至尐约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%在一个实施方案中，所述3-酮酸还原酶由酿酒酵母TMA29(YMR226C)基因或其同源物编码在本文所述的多个实施方案中，夲发明的重组微生物可包括降低或缺失催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达在一个实施方案中，催囮醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达被降低至少约50%在另ー个实施方案中，所述催化醛向酸副产物转化Φ涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达与不包括降低或缺失催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性戓表达的重组微生物相比,被降低至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%在本文所述的多个实施方案中，催化醛向酸副产物转化中涉及到的内源性蛋白质为醛脱氢酶(ALDH)在一个实施方案中，醛脱氢酶由选自由下列组成的组的基因编码ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6和HFDl及其同源物和变体在示例性的实施方案中，醛脱氢酶为酿酒酵母ALD6(SEQ
N0:41)在一个实施方案中，重组微生物在编码醛脱氢酶的至少ー个基因中包括突变从而导致由所述基因编码的多肽的醛脱氢酶活性降低。在另ー个实施方案中重组微生物包括编码醛脱氢酶的基因的部汾缺失，从而导致由所述基因编码的多肽的醛脱氢酶活性降低在另ー个实施方案中，重组微生物包括编码醛脱氢酶的基因的全部缺失從而导致由所述基因编码的多肽的醛脱氢酶活性降低。在又一个实施方案中重组微生物包括与编码醛脱氢酶的基因相关的调控区的修饰，从而导致由所述基因编码的多肽的表达降低在又一个实施方案中，重组微生物包括转录调控子的修饰从而导致编码醛脱氢酶的基因嘚转录降低。在又一个实施方案中重组微生物在编码醛脱氢酶的所有基因中都包括突变，从而导致由所述基因编码的多肽的活性降低茬一个实施方案中，醛脱氢酶活性或表达被降低至少约50%在另ー个实施方案中，醛脱氢酶活性或表达与不包括醛脱氢酶活性或表达降低的偅组微生物相比被降低至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%。在一个实施方案中所述醛脱氫酶由酿酒酵母ALD6基因或其同源物编码。在本文所述的多个实施方案中重组微生物可以包括使用3-酮酸作为中间体的生物合成途径。在一个實施方案中3-酮酸中间体为こ酰乳酸。使用こ酰乳酸作为中
间体的生物合成途径可以选自以下物质的生物合成途径异丁醇、2-丁醇、I-丁醇、2-丁酮、23- 丁ニ醇、こ偶姻、ニこ酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-I- 丁醇、4-甲基-1-戊醇和辅酶A。在另ー个实施方案中3-酮酸中间体为2-こ酰-2-羟基丁酸。使用
2-こ酰-2-羟基丁酸作为中间体的生物合成途径可选自以下物质的生物合成途径2_甲基-I- 丁醇、异亮氨酸、3-甲基-I-戊醇、4-甲基-I-己醇囷5-甲基-I-庚醇在本文所述的多个实施方案中，重组微生物可包括使用醛作为中间体的生物合成途径使用醛作为中间体的生物合成途径可鉯选自以下物质的生物合成途径异丁醇、
I-丁醇、2-甲基-I- 丁醇、3-甲基-I- 丁醇、I-丙醇、I-戊醇、I-己醇、3-甲基-I-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇。茬本文所述的多个实施方案中醛中间体可以选自异丁醛、I-丁醛、2-甲基-1-丁醛、3-甲基-1-丁醛、I-丙醛和丙酮、I-戊醛、
I-己酸、3-甲基-I-戍醒、4-甲基-I-戍醒、4-甲基-I-己醒和5-甲基-I-庚酸。在本文所述的多个实施方案中重组微生物可包括使用3-酮酸和醛作为中间体的生物合成途径。在一个实施方案中3-酮酸中间体为こ酰乳酸。使用こ酰乳酸和醛作为中间体的生物合成途径可选自以下物质的生物合成途径异丁醇、I-丁醇和3-甲基-1-丁醇在另ー个实施方案中，3-酮酸中间体为2-こ酰-2-羟基丁酸使用2-こ酰-2-羟基丁酸和醛作为中间体的生物合成途径可选自以下物质的生物合成途径2_甲基-1-丁醇、
3-甲基-I-戊醇、4-甲基-I-己醇和5-甲基-I-庚醇。在一个实施方案中本发明涉及用于产生异丁醇的重组微生物，其中所述重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径并且其中所述微生物被工程化以降低或消除催化こ酰乳酸向DH2MB转化的酶的表达或活性。在一些实施方案中催化こ酰乳酸向DH2MB轉化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。在具体的实施方案中3-酮酸还原酶由酿酒酵母TMA29
(YMR226C)基因或其同源物编码。在另ー个实施方案中本发明涉及用于产生異丁醇的重组微生物，其中所述重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径并且其中所述微生物被工程化以降低或消除催化异丁醛向异丁酸轉化的酶的表达或活性。在一些实施方案中催化异丁醛向异丁酸转化的酶为醛脱氢酶。在具体的实施方案中醛脱氢酶由酿酒酵母ALD6基因戓其同源物编码。
在又一个实施方案中本发明涉及用于产生异丁醇的重组微生物，其中所述重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径并苴其中所述微生物(i)被工程化以降低或消除催化こ酰乳酸向DH2MB转化的酶的表达或活性以及(ii)被工程化以降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化的酶嘚表达或活性。在一些实施方案中催化こ酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶(3-KAR)。在具体的实施方案中3-酮酸还原酶由酿酒酵母TMA29
(YMR226C)基因或其同源粅编码。在一些实施方案中催化异丁醛向异丁酸转化的酶为醛脱氢酶。在具体的实施方案中醛脱氢酶由酿酒酵母ALD6基因或其同源物编码。在一个实施方案中产生异丁醇的代谢途径包括至少ー个催化丙酮酸向异丁醇转化步骤的外源基因。在另ー个实施方案中产生异丁醇嘚代谢途径包括至少两个催化丙酮酸向异丁醇转化步骤的外源基因。在又一个实施方案中产生异丁醇的代谢途径包括至少三个催化丙酮酸向异丁醇转化步骤的外源基因。在又一个实施方案中产生异丁醇的代谢途径包括至少四个催化丙酮酸向异丁醇转化步骤的外源基因。茬又一个实施方案中产生异丁醇的代谢途径包括至少五个催化丙酮酸向异丁醇转化步骤的外源基因。在一个实施方案中异丁醇途径基洇中的一个或多个编码局限于胞质溶胶的酶。在一个实施方案中重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径，其具有至少ー种局限于胞质溶膠的异丁醇途径酶在另ー个实施方案中，重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径其具有至少两种局限于胞质溶胶的异丁醇途径酶。在叒一个实施方案中重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径，其具有至少三种局限于胞质溶胶的异丁醇途径酶在又一个实施方案中，重組微生物包括产生异丁醇的代谢途径其具有至少四种局限于胞质溶胶的异丁醇途径酶。在示例性的实施方案中重组微生物包括产生异丁醇的代谢途径，其具有至少五种局限于胞质溶胶的异丁醇途径酶在本文所述的多个实施方案中，异丁醇途径基因编码选自由下列组成嘚组的酶こ酰乳酸合酶(ALS)、酮醇酸还原异构酶(KARI)、ニ羟酸脱水酶(DHAD)、2_酮酸脱羧酶
(KIVD)和醇脱氢酶(ADH)在另一方面，重组微生物可被工程化以通过降低和/戓消除ー种或多种醇脱氢酶的表达而减少异丁醇向异丁醛的转化在具体的实施方案中，醇脱氢酶由选自由下列组成的组的基因编码ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6和ADH7及其同源物和变体在另一方面，本发明涉及修饰的醇脱氢酶(ADH)其表现出增强的异丁醛向异丁醇转化能力。一般来讲表达这些妀良ADH酶的细胞将在发酵反应过程中产生升高水平的异丁醇。虽然本发明的修饰ADH酶可用于产生异丁醇的发酵反应但是通过本公开，本领域嘚技术人员还将领会这些修饰的ADH酶也可用于产生其它醇的发酵反应，诸如I-丙醇、2-丙醇、I-丁醇、2-丁醇、I-戊醇、2-甲基-1-丁醇和3-甲基-1-丁醇在某些方面，本发明涉及醇脱氢酶(ADH)其被修饰以增强酶将异丁醛转化成异丁醇的能力。此类ADH的实例包括在对应于选自以下的氨基酸的位置具有┅个或多个突变的酶(a)乳酸乳球菌(L.
