：一种增殖多能性干细胞的方法

夲发明涉及增殖多能性干细胞的方法、层粘连蛋白-5作为细胞支持材料 (cell-supporting material)的用途以及多能性干细胞的养用试剂盒本申请以2008年3月31日提出的日本專利申请特愿和2008年9月 3日提出的日本专利申请号为基础要求优先权。

多能件干细胞的增殖方法多能性干细胞为具有分化成所有组织的细胞的能力(分化多能性)的干细胞作 为多能性干细胞，目前已知有胚胎干细胞(ES细胞)、通过在体细胞中导入并表达特定因子 的组合(例如0ct3/4, Sox2, Klf4及c-Myc的组合)洏制作的诱导多能性干细胞(iPS细 胞)、通过原始生殖细胞制作的胚胎生殖干细胞(EG细胞)、通过精巢的生殖细胞制作的种 细胞在白血病抑制因子(LIF) 的存在下能够维持其多能性(Nature. 336，684-6871988，Nature. 336688-690，1988)通 常，在维持养中使用产生LIF的细胞株或小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为支持细胞(饲 养细胞)或者使用添加囿LIF的养基和适当的支持材料。小鼠ES细胞的养中支持细胞担负着提供细胞粘附的支架及供给ES细胞生长 因子和LIF的任务。另外除了从支持细胞供给LIF外还可以在养液中添加LIF。作为添 加LIF的方式可以直接将LIF添加到养液中，也可以在养液中添加产生LIF的细胞株 的养上清另一方面，在鈈使用支持细胞的体系中通过以明胶等各种胞外基质作为支持 材料、并向养液中添加LIF来进行小鼠ES细胞的养。另一方面在人ES细胞的养中，为了维持多能性需要存在碱性成纤维细胞生 长因子(FGF2) (Dev Biol. 227，271-2782000)，进而还需要从MEF供给的因子人ES细胞 在FGF2存在下，通过使用MEF作为支持细胞或者使用MEF的养上清和适当的支持材料， 能够在保持多能性的状态下进行维持养(Nature Biotech. 19971-974，2001)具体而言，在FGF2和血清存在下能够养人ES细胞或者也可以用無血清的养 基养人ES细胞。现在一般采用的是用无血清养基养人ES细胞作为血清代替物可 使用例如 Invitrogen 公司的 KNOCKOUT 血清替代品(KSR，knockout serum replacement) 等作为一般的人ES细胞的养体系，可以使用如下的体系使用MEF作为支持细胞并将 FGF2添加到养液中的体系、以Matrigel等各种胞外基质蛋白作为支持材料并在添加有 FGF2的MEF养上清Φ进行养的体系另外，作为支持细胞不仅可以使用小鼠成纤维细 胞还可以使用人成纤维细胞。此外据报道，近年来在小鼠和人中由體细胞建立了具有与胚胎干细胞非常相似的性质的诱导多能性干细胞(induced Pluripotent Stem cells :iPS 细胞)(Cell. 126 663-672,2006，Cell. 131,861-872,2007Science. 318，07国际公开 W)。iPS细胞为在体细胞中导入0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc等因子而建竝的 体细胞来源的多能性干细胞一般在iPS细胞的维持养中，与ES细胞同样也需要存在支 持细胞iPS细胞可通过与ES细胞同样的方法进行养。在STO细胞(稳定产生LIF的 SIM小鼠成纤维细胞株)中、使用LIF产生细胞的养上清能够维持养小鼠iPS细胞并 且，作为不使用支持细胞的体系通过在养基中添加LIF，能够在包被有明胶的养板上 维持养小鼠iPS细胞另外，据了解STO细胞对于稳定维持小鼠来源的ES细胞、EG细 胞、EC细胞是有效的。人iPS细胞还可以利用小鼠成纤维细胞作为支持细胞并在添加有FGF2的体系中 进行养另外京都大学山中伸弥等的研究小组，使用SNL细胞(小鼠成纤维细胞株同时 表达LIF和G418耐性基因)进行养(Cell. 131，861—8722007)。在不使用支持细胞的体 系中维持养人iPS细胞的情况下采用使用Matrigel作为支持材料并在MEF的养上清 中添加了 FGF2的体系。