IDN0:185)第50位的氨基酸包含突变在另ー个实施方案中，修饰的ADH酶在对应于乳酸乳球菌AdhA(SEQID NO: 185)第77位的氨基酸包含突变在叒一个实施方案中，修饰的ADH酶在对应于乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO: 185)第108位的氨基酸包含突变在又一个实施方案中，修饰的ADH酶在对应于乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO:
185)第113位的氨基酸包含突变在又ー个实施方案中，修饰的ADH酶在对应于乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO: 185)第212位的氨基酸包含突变在又一个实施方案中，修饰的ADH酶在对应于乳酸乳球菌AdhA (SEQ ID NO: 185)
第264位的氨基酸包含突变在一个实施方案中，ADH酶在对应于上述位置的氨基酸包含两个或更多个突变在另ー个实施方案中，ADH酶在對应于上述位置的氨基酸包含三个或更多个突变在又ー个实施方案中，ADH酶在对应于上述位置的氨基酸包含四个或更多个突变在又一个實施方案中，ADH酶在对应于上述位置的氨基酸包含五个或更多个突变在又一个实施方案中，ADH酶在对应于上述位置的氨基酸包含六个突变茬ー个具体实施方案中，本发明涉及其中第50位的酪氨酸被苯丙氨酸或色氨酸残基替换的ADH酶在另ー个具体实施方案中，本发明涉及其中第77位的谷氨酰胺被精氨酸或丝氨酸残基替换的ADH酶在另ー个具体实施方案中，本发明涉及其中第108位的缬氨酸被丝氨酸或丙氨酸残基替换的ADH酶在另ー个具体实施方案中，本发明涉及其中第113位的酪氨酸被苯丙氨酸或甘氨酸残基替换的ADH酶在另ー个具体实施方案中，本发明涉及其Φ第212位的异亮氨酸被苏氨酸或缬氨酸残基替换的ADH酶在又ー个具体实施方案中，本发明涉及其中第264位的亮氨酸被缬氨酸残基替换的ADH酶在┅个实施方案中，ADH酶在对应于这些具体实施方案中所述的位置的氨基酸包含两个或更多个突变在另ー个实施方案中，ADH酶在对应于这些具體实施方案中所述的位置的氨基酸包含三个或更多个突变在又一个实施方案中，ADH酶在对应于这些具体实施方案中所述的位置的氨基酸包含四个或更多个突变在又一个实施方案中，ADH酶在对应于这些具体实施方案中所述的位置的氨基酸包含五个或更多个突变在又一个实施方案中，ADH酶在对应于这些具体实施方案中所述的位置的氨基酸包含六个突变在某些示例性实施方案中，ADH酶包含选自以下的序列SEQ
及其同源粅或变体它们与野生型或亲本酶相比包含相应的突变。如前面的段落中所提及除了乳酸乳球菌AdhA(SEQ ID NO: 185)夕卜，包含与上述那些相对应的改变的ADH酶也包括在本发明的范围内此类ADH酶可以包括但不限于在表97中列出的ADH酶。在一些实施方案中待修饰的ADH酶为NADH依赖性ADH酶。此类NADH依赖性ADH酶的实唎在共同拥有和共同未决的美国专利公开No.
中有所描述该专利公开全文以引用方式并入本文以用于所有目的。在一些实施方案中对最初編码利用NADPH的ADH酶的基因进行修饰，以将该酶的辅因子偏好切換到NADH
如本文所述，修饰的ADH与野生型或亲本ADH相比将通常表现出增强的将异丁醛转囮成异丁醇的能力优选地，修饰的ADH酶的催化效率(keat/KM)与野生型或亲本ADH相比增强至少约5%更优选地，修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约15%更优选地，修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约25%更优选地，修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强臸少约50%更优选地，修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约75%更优选地，修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少約100%更优选地，修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约200%更优选地，修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约500%哽优选地，修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约1000%更优选地，修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约2000%更优選地，修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约3000%最优选地，修饰的ADH酶的催化效率与野生型或亲本ADH相比增强至少约3500%在另外的方面，本发明涉及修饰的ADH酶其已进行了密码子优化，以在某些期望的宿主生物诸如酵母和大肠杆菌(E.coli)中表达在其它方面，本发明涉及包含本发明
的修饰ADH酶的重组宿主细胞根据该方面，本发明还涉及在任何发酵过程中使用修饰的ADH酶的方法在这些发酵过程中期望将异丁醛轉化成异丁醇。在根据该方面的一个实施方案中修饰的ADH酶可适于增强宿主细胞产生异丁醇的能力。在根据该方面的另ー个实施方案中修饰的ADH酶可适于增强宿主细胞产I-丙醇、2-丙醇、I- 丁醇、2- 丁醇、I-戊醇、
丁醇的能力。在本文所述的多个实施方案中包含修饰的ADH的重组微生物還可被进ー步工程化以表达产生异丁醇的代谢途径。在一个实施方案中重组微生物可被工程化以表达包含至少ー个外源基因的产生异丁醇的代谢途径。在一个实施方案中重组微生物可被工程化以表达包含至少两个外源基因的产生异丁醇的代谢途径。在另ー个实施方案中重组微生物可被工程化以表达包含至少三个外源基因的产生异丁醇的代谢途径。在另ー个实施方案中重组微生物可被工程化以表达包含至少四个外源基因的产生异丁醇的代谢途径。在另一个实施方案中重组微生物可被工程化以表达包含五个外源基因的产生异丁醇的代謝途径。因此本发明还提供包含产生异丁醇代谢途径的重组微生物以及使用所述重组微生物产生异丁醇的方法。在本文所述的多个实施方案中异丁醇途径酶选自こ酰乳酸合酶(ALS)、酮醇酸还原异构酶(KARI)、ニ羟酸脱水酶(DHAD)、2-酮酸脱羧酶(KIVD)和醇脱氢酶(ADH)。在本文所述的多个实施方案中異丁醇途径酶可衍生自原核生物。在本文所述的可供选择的实施方案中异丁醇途径酶可衍生自真核生物。将丙酮酸转化成异丁醇的示例性代谢途径可由以下部分组成こ酰醇酸合酶(ALS)例如由枯草芽孢杆菌(B.
subtilis)的alsS编码；酮醇酸还原异构酶(KARI)，例如由大肠杆菌的IlvC编码;ニ羟酸脱水酶(DHAD)例洳由乳酸乳球菌的ilvD编码；2_酮酸脱羧酶(KIVD)，例如由乳酸乳球菌的kivD编码；以及醇脱氢酶(ADH)(如本文所述的修饰的ADH)例如由乳酸乳球菌的adhA编码，如本文所述其在Y50、Q77、V108、Y113、1212和L264位具有ー个或多个突变。在本文所述的多个实施方案中重组微生物可以是酵母属进化枝的微生物、Saccharomyces
sensu stricto 微生物、Crabtree-阴性酵母微生物、Crabtree-阳性酵母微生物、后-WGD (全基因组倍増)酵母微生物、前-WGD (全基因组倍増)酵母微生物以及非发酵酵母微生物。在一些实施方案中重組微生物可以为酵母属进化枝的酵母重组微生物。在一些实施方案中重组微生物可以为Saccharomyces sensu
carocanis及其杂交体。0047在一些实施方案中重组微生物可鉯为Crabtree-阴性重组酵母微生物。在一个实施方案中将Crabtree-阴性酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属酵母属(Saccharomyces)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、汉逊酵母属(Hansenula)或假丝酵母属(Candida)。在另外的实施方案中Crabtree-阴性酵母微生物选自可鲁弗酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、異常
utilis)和克鲁雄酵母。在一些实施方案中重组微生物可以是Crabtree-阳性重组酵母微生物。在一个实施方案中将Crabtree-阳性酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属酵母属、克鲁维酵母属、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、假丝酵母属、毕赤酵母属和裂埴酵母属(Schizosaccharomyces)。在另外的实施方案中Crabtree-阳性酵母微生物选自由下列组成的组啤酒酵母、葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)、贝酵母、奇异酵母(Saccharomyces
paradoxus)、芽埴酵母、耐热克鲁维酵母、光滑假丝酵母、拜耳接合酵毋(Z. bailli)、鲁氏接合酵母、汉逊德巴利酵母、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastorius)、粟酒裂埴酵母和葡萄汁酵母。在一些实施方案中重组微生物可以是后-WGD
(全基因组倍増)酵母重组微生物。在一个实施方案中将后-WGD酵母重组微生物归类为选自由下列组成的组的属酵母属或假丝酵母属。在另外的实施方案Φ后-WGD酵母选自由下列组成的组啤酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、芽殖酵母和光滑假丝酵母。在一些实施方案中重组微生物鈳以为前-WGD
(全基因组倍増)酵母重组微生物。在一个实施方案中将前-WGD酵母重组微生物归类为选自由下列组成的组的属酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、伊萨酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、管囊酵母属(Pachysolen)、耶氏酵母属和裂埴酵母属。在另外的实施方案中湔-WGD酵母选自由下列组成的组可鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、克鲁雄酵母、乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母(Candida
tropicalis)、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、东方伊萨酵母、西方伊萨酵母(Issatchenkia occidentalis)、汉逊德巴利酵母、异常汉逊酵母、嗜鞋管囊酵母(Pachysolen
tannophilis)、解脂耶氏酵母囷粟酒裂埴酵母。在一些实施方案中重组微生物可以为属于非发酵酵母微生物的微生物，包括但不限于归类为选自由下列组成的组的属嘚那些丝孢酵母属(Tricosporon)、红酵母属(Rhodotorula)、Myxozyma或假丝酵母属在具体的实施方案中，非发酵酵母为
し.xestobiio在另一方面本发明提供使用如本文所述的重组微苼物产生有益代谢产物(包括燃料、化学品和氨基酸)的方法。在一个实施方案中该方法包括在含有提供碳源的原料的培养基中培养重组微苼物直到产生可回收量的代谢产物，以及任选地回收所述代谢产物在一个实施方案中，该微生物以至少约5%的理论得率由碳源产生代谢产粅在另ー个实施方案中，该微生物以至少约10%、至少约15%、至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约97.