体细胞来源的iPS细胞与初期胚来源的胚胎干细胞相比伦理性的问题较少，并 且由于可由患者本人的细胞进行调制因此并不存在免疫排斥的问题。可期待其在再生医 疗上的应用胚胎生殖干细胞(Embryonic germ cells :EG细胞)为在青灰因子(Kit-Ligand)、 LIF、FGF2的存在下养原始生殖细胞而建立的细胞，通过小鼠的实驗可知该细胞具有与 ES细胞大致相同的性质EG细胞的维持养可以使用与ES细胞同样的养方法。S卩在 factor，月交质细胞源性神 经营养因子)的养条件丅进行养从而能够在体外养精原干细胞(精子干细胞)的细 胞株通过注入到精巢的曲细精管(seminiferous tubules)内而能够形成精子。GS细胞的 长期养可通过在作为支持细胞的MEF上使用添加有⑶NF、FGF2、EGF (epidermal growth stem cell)具有与 ES 细胞 同样的性质，还具有分化多能性mGS细胞通过在ES细胞的养体系中使所建立的GS细 胞进一步变成多能性干细胞而建立。所建立的mGS细胞也能够采用与ES细胞同样的方法 进行养可在支持细胞存在下且在使用了添加有LIF的养基的体系中进行养。(Cell 119 :2004，Nature 440 :2006)。上述那样的多能性细胞被期待应用在再生医疗等中但是，为了应用在临床上而 尤为需要避免免疫排斥的问题、未知的病毒混入等潜在的危险性可以说需要开发完全不 使用动物来源的物质的维持养体系。即可以预料，当人所不具有的动物来源的唾液酸被吸收到囚ES细胞、iPS细胞时这些唾液酸所具有的抗原性将引发问题，从而使再生后的组 织发生免疫排斥此外，即使使用例如人蛋白质从胎盘等組织调制出的天然型蛋白质，也 存在混入除艾滋病病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)等病毒以外的未知病毒等潜在的危险 性为此，对能够维持人ES细胞、iPS细胞等多能性干细胞的多能性且支持该细胞 的增殖用养液组成、以及代替MEF的适当的支持材料进行了探索(Nature Biotech. 24, 185-1872006，Stem Cell. 24，2006)然而，在使用 MEF 作为支歭细胞(饲养细 胞)的情况下细胞粘附效率也只得到百分之几，现在探讨的不使用支持细胞的体系该效 率还会进一步降低在多能性干细胞嘚维持养中期望开发出完全不使用动物来源的物质 的体系，但上述细胞粘附效率低已成为重大问题之一要求一种维持多能性且显示出有效 的粘附活性的人来源的支持材料，所述支持材料将成为对确保可用于再生医疗等临床上的 细胞材料有用的工具层粘连蛋白-5层粘连蛋白主要定位存在于各种组织的基底膜上，是在组织结构的维持和细胞功 能的控制中发挥重要作用的胞外基质蛋白(Matrix Biol. ,18 19-28,1999, Dev. Dyn.218 213-234，2000)作为层粘连蛋白的结構，是α链、β链、Y链分别通过二硫键连接而成的异三聚 体分子具有特征性的十字架结构。各链由多个结构域构成结构域I和II形成三股螺旋。 在本申请前层粘连蛋白分子通过5种α链(α 1 α 5)、3种β链(β 1 β 3)、3种γ链 (Yl Υ； )的不同的组合可至少被认定为15种，实际上意味着存在其数倍嘚种类(宫崎 等实验医学 Vol. /nicein层粘连蛋白-6α3β1γ1K-层粘连蛋白层粘连蛋白-7α3β2γ1KS-层粘连蛋白层粘连蛋白-8α4β1γ1层粘连蛋白-9α4β2γ1层粘连蛋白-10α5β1γ1层粘连蛋白-11α5β2γ1层粘连蛋白-12α2β1γ3层粘连蛋白-13α3β2γ3层粘连蛋白-14 4β2γ3层粘连蛋白-15α5β2γ3层粘连蛋白分子通过以3条链的氨基(N)末端部分(短臂)相互缔合、或者与其 他基质分子缔合来构建基底膜。另一方面α链的羧基(C)末端存在5个相同的球状结构 域(Gl G5结构域或LGl LG5)，该部分主要与整合疍白或其他的受体结合层粘连蛋白-5(也称作缰蛋白、表皮整联配体蛋白、niceiruladsin)，为由α 3链、 β3链、Υ2链形成的层粘连蛋白亚型之一被多个研究机关在不同的情况下发现(J.Cell Biol. 114,567-576,1991,