5%的理论得率产生代谢产物在一个实施方案中，该代谢产物可以衍生自使用3-酮酸作为中间体的生物合成途径在一个实施方案中，3-酮酸中间体为こ酰乳酸因此，该代谢产物可以衍生自使用こ酰乳酸作為中间体的生物合成途径包括但不限于异丁醇、2-丁醇、I-丁醇、2-丁酮、2，3-丁ニ醇、こ偶姻、ニこ酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-1-丁醇、4-甲基-I-戊醇和辅酶A生物合成途径在另ー个实施方案中，3-酮酸中间体为2-こ酰-2-羟基丁酸因此，该代谢产物可以衍生自使用2-こ酰-2-羟基丁酸作为中间体的生物合成途径包括但不限于2-甲基-I-
丁醇、异亮氨酸、3-甲基-I-戊醇、4-甲基-I-己醇和5-甲基-1-庚醇生物合成途径。在另ー个实施方案Φ该代谢产物可以衍生自使用醛作为中间体的生物合成途径，包括但不限于异丁醇、I-丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇、I-丙
醇、I-戊醇、I-己醇、3-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-1-己醇和5-甲基-1-庚醇生物合成途径在又一个实施方案中，该代谢产物可以衍生自使用こ酰乳酸和醛作为中间体的苼物合成途径包括但不限于异丁醇、I-丁醇和3-甲基-1-丁醇生物合成途径。在又一个实施方案中该代谢产物可以衍生自使用2-こ酰-2-羟基丁酸和醛作为中间体的生物合成途径，包括但不限于2-甲基-I-
丁醇、3-甲基-I-戊醇、4-甲基-I-己醇和5-甲基-1-庚醇生物合成途径在一个实施方案中，重组微生物茬有氧条件下生长在另ー个实施方案中，重组微生物在微氧条件下生长在又一个实施方案中，重组微生物在厌氧条件下生长附图简述本发明的说明性性实施方案以附图示出，其中图I示出了异丁醇途径的示例性实施方案图2示出了能够由3-酮酸还原酶催化的示例性反应。圖3示出了示例性3-酮酸还原酶及其相应的酶分类号的非限制性列表图4示出了能够由醛脱氢酶催化的示例性反应。图5示出了在产生异丁醇的偅组微生物中减少DH2MB和异丁酸产生的策略图6示出了在产生3-甲基-I-
丁醇的重组微生物中减少DH2MB和3_甲基_1_ 丁酸产生的策略。图7示出了在产生2-甲基-I- 丁醇嘚重组微生物中减少2-こ基-23_ ニ羟基丁酸和2-甲基-I- 丁酸产生的策略。图8示出了
LC4色谱图的叠加显示了含DH2MB和こ酸的样品(上图)以及含こ酸和DHIV的样品(丅图)。洗脱顺序DH2MB然后是こ酸(上图)；乳酸、こ酸、DHIV、异丁酸、丙酮酸(下图)图9示出了样品馏分的色谱图，该馏分在对应于通过LCl收集的DHIV的保留時间收集并在使用电导率检测的AS-Il色谱柱上通过LC4分析。
图10示出了通过LCl分离的峰的1H-C0SY光谱该光谱表明0. 95ppm的DH2MB甲基质子(双峰)偶合到3. 7ppm的次甲基质子(四偅峰)。图11示出了通过LCl分离的峰的IH-NMR光谱该光谱表明存在DH2MB :1. 2ppm的甲基质子(a)单峰(积分值为3),0. 95ppm的甲基质子(b)双峰(积分值为3)以及3. 7ppm的次甲基质子(c)四重峰(积分值為I.
84)。次甲基质子(c)的积分值由于在同一区域中与葡萄糖共振重叠而大于I图12示出了通过LCl分离的峰的LC-MS分析。在该样品中鉴定出多个分子离子洳图的顶部所示。134分子离子的进ー步碎裂(MS2)表明分离的LCl馏分含有通过CO2W和H2CHCO2 (**)的特征性丢失产生的羟基羧酸。图13示出了 23-ニ羟基-2-甲基丁酸的非对映和对映体结构(2R，3S)_la、(2S,
3H)图15示出了结晶DH2MB在D2O中的13C光谱光谱表明存在五个不同的碳共振，其中ー个为18Ippm的特征性羧酸共振图16示出了通过GEV03160的単式发酵产生的异丁醇及副产物的发酵变化曲线。生产曝气从0. 8mM/h的OTR降低到接种后93h的0.
3mM/h空心菱形=iBuOH，方形=未知定量为DH2MB星号=细胞干重(cdw)以及实心三角形=总副产物。图17示出了乳酸乳球菌AdhA氨基酸序列与嗜热脂肪土芽孢杆菌(G.
stearothermophiIus)结构的结构比对(Pymol)示出了活性位点突变(Y50F和L264V)。还示出了辅助因子结合结构域Φ的突变(I212T和N219Y)图18示出了利用こ酰乳酸作为中间体的生物合成途径。生产I-丁醇、异丁醇、
3-甲基-I- 丁醇和4-甲基-I-戊醇的生物合成途径使用こ酰乳酸囷醛两者作为中间体图19示出了利用2-こ酰-2-羟基丁酸作为中间体的生物合成途径。生产2-甲基-I- 丁醇、3-甲基-I-戊醇、4-甲基-I-己醇和5-甲基-I-庚醇的生物合荿途径使用
2-こ酰-2-羟基丁酸和醛两者作为中间体图20示出了利用醛作为中间体的另外的生物合成途径。发明详述除非上下文另有明确表示否则如本文和所附权利要求书中所用，単数形式“一个”、“ー种”和“该”包括多个指代物因此，例如提及“一种多核苷酸”包括哆种此类多核苷酸，而提及“该微生物”包括提及ー种或多种微生物等等除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义尽管与本文描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料也可用于所公开的方法和组合物的实践，但是本文描述了示例性的方法、装置和材料上文以及全文中讨论的任何出版物仅是为了它们在本申请提交日期之湔的公开内容而提供的。都不应解释为发明人由于在先公开的内容而承认本文的内客不能置于这些内容之前术语“微生物”包括来自古細菌域、细菌域和真核域的原核和真核微生物种，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或高等原生生物术语“微生物细胞(microbialcell)”和“微菌(microbe)
org/])定义为相关种的分类群。术语“种”定义为密切相关的生物体的集合其具有大于97%的16S核糖体RNA序列同源性和大于70%的基因组杂交，并且与所有其它生物体有充分的区别从而被认为是不同的单位术语“重组微生物”、“修饰微生物”和“重组宿主细胞”在本文可互換使用井指代如下的微生物，所述微生物经遗传修饰以表达或过表达内源多核苷酸、或表达异源性多核苷酸(诸如包含在载体中、整合构建体中的那些)、或在内源基因的表达上有改变所谓“改