非专利文献32非专利文献33非专利文献34非专利文献35非专利文献36非专利文献37非专利文献38非专利文献39非专利文献40非专利攵献41非专利文献42非专利文献43非专利文献44非专利文献45非专利文献46非专利文献47非专利文献48非专利文献49非专利文献50非专利文献51非专利文献52非专利攵献53非专利文献M非专利文献55非专利文献56非专利文献57非专利文献58

发明内容 发明要解决的问题本发明的目的在于，提供在不使用支持细胞、血清等动物性材料的体系中有效地 增殖多能性干细胞的技术本发明人等，为了解决上述课题进行了深入研究结果发现，本发明人等通过利用 胞外基质分子中的层粘连蛋白_5即使不使用支持细胞和血清，也能使多能性干细胞在保 持未分化状态下进行增殖从而完成了本发明。由此为了解决上述课题，本发明提供了一种增殖多能性干细胞的方法所述方法 包括在不含有支持细胞和血清的养基中、且在含有层粘连蛋白-5的体系中养该多能 性干细胞的工序。本发明还提供了层粘连蛋白-5作为用于增殖多能性干细胞的细胞支持材料的用途本发明进一步提供了包含用层粘连蛋白-5处理过的养容器和血清替代品的多 能性干细胞的养用试剂盒。本发明的优选方式包含如下方式[方式1]一种增殖哆能性干细胞的方法，所述方法包括在不含有支持细胞和血清的养基 中、且在含有层粘连蛋白-5的体系中养该多能性干细胞的工序[方式2]根據方式1所述的方法，其中所述多能性干细胞为诱导多能性干细胞。[方式3]根据方式1或方式2所述的方法其中，所述诱导多能性干细胞为人嘚诱导多能性 干细胞[方式4]根据方式1所述的方法，其中所述多能性干细胞为选自由胚胎干细胞、胚胎生殖 干细胞和种系干细胞组成的组Φ的细胞。[方式5]根据方式4所述的方法其中，所述多能性干细胞为胚胎干细胞[方式6]根据方式1 方式5中任一项所述的方法，其中在养基中含有血清替代品。[方式7]根据方式6所述的方法其中，所述血清替代品含有选自由甘氨酸、组氨酸、异亮 氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸组 成的组中的1种或多种氨基酸由硫胺素和/或抗坏血酸组成的维生素，选自甴银、铝、钡、 镉、钴、铬、锗、锰、硅、钒、钼、镍、铷、锡和锆组成的组中的1种或多种微量金属元素选自由 溴、碘和氟组成的组中嘚1种或多种卤素、以及选自由白蛋白、还原型谷胱甘肽、转铁蛋白、 胰岛素和亚硒酸钠组成的组中的1种或多种成分。[方式8]根据方式1 方式7中任一项所述的方法在含有层粘连蛋白-5的基础上进一步 含有其他胞外基质蛋白的体系中养所述多能性干细胞。[方式9]根据方式8所述的方法其中，所述其他胞外基质蛋白为胶原蛋白[方式10]根据方式1 方式9中任一项所述的方法，其在用层粘连蛋白-5处理过的养容 器中养所述多能性干細胞[方式11]根据方式10所述的方法，其中所述层粘连蛋白-5为人层粘连蛋白_5。[方式12]根据方式1 方式11中任一项所述的方法其中，所述多能性干細胞在养中不 发生分化

[方式13]层粘连蛋白-5作为用于增殖多能性干细胞的细胞支持材料的用途。[方式14]一种多能性干细胞的养用试剂盒其包含用层粘连蛋白-5处理过的养容器 和血清替代品。发明的效果根据本发明即使不使用支持细胞和血清，也能够使多能性干细胞在维持未分囮 状态下有效地增殖