变”是指基因的表达、或RNA分子水平或编码ー种或多种多肽或多肽亚单位的等效RNA分子水平、或┅种或多种多肽或多肽亚单位的活性被上调或下调，使得表达、水平或活性大于或小于在没有该变化时所观察到的例如，术语“改变”鈳以表示“抑制”但是词语“改变”的用途并不限于此定义。关于基因序列的术语“表达”是指该基因的转录以及在适当时，将所得嘚mRNA转录物翻译成蛋白质因此，从上下文中将会明确蛋白质的表达是由开放阅读框序列的转录和翻译产生的。宿主细胞中所需产物的表達水平可基于细胞中存在的相应mRNA的量或由所选序列编码的所需产物的量来决定例如，从所选序列转录的mRNA可以由PCR或Northern
(1989))由所选序列编码的蛋皛质可以通过多种方法定量，例如通过ELISA，通过测定蛋白质的生物活性或通过采用不依赖这种活性的測定法，诸如Western印迹或放射性免疫測萣其使用识别蛋白质并与蛋白质结合的抗体。參见Sambrook等1989
(见上文)。多核苷酸通常编码在产生所需代谢产物的代谢途径中涉及到的靶酶应當理解，术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”不仅仅指具体的重组微生物还指这种微生物的子代或潜在子代。由于某些修饰可能因為突变或环境影响而在后代中发生所以事实上这些子代可能与亲本细胞不同，但是其仍然包含在如本文所用的术语的范围之内术语“過表达”是指与类似的相应表达基础水平mRNA
(如编码Aft蛋白质的那些)或具有基础蛋白质水平的未修饰细胞相比，细胞中编码蛋白质(如TMA29蛋白质或其哃源物)的mRNA水平升高(如水平异常)和/或蛋白质(如TMA29)水平升高在特定实施方案中，在工程化以表现出增加的TMA29mRNA、蛋白质和/或活性的微生物中TMA29或其哃源物可过表达至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、12倍、15倍或更多倍。如本文所用以及如本领域的普通技术人员将会理解蛋白质(诸如酶)“降低的活性和/或表达”可以表示细胞中降低的蛋白质比催化活性(如降低的活性)和/或降低的蛋白质浓度(如降低的表达)，而蛋白质(诸如酶)“缺失的活性和/或表达”或“消除的活性和/或表达”可以表示细胞中酶的比催化活性为零或可以忽略(如缺失的活性)和/或酶浓度为零或可以忽畧(例如缺失的表达)术语“野生型微生物”描述出现在自然界中的细胞，S卩未经遗传修饰的细胞。野生型微生物可以被遗传修饰以表达戓过表达第一目标酶此微生物可以在经修饰而表达或过表达第二目标酶的微生物的产生中充当亲本微生物。依次类推可以修饰经修饰鉯表达或过表达第一和第二目标酶的微生物以使其表达或过表达第三目标酶。因此“亲本微生物”起到连续遗传修饰事件的參照细胞的莋用。毎次修饰事件都可以通过将核酸分子引入參照细胞来完成这种引入促进目标酶的表达或过表达。应当理解术语“促迸”涵盖通過对亲本微生物中的例如启动子序列进行遗传修饰而活化编码目标酶的内源多核苷酸。还应理解的是术语“促进”涵盖向亲本微生物中引叺编码目标酶的异源多核苷酸术语“工程化”是指导致微生物中出现可检测变化的对微生物的任何操纵，其中所述操纵包括但不限于插叺对于所述微生物是异源的多核苷酸和/或多肽以及突变对于所述微生物是天然的多核苷酸和/或多肽
如本文所用的术语“突变”表示对核酸和/或多肽的任何修饰，其导致核酸或多肽改变突变包括(例如)多核苷酸中的点突变、缺失或单个或多个残基的插入，其包括出现在基因嘚蛋白质编码区内的改变以及在蛋白质编码序列以外区域(诸如但不限于调控或启动子序列)中的改变遗传改变可以是任何类型的突变。例洳突变可以构成点突变、移码突变、无义突变、插入或部分或全部基因的缺失。此外在一些修饰的微生物的实施方案中，微生物基因組的一部分已经被异源多核苷酸替换在一些实施方案中，突变是天然发生的在其它实施方案中，突变通过人工选择压力而鉴定和/或富集在其它实施方案中，微生物基因组中的突变是遗传工程的結果术语“生物合成途径”，也称为“代谢途径”是指为了将ー种化学粅质转化为另ー种化学物质的ー组合成代谢的或分解代谢的生化反应。如果基因产物平行或连续地作用于相同的底物、产生相同的产物、戓作用于或产生在相同底物和代谢终产物之间的代谢中间体(即代谢产物)那么它们属于相同的“代谢途径”。如本文所用术语“产生异丁醇的代谢途径”是指由丙酮酸产生异丁醇的酶途径。如本文所用的关于分子并且特别是酶和多核苷酸的术语“异源”表示分子在生物体Φ表达该生物体不同于该分子所起源的生物体或在自然界中存在该分子的生物体，而与表达水平无关表达水平可低于、等于或高于该汾子在天然微生物中的表达水平。另ー方面如本文所用的关于分子并且特别是酶和多核苷酸的术语“天然”或“内源”表示该分子在生粅体中表达，该生物体是该分子所起源的生物体或在自然界中存在该分子的生物体而与表达水平无关，表达水平可低于、等于或高于该汾子在天然微生物中的表达水平应当理解，在重组微生物中可以修饰天然酶或多核苷酸的表达术语“原料”定义为提供给微生物或能夠产生其它产物的发酵过程的原材料或原材料的混合物。例如碳源(诸如生物质或由生物质衍生的碳化合物)是供在发酵过程中产生生物燃料的微生物用的原料。然而原料可以含有碳源之外的营养物。术语“底物”或“合适的底物”是指通过酶的作用转化或要转化为另ー种囮合物的任何物质或化合物该术语不仅包括单ー的化合物，还包括化合物的组合诸如含有至少ー种底物或其衍生物的溶液、混合物以忣其它材料。此外术语“底物”不仅涵盖提供适宜作为起始材料使用的碳源的化合物，诸如任何生物质衍生的糖还包括如本文描述的茬与重组微生物相关的途径中使用的中间体和终产物代谢产物。所用术语“C2-化合物”是指包含两个碳原子的有机化合物包括但不限于こ醇和こ酸盐/酷，该“C2-化合物”用作碳源供工程化酵母微生物用所述酵母微生物在所有丙酮酸脱羧酶(roc)基因中带有突变，导致所述基因的丙酮酸脱羧酶活性降低术语“发酵”或“发酵过程”定义为这样的过程，其中在包含原材料(诸如原料和营养物)的培养基中培养微生物其Φ所述微生物将原材料(诸如原料)转化为产物。术语“容积生产率”或“生产速率”定义为每单位时间每体积培养基形成的产物的量容积苼产率以克每升每小时(g/L/h)记录。术语“比生产率”或“比生产速率”定义为每一定量的细胞每単位时间每体积培养基形成的产物量比生产率以克或毫克每升每小时每0D(g/L/h/0D)记录。
术语“得率”定义为每单位重量的原材料获得的产物的量并可以表示为克产物每克底物(g/g)得率可以表示為理论得率的百分比。“理论得率”定义为可由给定量底物产生的产物的最大量如通过用于产生产物的代谢途径的化学计量学所指定。唎如葡萄糖向异丁醇的ー种典型转化的理论得率为0. 41g/g。照这样0.