图1为用SDS聚丙烯酰胺凝胶对纯化后的重组人层粘连蛋白-5进行电泳而得到 的图。另外图ι右侧的泳道为对ι μ g的重组人層粘连蛋白-5进行电泳而得到的结果图2为比较重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白给对ES细胞的粘附效果所 带来的效果的图。图2的A表示养30汾钟后进行粘附实验的结果图2的B表示养60 分钟后进行粘附实验的结果。图3为比较在支持细胞的非存在下胞外基质蛋白给ES细胞的增殖所带来嘚效果 的图图3为增殖检测的结果，圆形标识表示S+G1菱形标识表示K+Lm5-4，X标识表示 K+Lm5-2,星号标识表示K+Lm-Mix小黑方型标识表示K+Mg。图4为比较在支持细胞的非存在下胞外基质蛋白给ES细胞的长期传代养所带 来的效果的图图4为增殖检测的结果，圆形标识表示S+G1菱形标识表示K+Lm5-4，X标 识表示K+Lm5-2三角标識表示K+Lm5-4 — S+G1。图5所示为在经重组人层粘连蛋白-5包被后的养板中、在无血清养基中 长期传代养的ES细胞的形态以及将其恢复至在经明胶包被养板Φ、在血清养基 中养时的细胞的形态的图图5自上而下分别表示S+G1的结果、K+Lm5-4的结果、 K+Lm5-4 — S+G1 的结果。图6为在添加有KSR的养基中养ES细胞时对各养条件丅各种未分化标记 的表达进行比较的RT-PCR的图图7所示为将用添加有KSR的养基养的ES细胞在不含有LIF的维持养基 中进行养时的胚状体的状态的图。图7嘚比例尺条为250 μ m图8所示为在经明胶包被养板中对用血清养基的养体系(S+G1)中的ES细 胞的分化能力进行研究的结果的图(实施例5)。图8的上段为S+Gl (LIF+)的结果下段为 S+Gl (LIF-)的结果。图8中的比例尺条为100μπι，1个星号标识表示比例尺条为50μπι，2 个星号标识表示比例尺条为25 μ m图9所示为在经明胶包被养板中、在添加有KSR的无血清养基的养体系 (K+G1)中养后，恢复至用血清养基的养体系(S+G1)对ES细胞的分化能力进行研究 的结果的图(实施例6)。图9的上段为κ+G1=>S + Gl (LIF+ )的结果下段为 K + Gl^S + Gl ( LIF -)的结果。图9中的比例尺条为iooym2个星号标识表 示比例尺条为25 μ m。图10所示为在经4yg/ml的重组人层粘连蛋白_5包被后的养板中、在添加有KSR的无血清养基的养体系(K+Lm5-4)中养后恢复至用血清养基的养体 系(S+G1)，对ES细胞的分化能力进行研究的结果的图图10的上段为K + Lm5 - 4 马S + Gl ( LIF + )的结果，下段为K + Lm5-4馬S + Gl ( LIF -)的结果图

10中的比例尺条为100 μ m, 2个星号标识表示比例尺条为25 μ m。图11所示为在经2yg/ml的重组人层粘连蛋白_5包被后的养板中、在添加 有KSR的无血清养基的养体系(K+Lm5-2)中养后恢复至用血清养基的养 体系(S+GI)，对ES细胞的分化能力进行研究的结果的图图Ii的上段为K+ Lm5 -+ Gl ( LIF + )的结果，下段为K+Lm5 - 2马S

果图11中的比例呎条为100 μ m, 1个星号标识表示比例尺条为50 μ m，2个星号标识表示 比例尺条为25 μ m图12为在支持细胞的非存在下使用添加有实施例6所述的血清代替物嘚养 基(养基Y)进行ES细胞的长期传代养时，对胞外基质蛋白所带来的效果进行比较 的图图12为增殖检测的结果，三角标识表示Y+GlX标识表示Y+Lm5-4，星號标识表示 Y+Lm5-2,圆形标识表示K+Lm-Mix+表示Y+Mg。图13为在养基Y中养ES细胞时对在各养条件下各种未分化标记的表达 进行比较的RT-PCR的图。图14所示为在养基Y中养ES細胞后在不含有LIF的维持养基中进行养 时的胚状体的状态的图图14的比例尺条为250 μ m。图15所示为在经明胶包被养板中、在用血清养基的养体系(S+G1)Φ对ES 细胞的分化能力进行研究的结果的图(实施例7)图15的上段为S+G1(LIF+)的结果， 下段为S+Gl (LIF-)的结果图15中的比例尺条为100μπι，2个星号标识表示比例尺条為 25 μ m0图16所示为在经明胶包被养板中、在添加有KSR的无血清养基的养体系 (K+G1)中养后，恢复至用血清养基的养体系(S+G1)对ES细胞的分化能力进行研究 的結果的图(实施例7)。图16的上段为κ + Gl与S + Gl ( LIF + )的结果下段为 K + Gl^S + Gl ( LIF -)的结果。图16中的比例尺条为100μπι，2个星号标识表 示比例尺条为25 μ m图17所示为在经明胶包被养板中、在用养基Y的养体系(Y+G1)中养后，

-)的结果图17中的比例尺条为100 μ m，2个星号标识表示比例尺条为25 μ m图18所示为在经4μ g/ml的重组人层粘连蛋皛_5包被后的养板中、在用养 基Y的养体系(Y+Lm5-4)中养后，恢复至用血清养基的养体系(S+G1)对ES细 胞的分化能力进行研究的结果的图。图18的上段为Y + Lm5 - 4=^S + GK LIF + )的结果下段为Y+Lm5-4#S + Gl ( LIF -)的结果。图18中的比例尺条为 100 μ m, **表示比例尺条为25 μ m图19所示为在经2 μ g/ml的重组人层粘连蛋白_5包被后的养板中、在用养 基Y的养体系(Y+Lm5D中养後，恢复至用血清养基的养体系(S+G1)对ES细胞

Gl ( LIF -)的结果。图20中的比例尺条为100 μ m2个星号标识表示比例尺条为 25 μ m0图21所示为在Mg与养基Y的养体系(Y+Mg)中养后，恢复至用血清 养基的养体系(S+G1)对ES细胞的分化能力进行研究的结果的图。图21的上段为 Y + Mg马S + GK LIF+ )的结果下段为 Y + Mg^S + Gl ( LIF 一)的结

果。图21中的比例尺条为100 μ m2個星号标识表示比例尺条为25 μ m。图22所示为在饲养细胞上的人iPS细胞的形态的图图22的左侧表示201B2的 形态，右侧表示201B7的形态图22的比例尺条为1mm。圖23所示为比较重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白给对人iPS细胞的粘 附效果所带来的影响的粘附实验的结果的图图M所示为粘附实验中比較重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白给对人 iPS细胞的粘附效果所带来的影响时的、细胞的粘附形态的图。图M的比例尺条为250 μ m图25所示为仳较重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白对形成人iPS细胞的 集落的效果的集落检测的结果的图。图25的上段为“单个”的结果下段为“团塊”的结果。图26A所示为对于在重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白上由单个细胞所 形成的人iPS细胞的集落是否维持有未分化性进行研究的結果的图图26A为以“单个”进 行集落检测时的免疫染色的结果，比例尺条为250 μ m图26B所示为对于在重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白上甴细胞块所形 成的人iPS细胞的集落是否维持有未分化性进行研究的结果的图。图26B为在“团块”上 进行集落检测时的免疫染色的结果比例尺條为250 μ m。图27所示为对在重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白上所形成的人iPS细 胞进行长期传代养时的、养5周的人iPS细胞的形态的图就各个胞外基质而言，比例 尺条在左侧为1mm比例尺条在右侧为100 μ m。图28所示为对在重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白的存在下养人iPS 细胞时的、各种未分化标记的表达进行研究的结果的图图四所示为对在重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白的存在下养的人 iPS细胞进行分化诱导时嘚、人iPS细胞的形态的图。图四的比例尺条为1mm图30所示为对在重组人层粘连蛋白-5和各种胞外基质蛋白的存在下养的人 iPS细胞进行分化诱导时的、各种分化标记的表达进行研究的结果的图。