39g/g的由葡萄糖到异丁醇的得率可以表示为理论值的95%或95%理论得率。术语“滴度”定义为溶液的浓度或溶液中物质的浓度例如，发酵液中生物燃料的滴度描述为每升发酵液中的溶液中生物燃料的克数(g/L)“有氧条件”萣义为发酵培养基中的氧浓度对于需氧或兼性厌氧微生物而言足以用作末端电子受体的条件。相反“厌氧条件”定义为发酵培养基中的氧浓度对于微生物而言太低而不能用作末端电子受体的条件。厌氧条件可以通过将惰性气体(诸如氮气)鼓入发酵培养基直到氧不再能够用作微生物的末端电子受体来实现作为另外一种选择，厌氧条件可以通过微生物消耗发酵中的可用氧直至氧不能用作微生物的末端电子受体來实现在厌氧条件下产生异丁醇的方法描述于共同拥有和共同未决的专利公开US
中，其公开内容全文以引用方式并入本文以用于所有目的“有氧代谢”是指如下生化过程，其中氧被用作末端电子受体以由碳水化合物产生能量通常以ATP的形式。例如通过糖酵解和TCA循环发生有氧代谢其中在氧的存在下，将单个葡萄糖分子完全代谢为ニ氧化碳相反，“厌氧代谢”是指其中氧不是NADH中所含电子的最终受体的生化過程厌氧代谢可以分为厌氧呼吸，其中不同于氧的化合物被用作末端电子受体；和底物水平磷酸化其中利用来自NADH的电子以通过“发酵性途径”产生还原产物。在“发酵性途径”中NAD⑵H将其电子贡献给通过产生NAD⑵H上携帯的电子的同一代谢途径所产生的分子。例如在某些酵母菌株的发酵性途径之一中，通过糖酵解产生的NAD(P)H将其电子传递给丙酮酸从而产生こ醇。发酵性途径通常在厌氧条件下有活性但是也鈳以发生在有氧条件下、在NADH未通过呼吸链完全氧化的条件下。例如高于某些葡萄糖浓度吋，Crabtree-阳性酵母在有氧条件下产生大量こ醇术语“副产物(byproduct)
”或“副产物(byproduct) ”是指与氨基酸、氨基酸前体、化学品、化学品前体、生物燃料或生物燃料前体的产生相关的非期望的产物。
术语“基本上不含”当关于与所需代谢途径(例如产生异丁醇的代谢途径)竞争的碳途径中的酶活性(3-KAR、ALDH、PDC,
GPD等)的存在与否使用吋，是指酶的水平基夲上低于野生型宿主中相同酶的水平其中低于野生型水平的约50%是优选的，而低于约30%是更优选的活性可以低于野生型活性的约20%、低于约10%、低于约5%或低于约1%。“基本上不含”特定酶活性(3-KAR、ALDH、PDC,
GPD等)的微生物可以通过重组方法构建或在自然界中鉴定术语“非发酵酵母”是ー种酵毋物种，其不能展示出其中利用来自NADH的电子经由发酵性途径产生还原产物(诸如由葡萄糖产生こ醇和CO2)的厌氧代谢非发酵酵母可以通过“德拉姆管检测” (J. A. Barnett, R. ff. Payne, and D. Yarrow. 2000. YeastsCharacteristics and
UK)或通过监测发酵产物(诸如こ醇和CO2)的产生来鉴定。术语“多核苷酸”在本文中可与术语“核酸”互換使用并且是指由两种或哽多种単体(包括核苷酸、核苷或其类似物)组成的有机聚合物，包括但不限于任意长度的单链或双链、有义或反义脱氧核糖核酸(DNA)以及在适當时，任意长度的单链或双链、有义或反义
核糖核酸(RNA),包括siRNA术语“核苷酸”是指由结合到嘌呤或嘧啶碱基并结合到磷酸基团的核糖或脱氧核糖组成的多种化合物的任ー种，并且它们是核酸的基本结构单元术语“核苷”是指由与脱氧核糖或核糖组合的嘌呤或嘧啶碱基组成的囮合物(如鸟苷或腺苷)，并且其特别存在于核酸中术语“核苷酸类似物”或“核苷类似物”分别是指这样的核苷酸或核苷，其中一个或多個单独的原子被不同原子或不同的官能团替换因此，术语“多核苷酸”包括任意长度的核酸、DNA、RNA、其类似物和片段三个或更多个核苷酸的多核苷酸也称为核苷酸寡聚物或寡核苷酸。应当理解本文描述的多核苷酸包括“基因”，并且本文描述的核酸分子包括“载体”或“质粒”因此，术语“基因”也称为“结构基因”，是指编码特定氨基酸序列的多核苷酸其包合一种或多种蛋白质或酶的全部或部汾，并且可以包括调节性(非转录的)DNA序列诸如启动子序列，其确定例如在何种条件下表达基因基因的转录区可以包括非翻译区(包括内含孓、5’
-UTR)以及编码序列。术语“操纵子”是指由共同的启动子作为单ー转录单元而转录的两种或更多种基因在一些实施方案中，构成操纵孓的基因是相邻的基因应当理解，可以通过修饰该共同的启动子而改变整个操纵子的转录(即増加、減少或消除)。作为另外一种选择鈳以修饰操纵子中的任何基因或基因的组合以改变所编码的多肽的功能或活性。修饰可导致编码多肽的活性提高进ー步地，修饰可以赋予编码的多肽新的活性示例性的新活性包括可选底物的应用和/或在可选环境条件中发挥作用的能力。“载体”是任何如下的手段即可鉯通过该手段使核酸在生物体、细胞或细胞组分之间增殖和/或转移。载体包括病毒、噬菌体、原病毒、质粒、噬菌粒、转座子和人工染色體诸如YAC
(酵母人工染色体)、BAC (细菌人工染色体)和PLAC (植物人工染色体)等这些是“附加体(episome)
”，也就是说其自主地复制或者可整合到寤主细胞的染銫体内。载体也可以是裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在同一链内由DNA和RNA两者组成的多核苷酸、多聚赖氨酸缀合的DNA或RNA、多肽缀合的DNA或RNA、脂质体缀匼的DNA等它们本质上不是附加体，或者载体可以是包含ー种或多种上述多核苷酸构建体的生物体诸如土壤杆菌或细菌。“转化”是指将載体弓I入宿主细胞的过程转化(或转导、或转染)可以通过包括化学转化(例如こ酸锂转化)、电穿孔、显微注射、基因枪(或粒子轰击介导的传遞)或土壤杆菌介导的转化在内的许多方法中的任ー种来完成。如本文所用的术语“酶”是指催化或促进ー种或多种化学或生化反应的任何粅质其通常包括全部或部分由多肽组成的酶，但是可以包括由不同分子(包括多核苷酸)组成的酶如本文所用的术语“蛋白质”、“肽”戓“多肽”表示由两种或更多种氨基酸単体和/或其类似物组成的有机聚合物。如本文所用术语“氨基酸”或“氨基酸単体”是指包括甘氨酸和D或L光学异构体在内的任何天然和/或合成氨基酸。术语“氨基酸类似物”是指一个和多个单独的原子被不同的原子或不同的官能团替換的氨基酸因此，术语多肽包括任意长度的氨基酸聚合物其包括全长蛋白质和肽以及其类似物和片段。三个或更多个氨
基酸的多肽也稱为蛋白质寡聚物或寡肽关于第一家族或种的原始酶或基因的术语“同源物”是指第二家族或种的不同的酶或基因，其是通过功能、结構或基因组分析来确定的对应于第一家族或种的原始酶或基因的第二家族或种的酶或基因最通常的情况是，同源物将具有功能、结构或基因组相似性使用基因探针和PCR可以容易地克隆酶或基因的同源物的技术是已知的。克隆的序列作为同源物的身份(identity)可以使用功能測定法和/戓通过对基因的基因组作图来确认如果由某一基因编码的氨基酸序列与第二基因的氨基酸序列具有相似的氨基酸序列，则该蛋白质与第②蛋白质具有“同源性”或与第二蛋白质是“同源的”作为另外ー种选择，如果某ー蛋白质与第二蛋白质具有“相似的”氨基酸序列則两种蛋白质具有同源性。(因此将术语“同源蛋白质”定义为是指两种蛋白质具有相似的氨基酸序列)。术语“类似物”或“类似的”是指仅在功能上彼此相关但不来自共同的谱系或不共有共同祖先序列的核酸或蛋白质序列或蛋白质结构由于趋同进化，类似物在序列上可鉯不同但是可以共有相似的结构例如，如果两种酶催化相同的底物转化为产物的反应、两种酶在序列上无关、且不论两种酶在结构上是否相关那么这两种酶是类似物或者是类似的。具有减少的副产物蓄积的重组微牛物酵母细胞转化糖以产生丙酮酸其随后在多种细胞代謝途径中被利用。近年来已将酵母细胞工程化，以通过丙酮酸驱动的生物合成途径产生多种所需的产物在其中许多生物合成途径中，初始途径步骤是将内源性丙酮酸转化为3-酮酸如本文所用，“3-酮酸”是指在Cl碳上包含羧酸部分以及在C3碳上包含酮部分的有机化合物例如，こ酰乳酸和2-羟基-2-甲基-3-氧代丁酸是在C3碳上具有酮基团的3_酮酸(參见例如图2)。许多生物合成途径常见的3-酮酸的实例为こ酰乳酸其由丙酮酸通过こ酰乳酸合酶(也称为こ酰羟酸合酶)的作用而形成。在使用こ酰乳酸作为中间体的生物合成途径中包括产生异丁醇、2-丁醇、I-丁醇、2-丁酮、2，3-丁ニ醇、こ偶姻、ニこ酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-1-丁醇、4-甲基-1-戊醇和辅酶A的途径合成这些有益的こ酰乳酸衍生的玳谢产物的工程化生物合成途径见表I和图18。
表I.利用こ酰乳酸作为中间体的生物合成途径
权利要求 1.一种包含使用3-酮酸作为中间体的生物合成途径的重组微生物其中所述重组微生物被工程化以降低或消除催化所述3-酮酸向3-羟基酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性。
2.根据权利要求I所述的重组微生物其中所述3-酮酸中间体为乙酰乳酸并且所述3-羟基酸副产物为2，3- 二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)
3.根据权利要求2所述的重组微生物，其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约50%
4.根据权利要求2所述的重组微生物，其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或哆种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约75%
5.根据权利要求2所述的重组微生物，其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约95%
6.根据权利要求2所述的微生物，其中所述偅组微生物产生乙酰乳酸衍生的产物
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其中所述乙酰乳酸衍生的产物选自异丁醇、2-丁醇、I-丁醇、2-丁酮、23-丁二醇、乙偶姻、二乙酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-I- 丁醇、4-甲基-I-戊醇和辅酶A。
8.根据权利要求I所述的重组微生物其中所述3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸并且所述3-羟基酸副产物为2-乙基-2，3- 二羟基丁酸
9.根据权利要求8所述的重组微生物，其中来自2-乙酰-2-羟基丁酸的所述2-乙基-23-二羟基丁酸碳得率与不包括降低或消除催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2，3- 二羟基丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微苼物相比被降低至少约50%
10.根据权利要求8所述的重组微生物，其中来自2-乙酰-2-羟基丁酸的所述2-乙基-23-二羟基丁酸碳得率与不包括降低或消除催囮2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2，3- 二羟基丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约75%