以下基于实施方式详细说明本发明的详细内容以及其他特征和优点。1.增殖多能性干细胞的方法本发明提供一种增殖多能性干细胞的方法本发明的方法包括在不含有支持细胞和血清的养基中、且在含有层粘连蛋白-5的体系中养该哆能性干细胞的工序。多能件干细胞本发明中所述“多能性干细胞”是指具有分化成所有组织的细胞的能力(分化 多能性)的干细胞的总称。在本说明书的后述实施例中使用ES细胞进行了研究能通过 本发明的方法增殖的多能性干细胞，不仅限于胚胎干细胞还包括来源于哺乳動物的成体 脏器或组织的细胞、骨髓细胞、血液细胞、以及胚或胎儿的细胞等的、具有与胚胎干细胞类 似的性状的所有多能性干细胞。此種情况下所述与胚胎干细胞类似的性状，可定义为胚 胎干细胞中特异的表面(抗原)标记的存在或胚胎干细胞特异的基因的表达、或畸胎瘤 (teratoma)形成能力等胚胎干细胞所具有的特异的细胞生物学性质并非对其进行限定，作为能够通过本发明的方法增殖的细胞的具体例可列举出 唎如，胚胎干细胞(ES细胞)、诱导多能性干细胞(iPS细胞)、胚胎生殖干细胞(EG细胞)、 种系干细胞(GS细胞)等另外，作为本发明的多能性干细胞优选ES细胞囷iPS细胞根 据不构成伦理性的问题等的理由，特别优选iPS细胞本说明书的“ES细胞”，是指取得处于发育初期的、具有分化成构成个体的所囿 组织细胞的能力的多能性干细胞并株化后的、能够在体外养的细胞ES细胞与初期胚中 的多能性干细胞同样也能够在保持分化成构成个体嘚所有细胞的能力的状态下实际上无 Sci. USA 养从胚泡分离的ICM而建立了这些ES细胞株。在其他最近的研究中显示通过将胚和成 熟哺乳动物细胞来源嘚核移植到去核卵母细胞中能够获得胚和胚性细胞。2006 年Advanced Cell Technology 公司的 Robert Lanza 等的研究小组，在小 鼠和人的胚盘中仅使用胚泡期以前的卵裂期的胚的單卵裂球，在不损害胚的发育能力的 前提下成功地建立了 ES M，2006)。由此因不孕而在治疗中被废弃的过剩的卵能够得以使用。此外2004年芝加哥生殖遗传学研究所的Yury Verlinsky等的研究小组成功地 从具有遗传病的人的胚建立20个ES细胞株。这些是可在深刻的遗传病的治疗研究中使用 的最初的ES細胞Yury Verlinsky现在还保有另外的基因不同的200株以上的ES细胞，这些可在药品的筛选(分选)等中使用本发明的方法中能够使用任意建立的ES细胞株。有時为了防止将通过本发明的 方法制成的ES细胞适用在个体时的免疫排斥反应，使用个体的体细胞制成克隆胚(clone embryos)再依此建立ES细胞株的方法是有效的只要使用该方法，就能够建立与个体具有 同一遗传要素的ES细胞有时，在制作体细胞克隆时被导入到卵子的体细胞的核变成与受精卵的核类似的 状态认为发生了称之为“再编程(r印rogramming)”的现象。据报道ES细胞具有与卵子 所具备的此种活性类似的活性(Curr. Biol.，11，2001)即，通过将個体的体细 胞和ES细胞融合可期待将体细胞变换成ES细胞这样的细胞。由于ES细胞能够在体外进 行基因操作因此通过在预先操作了 MHC基因组等與免疫排斥相关的因子的ES细胞中进行 上述操作，可以期待不使用制作体细胞克隆胚等的手法来回避排斥反应本发明中，“ES细胞”优选为囚的ES细胞现在，已建立的人ES细胞株可从例如京 都大学再生医科学研究所获得或者，ES细胞还可根据本说明书中上述各种文献的记载来制嘚本说明书的“iPS细胞”是指，通过向体细胞中导入0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc等 转录因子的基因而获得的、具有与ES细胞类似的分化多能性的细胞因此，iPS细胞也与 ES细胞同样能够在保持分化多能性的状态下无限制地增殖。京都大学山中伸弥等的研究小组为了仅分离出从体细胞变化成ES样细胞嘚细 胞，而着眼于仅在ES细胞中表达、而在维持ES细胞的分化多能性方面非必要的1^x15这一 基因使用同源重组技术在该基因部位导入新霉素耐性基因，在养基中添加因该耐性基 因而不显示出毒性的G418从而构建出仅使表达Fbxl5的ES样细胞获得G418耐性且留存 下来而通常未表达 ^χ15的体细胞死灭的實验体系。使用该实验体系建立iPS细胞时发 现采用 0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc4 基因就足够了(Cell. 126，663-6722006)。此外该研究小组还使用了与小鼠iPS细胞建立中所使用的小鼠基因同源的人 基因即0CT3/4、S0X2、KLF4、C-MYC，成功地从成纤维细胞建立了人iPS细胞(Cell. 131 861-872,2007)。同时世界上首次建立人ES细胞的詹姆斯·汤姆森(James Thomson)等的研究 小组使用了與京都大学山中伸弥等成功建立小鼠iPS细胞时相同的战略，通过向胎儿肺来 源的成纤维细胞或新生儿包皮来源的成纤维细胞中导入0CT3/4、S0X2、NANOG, LIN28这四 種在人ES细胞中特异地表达的基因成功地建立了人iPS细胞(Science 318:， 2007)此外，2007年12月京都大学山中伸弥等的研究小组表示，不导入c-Myc的基因而 仅通过Oct-4、Sox2、Klf4三个因子也能够建立小鼠和人的iPS细胞成功地抑制了 iPS细 胞变化成癌细胞(Nat. Biotechnol.沈101_106，2008)几乎与此同时，在马萨诸塞工科大 学的鲁道夫·詹尼士(Rudolf Jaenisch)等嘚研究小组也成功地以小鼠完成了同样的实验 (Cell Stem Cell 2:10-12,2008)另外，为了回避致癌等风险作出了进一步减少导入的因子的尝试。其结果Max Planck研究所的汉斯 斯科勒(Hans R Scholer)等在成体小鼠的神经干细胞中导入2 个基因即0ct4和Klf4、或者0ct4和c-Myc中的任意一组，从而成功地建立了 3568-574，2008)报道显示，通过利用BIX、BayK这些低分孓仅在小鼠 胚胎性成纤维细胞中导入0ct4和Klf4两个基因就能够诱导iPS细胞。此外在诱导iPS细胞时作出了改善基因导入方法的尝试。现在广泛使用嘚是反 转录病毒这样的、导入的基因整合到染色体的可能性高的病毒据报道有使用整合的可能 性低的腺病毒(Science 322，945-9492008)、质粒载体(Science 322，949-9532008)的 方法。本发明中“ iPS细胞”优选为人的iPS细胞，现在所建立的人iPS细胞株，可从例 如京都大学、理化学研究所生物资源中心获得或者，也可参栲以下文献的记载制作iPS细胞例如，诱导多能性干细胞可按照 京都大学山中伸弥教授的研究小组的文献(Cell 131,861-872,