11.根据权利要求8所述的重組微生物，其中来自2-乙酰-2-羟基丁酸的所述2-乙基-23-二羟基丁酸碳得率与不包括降低或消除催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2，3- 二羟基丁酸转化中涉及箌的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约95%
12.根据权利要求8所述的重组微生物，其中所述重组微生物产生2-乙酰-2-羟基丁酸衍生的产物
13.根据权利要求12所述的重组微生物，其中所述2-乙酰-2-羟基丁酸衍生的产物选自2-甲基-I- 丁醇、异亮氨酸、3-甲基-I-戍醇、4-甲基-I-己醇和5-甲基-I-庚醇
14.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述催化3-酮酸向3-羟基酸副产物转化的酶为3-酮酸还原酶
17.—种包含使用醛作为Φ间体的生物合成途径的重组微生物，其中所述重组微生物被工程化以降低或消除催化所述醛向酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性
18.根据权利17所述的重组微生物，其中来自所述醛中间体的所述酸副产物碳得率与不包括降低或消除催化醛向酸副产物转化中涉及到的一種或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少35%
19.根据权利17所述的重组微生物，其中来自所述醛中间体的所述酸副产物碳得率与不包括降低或消除催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少75%
20.根据权利17所述的重组微生物，其中来自所述醛中间体的所述酸副产物碳得率与不包括降低或消除催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少95%
21.根据权利要求17所述的重组微生物，其中所述使用醛作为中间体的生物合成途径选自以下物质的生物合成途径异丁醇、I- 丁醇、2-甲基-I- 丁醇、3-甲基-I- 丁醇、I-丙醇、I-戊醇、I-己醇、3-甲基-I-戊醇、4-甲基-I-戊醇、4-甲基-I-己醇和5-甲基-I-庚醇
22.根据权利要求17-21中任一项所述的重组微苼物，其中所述催化醛向酸副产物转化的酶为醛脱氢酶
23.根据权利要求22所述的重组微生物，其中所述醛脱氢酶为酿酒酵母ALD6(SEQ IDNO:25)或其同源物或变體
25.—种包含使用3-酮酸和醛作为中间体的生物合成途径的重组微生物，其中所述重组微生物 (i)被工程化以降低或消除催化所述3-酮酸向3-羟基酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性；以及 ( )被工程化以降低或消除催化所述醛向酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性
26.根据权利要求25所述的重组微生物，其中所述3-酮酸中间体为乙酰乳酸并且所述3-羟基酸副产物为23- 二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)。
27.根据权利要求26所述的重组微生物其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约50%。
28.根据权利要求26所述的重组微生物其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或哆种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约75%。
29.根据权利要求26所述的重组微生物其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约95%。
30.根据权利要求26所述的微生物其中所述偅组微生物产生乙酰乳酸衍生的产物。
31.根据权利要求30所述的重组微生物其中所述乙酰乳酸衍生的产物选自异丁醇、1-丁醇和3-甲基-I- 丁醇。
32.根據权利要求25所述的重组微生物其中所述3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸并且所述3-羟基酸副产物为2-乙基-2，3- 二羟基丁酸
33.根据权利要求32所述的重組微生物，其中来自2-乙酰-2-羟基丁酸的所述2-乙基-23-二羟基丁酸碳得率与不包括降低或消除催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2，3- 二羟基丁酸转化中涉及箌的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约50%
34.根据权利要求32所述的重组微生物，其中来自2-乙酰-2-羟基丁酸的所述2-乙基-23- ②羟基丁酸碳得率与不包括降低或消除催化2-乙酰-2-羟基丁酸向2-乙基-2，3- 二羟基丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相仳被降低至少约75%
35.根据权利要求32所述的重组微生物，其中来自2-乙酰-2-羟基丁酸的所述2-乙基-23-二羟基丁酸碳得率与不包括降低或消除催化2-乙酰-2-羥基丁酸向2-乙基-2，3- 二羟基丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约95%
36.根据权利要求32所述的重组微生粅，其中所述重组微生物产生2-乙酰-2-羟基丁酸衍生的产物
37.根据权利要求36所述的重组微生物，其中所述2-乙酰-2-羟基丁酸衍生的产物选自2-甲基-I- 丁醇、3-甲基-I-戊醇、4-甲基-I-己醇和5-甲基-I-庚醇
38.根据权利要求25-37中任一项所述的重组微生物，其中所述催化3-酮酸向3-羟基酸副产物转化的酶为3-酮酸还原酶
39.根据权利要求38所述的重组微生物，其中所述3-酮酸还原酶为酿酒酵母YMR226 (SEQ ID NO: I)或其同源物或变体
41.根据权利要求25-40中任一项所述的重组微生物，其Φ来自所述醛中间体的所述酸副产物碳得率与不包括降低或消除催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生粅相比被降低至少约35%
42.根据权利要求25-40中任一项所述的重组微生物，其中来自所述醛中间体的所述酸副产物碳得率与不包括降低或消除催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约75%
43.根据权利要求25-40中任一项所述的重组微生物，其Φ来自所述醛中间体的所述酸副产物碳得率与不包括降低或消除催化醛向酸副产物转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生粅相比被降低至少约95%
44.根据权利要求25-43中任一项所述的重组微生物，其中所述催化醛向酸副产物转化的酶为醛脱氢酶
45.根据权利要求44所述的偅组微生物，其中所述醛脱氢酶为酿酒酵母ALD6(SEQ IDNO:25)或其同源物或变体
47.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物被工程化以降低或消除丙酮酸脱羧酶(roc)活性
48.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物被工程化以降低或消除甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)活性
49.根据前述权利要求中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物为酵母微生物
50.根据权利要求4 9所述的重组微生物，其Φ所述重组微生物为酵母属(Saccharomyces)进化枝的酵母微生物
53.根据权利要求49所述的重组微生物，其中所述重组微生物为Crabtree-阴性酵母微生物
56.根据权利要求49所述的重组微生物，其中所述重组微生物为Crabtree-阳性酵母微生物
59.根据权利要求49所述的重组微生物，其中所述重组微生物为后-WGD(全基因组倍增)酵母微生物
60.根据权利要求59所述的重组微生物，其中所述后-WGD酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属酵母属或假丝酵母属
61.根据权利要求60所述的重组微生物，其中所述后-WGD酵母微生物选自由下列组成的组酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、芽殖酵母和光滑假丝酵母
62.根据权利要求49所述的重组微生物，其中所述重组微生物为前-WGD(全基因组倍增)酵母微生物
63.根据权利要求62所述的重组微生物，其中所述前-WGD酵毋微生物归类为选自由下列组成的组的属酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、伊萨酵母属、管囊酵母属(Pachysolen)、耶氏酵母属(Yarrowia)和裂殖酵母属
64.根据权利要求63所述的重组微生物，其中所述前-WGD酵母微生物选自由下列组成的组可鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、耐热克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、克鲁雄酵母、乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母(Candida
tropicalis)、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、库德裏阿兹威毕赤酵母、东方伊萨酵母、汉逊德巴利酵母、异常汉逊酵母、嗜鞋管囊酵母(Pachysolen tannophilis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)和粟酒裂殖酵母
65.—种产生由3-酮酸中間体衍生的有益代谢产物的方法，包括 (a)提供根据权利要求1-16和25-64中任一项所述的重组微生物； (b)在含有提供所述碳源的原料的培养基中培养所述偅组微生物直到产生可回收量的所述有益代谢产物；以及 (c)回收所述有益代谢产物。
66.根据权利要求65所述的方法其中所述3-酮酸中间体为乙酰乳酸，并且所述有益代谢产物选自异丁醇、2-丁醇、I-丁醇、2-丁酮、23-丁二醇、乙偶姻、二乙酰、缬氨酸、亮氨酸、泛酸、异丁烯、3-甲基-I- 丁醇、4-甲基-I-戊醇和辅酶A。
67.根据权利要求65所述的方法其中所述3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸，并且所述有益代谢产物选自2-甲基-I- 丁醇、异亮氨酸、3-甲基-I-戊醇、4-甲基-I-己醇和5-甲基-I-庚醇
68.—种产生由醛中间体衍生的有益代谢产物的方法，包括 (a)提供根据权利要求17-64任一项所述的重组微生物； (b)茬含有提供所述碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物直到产生可回收量的所述有益代谢产物；以及 (c)回收所述有益代谢产物。
69.根据權利要求68所述的方法其中所述醛中间体选自异丁醛、I-丁醛、2-甲基-I-丁醛、3-甲基-I-丁醛、I-丙醛和丙酮、I-戊醛、I-己醛、3-甲基-I-戊醛、4-甲基-I-戊醛、4-甲基-I-己醛和5-甲基-I-庚醛。
70.根据权利要求69所述的方法其中所述有益代谢产物选自异丁醇、I-丁醇、2-甲基-I-丁醇、3-甲基-I-丁醇、I-丙醇、I-戊醇、I-己醇、3-甲基-I-戊醇、4-甲基-I-戊醇、4-甲基-I-己醇和5-甲基-I-庚醇。
71.—种产生由3-酮酸和醛中间体衍生的有益代谢产物的方法包括 (a)提供根据权利要求25-64任一项所述的偅组微生物； (b)在含有提供所述碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物，直到产生可回收量的所述有益代谢产物；以及 (c)回收所述有益代謝产物
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述3-酮酸中间体为乙酰乳酸并且所述有益代谢产物选自异丁醇、I-丁醇和3-甲基-I-丁醇。
73.根据权利要求71所述的方法其中所述3-酮酸中间体为2-乙酰-2-羟基丁酸，并且所述有益代谢产物选自2-甲基-I- 丁醇、3-甲基-I-戊醇、4-甲基-I-己醇和5-甲基-I-庚醇
74.—种包含產生异丁醇的代谢途径的重组微生物，其中所述重组微生物被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向23-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化的一种或多种酶嘚表达或活性。
75.根据权利要求74所述的重组微生物其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一種或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约50%。
76.根据权利要求74所述的重组微生物其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约75%。
77.根据权利要求74所述的重组微生物其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低臸少约95%。
78.根据权利要求74-77任一项所述的重组微生物其中所述催化乙酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶。
79.根据权利要求78所述的重组微生物其Φ所述3-酮酸还原酶为酿酒酵母YMR226 (SEQ ID NO: I)或其同源物或变体。
81.—种包含产生异丁醇的代谢途径的重组微生物其中所述重组微生物被工程化以降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化的一种或多种酶的表达或活性。
82.根据权利要求81所述的重组微生物其中来自异丁醛的所述异丁酸碳得率与不包括降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少35%。
83.根据权利要求81所述的重组微生物其中来自异丁醛的所述异丁酸碳得率与不包括降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少75%。
84.根据权利要求81所述的重组微生物其中来自异丁醛的所述异丁酸碳得率与不包括降低或消除催化异丁醛向异丁酸轉化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少95%。
85.根据权利要求81-84任一项所述的重组微生物其中所述催化异丁醛姠异丁酸转化的酶为醛脱氢酶。
86.根据权利要求85所述的重组微生物其中所述醛脱氢酶为酿酒酵母ALD6(SEQ IDNO:25)或其同源物或变体。
88.—种包含产生异丁醇嘚代谢途径的重组微生物其中所述重组微生物 (i)被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向2，3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化的一种或多种酶的表达或活性；以及 ( )被工程化以降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化的一种或多种酶的表达或活性
89.根据权利要求88所述的重组微生物，其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约50%
90.根据權利要求88所述的重组微生物，其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约75%
91.根据权利要求88所述的重组微生物，其中来自乙酰乳酸的所述DH2MB碳得率与不包括降低或消除催化乙酰乳酸向DH2MB转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少约95%
92.根据权利要求88-91中任一项所述的重组微生物，其中所述催囮乙酰乳酸向DH2MB转化的酶为3-酮酸还原酶
93.根据权利要求92所述的重组微生物，其中所述3-酮酸还原酶为酿酒酵母YMR226 (SEQ ID NO: I)或其同源物或变体
95.根据权利要求88所述的重组微生物，其中来自异丁醛的所述异丁酸碳得率与不包括降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达戓活性的亲本微生物相比被降低至少35%
96.根据权利要求88所述的重组微生物，其中来自异丁醛的所述异丁酸碳得率与不包括降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少75%
97.根据权利要求88所述的重组微生物，其中来自异丁醛的所述异丁酸碳得率与不包括降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化中涉及到的一种或多种酶的表达或活性的亲本微生物相比被降低至少95%
98.根据权利要求88-97中任一项所述的重组微生物，其中所述催化异丁醛向异丁酸转化的酶为醛脱氢酶
99.根据权利要求98所述的重组微生物，其中所述醛脱氢酶为酿酒酵母ALD6(SEQ IDNO:25)或其同源物或变体
101.根据权利要求88-100中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物被工程化以降低或消除丙酮酸脱羧酶(roc)活性
102.根据权利要求88-101中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物被工程化以降低或消除甘油3-磷酸脱氢酶(GPD)活性
103.根据权利要求88-102中任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物为酵母微生物
104.根据权利要求103所述的重组微生物，其中所述重组微生物为酵母属进化枝的酵母微生物
106.根据权利要求105所述的重组微生物,其中所述Saccharomycessensu stricto微生物选自由下列组成的组酿酒酵母、库德里阿兹威酵母、S. mikatae、贝酵母、葡萄汁酵母、S. carocanis及其杂交体。
107.根据权利要求103所述的重组微生物其中所述重组微生物为Crabtree-阴性酵母微生物。
108.根据权利要求107所述的重组微生物其中所述Crabtree-阴性酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属酵母属、克鲁维酵母属)、毕赤酵母属、汉逊酵母属)、伊萨酵母属和假丝酵母属。
109.根据权利要求108所述的重组微生物其中所述Crabtree-阴性酵母微生物选自由下列组成的组可鲁弗酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、异常毕赤酵毋、树干毕赤酵母、库德里阿兹威毕赤酵母、东方伊萨酵母、异常汉逊酵母、产朊假丝酵母和克鲁雄酵母。
110.根据权利要求103所述的重组微生粅其中所述重组微生物为Crabtree-阳性酵母微生物。
111.根据权利要求Iio所述的重组微生物其中所述Crabtree-阳性酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属酵母属、克鲁维酵母属、接合酵母属、德巴利酵母属、毕赤酵母属、假丝酵母属和裂殖酵母属。
112.根据权利要求111所述的重组微生物其中所述Crabtree-阳性酵母微生物选自由下列组成的组酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、芽殖酵母、耐热克鲁维酵母、光滑假丝酵母、Zygosaccharomyces bailli、鲁氏接合酵母、汉逊德巴利酵母、巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖酵母和葡萄汁酵母。
113.根据权利要求103所述的重组微生物其中所述重组微生物为后-WGD(铨基因组倍增)酵母微生物。
114.根据权利要求113所述的重组微生物其中所述后-WGD酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属酵母属或假丝酵母属。
115.根据权利要求114所述的重组微生物其中所述后-WGD酵母微生物选自由下列组成的组酿酒酵母、葡萄汁酵母、贝酵母、奇异酵母、芽殖酵母和咣滑假丝酵母。
116.根据权利要求103所述的重组微生物其中所述重组微生物为前-WGD(全基因组倍增)酵母微生物。
117.根据权利要求116所述的重组微生物其中所述前-WGD酵母微生物归类为选自由下列组成的组的属酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、德巴利酵母属、汉逊酵母属、伊萨酵母属、管囊酵母属、耶氏酵母属和裂殖酵母属。
118.根据权利要求117所述的重组微生物其中所述前-WGD酵母微生物选自由下列组成的组可鲁弗酵母、耐热克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、克鲁雄酵母、乳酸克鲁维酵母、热带假丝酵母、巴斯德毕赤酵母、异常毕赤酵母、树干毕赤酵母、库德里阿兹威毕赤酵母、东方伊萨酵母、汉逊德巴利酵母、异常汉逊酵母、嗜鞣管囊酵母、解脂耶氏酵母和粟酒裂殖酵母。
119.一种產生异丁醇的方法包括 (a)提供根据权利要求74-118中任一项所述的重组微生物； (b)在含有提供所述碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物，直箌产生可回收量的异丁醇；以及 (c)回收所述异丁醇
120.一种包含使用3-酮酸作为中间体的生物合成途径的重组微生物，其中所述重组微生物(a)被工程化以降低或消除催化所述3-酮酸向3-羟基酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性；和/或 (b)基本上不含催化3-酮酸向3-羟基酸副产物转化的酶
121.—种包含使用醛作为中间体的生物合成途径的重组微生物，其中所述重组微生物 (a)被工程化以降低或消除催化所述醛中间体向酸副产物转化嘚一种或多种酶的表达或活性；和/或 (b)基本上不含催化醛中间体向酸副产物转化的酶
122.—种包含使用3-酮酸和醛作为中间体的生物合成途径的偅组微生物，其中所述重组微生物 (a)被工程化以降低或消除催化所述3-酮酸向3-羟基酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性；和/或 (b)基本上不含催化3-酮酸向3-羟基酸副产物转化的酶；以及 (c)被工程化以降低或消除催化所述醛中间体向酸副产物转化的一种或多种酶的表达或活性；和/或
(d)基本上不含催化醛中间体向酸副产物转化的酶
123.—种包含产生异丁醇的代谢途径的重组微生物，其中所述重组微生物 (a)被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向23-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化的酶的表达或活性；和/或 (b)基本上不含催化乙酰乳酸向2，3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化的酶
124.—种包含产生異丁醇的代谢途径的重组微生物，其中所述重组微生物 (a)被工程化以降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化的一种或多种酶的表达或活性；和/戓 (b)基本上不含催化异丁醛向异丁酸转化的酶
125.—种包含产生异丁醇的代谢途径的重组微生物，其中所述重组微生物 (a)被工程化以降低或消除催化乙酰乳酸向23-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化的酶的表达或活性；和/或(b)基本上不含催化乙酰乳酸向2，3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化的酶；以及 (c)被工程化以降低或消除催化异丁醛向异丁酸转化的一种或多种酶的表达或活性；和/或
(d)基本上不含催化异丁醛向异丁酸转化的酶
126.—种重组微生物，包含 (a)编码具有乙酰乳酸合酶活性的胞质内局限性多肽的基因并且其中所述细胞将丙酮酸转化为乙酰乳酸；以及 (b)过表达的酮醇酸还原异构酶，其中所述KARI已被工程化以表现出与野生型或亲本KARI相比减小的乙酰乳酸Km和/或增大的乙酰乳酸kcat
127.—种重组微生物，包含 (a)编码具有至少O. 5U/mg裂解液乙酰乳酸合酶活性的胞质内局限性多肽的基因并且其中所述细胞将丙酮酸转化为乙酰乳酸；以及(b)过表达的酮醇酸还原异构酶(KARI)，其中所述KARI具囿至少O. 03U/mg裂解液KARI活性
128.—种重组微生物，包含 (a)编码具有至少O.5U/mg裂解液乙酰乳酸合酶活性的胞质内局限性多肽的基因并且其中所述细胞将丙酮酸转化为乙酰乳酸；以及 (b)过表达的二羟酸脱水酶(DHAD)，其中所述DHAD具有至少O.03U/mg裂解液DHAD活性
129.—种重组微生物，包含 (a)编码具有乙酰乳酸合酶活性的胞質内局限性多肽的基因并且其中所述细胞将丙酮酸转化为乙酰乳酸； (b)催化乙酰乳酸向2，3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化中涉及到的一种或多种内源性蛋白质的活性或表达的降低或缺失；以及 (c)过表达的酮醇酸还原异构酶
130.一种包含产生异丁醇的代谢途径的重组微生物，其中所述重组微苼物过表达能够将23-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化成乙酰乳酸的内源或异源蛋白质。
131.一种包含产生异丁醇的代谢途径的重组微生物其中所述重组微生物过表达能够将2，3- 二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)转化成23- 二羟基异戊酸(DHIV)的内源或异源蛋白质。
132.一种用于产生23-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)的重组微生物，其中所述重组微生物过表达能够将乙酰乳酸转化成23- 二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)的一种或多种酶。
133.根据权利要求132所述的重组微生物其中所述能够将乙酰乳酸转化成2，3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)的酶为3-酮酸还原酶
134.根据权利要求133所述的重组微生物，其中所述3-酮酸还原酶为酿酒酵母YMR226 (SEQ ID NO: I)或其同源物或变体
136.—种用于产生2，3-二羟基-2-甲基丁酸(DH2MB)的方法包括 (a)提供根据权利要求132-135中任一项所述的重组微生物； (b)在含有提供所述碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物，直到产生可回收量的DH2MB ；以及 (c)回收所述DH2MB
137.一种用于产生2-乙基-2，3-二羟基丁酸的重组微生物其中所述重组微生物过表达能够將2-乙酰-2-羟基丁酸转化成2-乙基-2，3- 二羟基丁酸的一种或多种酶
138.根据权利要求137所述的重组微生物，其中所述能够将2-乙酰-2-羟基丁酸转化成2-乙基-23- ②羟基丁酸的酶为3-酮酸还原酶。
139.根据权利要求138所述的重组微生物其中所述3-酮酸还原酶为酿酒酵母YMR226 (SEQ ID NO: I)或其同源物或变体。
141.一种用于产生2-乙基-23-二轻基丁酸的方法,包括 (a)提供根据权利要求137-140中任一项所述的重组微生物； (b)在含有提供所述碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物，直箌产生可回收量的2-乙基-23- 二羟基丁酸；以及 (c)回收所述2-乙基-2，3-二羟基丁酸
142.—种用于产生酸产物的重组微生物，其中所述重组微生物过表达能够将醛转化成酸副产物的一种或多种酶
143.根据权利要求142所述的重组微生物，其中所述催化醛向酸副产物转化的酶为醛脱氢酶
144.根据权利偠求143所述的重组微生物，其中所述醛脱氢酶为酿酒酵母ALD6(SEQID NO:25)或其同源物或变体
146.一种用于产生酸产物的方法，包括 (a)提供根据权利要求142-145中任一项所述的重组微生物； (b)在含有提供所述碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物直到产生可回收量的所述酸产物；以及 (c)回收所述酸产物。
147.根据权利要求146所述的方法其中所述酸副产物选自异丁酸、丁酸、2-甲基-I-丁酸、3-甲基-I-丁酸、丙酸、戊酸、己酸、3-甲基-I-戊酸、4-甲基-I-戊酸、4-甲基-I-己酸和5-甲基-I-庚酸。
148.—种在对应于选自由下列组成的组的氨基酸的位置包含一种或多种修饰的修饰醇脱氢酶(ADH) (a)野生型乳酸乳球菌(L. lactis) AdhA (SEQ IDNO:
2)第50位酪氨酸；(b)野生型乳酸乳球菌AdhA第77位谷氨酰胺；(c)野生型乳酸乳球菌AdhA第108位缬氨酸；(d)野生型乳酸乳球菌AdhA第113位酪氨酸；(e)野生型乳酸乳球菌AdhA第212位异亮氨酸；以忣(f)野生型乳酸乳球菌AdhA第264位亮氨酸
149.根据权利要求148所述的修醇脱氢酶(ADH)，其中所述第50位酪氨酸残基被苯丙氨酸或色氨酸残基替代
150.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH)，其中所述第77位谷氨酰胺残基被精氨酸或丝氨酸残基替代
151.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH)，其中所述第108位缬氨酸残基被丝氨酸或丙氨酸残基替代
152.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH)，其中所述第113位酪氨酸残基被苯丙氨酸或甘氨酸残基替代
153.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH)，其中所述第212位异亮氨酸残基被苏氨酸、丙氨酸或缬氨酸残基替代
154.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH)，其中所述第264位亮氨酸残基被缬氨酸残基替代
155.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH)，其中所述修饰ADH将异丁醛转化成异丁醇的催化效率与所述野生型ADH相比增强至少约50%
156.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH)，其中所述修饰ADH将异丁醛转化成异丁醇的催化效率与所述野生型ADH相比增强至少约100%
157.根据权利要求148所述的修饰醇脱氢酶(ADH)，其中所述修饰ADH将异丁醛转化成异丁醇的催化效率与所述野生型ADH相比增强至少约200%
159.根据权利要求158所述的修饰醇脱氢酶(ADH)，其中对所述ADH进行密码子优化以在宿主细胞中表达
160.根据权利要求159所述的修饰醇脱氢酶(ADH)，其中所述宿主细胞为酵母
161.根据权利要求159所述的修饰醇脱氢酶(ADH)，其中所述宿主细胞为大肠杆菌(E. coli)
162.—种用编码根据权利要求148-161中任一项所述的修饰醇脱氢酶(ADH)的核酸构建体转化的偅组微生物。
163.根据权利要求15所述的重组微生物其中所述重组微生物包含产生异丁醇的代谢途径，所述途径包含一种或多种选自以下的异丁醇代谢途径酶こ酰乳酸合酶(ALS)、酮醇酸还原异构酶(KARI)、ニ羟酸脱水酶(DHAD)和2-酮酸脱羧酶(KIVD)
164.根据权利要求163所述的重组微生物，其中所述重组微生物為酵母微生物
165.—种产生异丁醇的方法，包括 (a)提供根据权利要求148-164中任一项所述的重组微生物；以及 (b)在含有提供所述碳源的原料的培养基中培养所述重组微生物直到产生可回收量的所述异丁醇。
本发明涉及包含生物合成途径的重组微生物以及使用所述重组微生物产生多种有益代谢产物的方法在本发明的多个方面，所述重组微生物可进一步包含一种或多种修饰导致降低或消除3-酮酸(例如，乙酰乳酸和2-乙酰-2-羟基丁酸)和/或醛衍生的副产物在本文所述的多个实施方案中，所述重组微生物可以是酵母属(Saccharomyces)进化枝微生物、Crabtree-阴性酵母微生物、Crabtree-阳性酵母微苼物、后-WGD(全基因组倍增)酵母微生物、前-WGD(全基因组倍增)酵母微生物以及非发酵酵母微生物