2007)中记载的方法来制作具体而言，iPS細胞可如下制作对任意的体细胞导入0ct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4、 Nanog,LIN28中的至少一个以上基因检测多能性干细胞的特异的基因或蛋白质的表达，以 对这些进行分選这样制作的iPS细胞，与ES细胞同样能够在失去增殖活性的小鼠成纤维细胞或 能够代替其的细胞存在下与碱性成纤维细胞生长因子一起进荇养，并与ES细胞同样能 够用作多能性干细胞到目前为止，已明确该iPS细胞在分化成各种组织的特征方面或在细胞内进行 基因表达的特征方媔具有与ES细胞同样的性状(Cell. 126,663-672,2006, Cell 131 861-8722007，Science318,2007)，可直接将ES细胞的养条件或从ES细胞分 化诱导各种组织的条件应用于iPS细胞(高桥和山中细胞工学，Vol. 27No.

2008)。本说奣书的“EG细胞”是指从原始生殖细胞制作的任意的胚胎生殖干细胞其起源 等没有特别的限制。此外本说明书中的“GS细胞”，是从精巢嘚生殖细胞制作的种系干细胞其是为了 能够在体外养精原干细胞(精子干细胞)而制成的细胞株(Cell. 119，04) GS细胞中特别优选具有与ES细胞同样的性质苴具有分化多能性的mGS细胞(multipotent germline stem cell，多能种系干细胞)本说明书中记载为“GS细胞”的情况，根据上下 文可能意味着mGS细胞层粘连蛋白-5本发明的方法朂显著的特征为在养多能性干细胞时，在含有层粘连蛋白-5的 体系中养该多能性干细胞据报道，对于大多的细胞类型而言层粘连蛋白-5与包含其他层粘连蛋白亚型 的各种胞外基质蛋白相比表现出较强的粘附活性(J. Biochem.

如表1所示，层粘连蛋白-5为由α3链、β 3链、Y 2链构成的层粘连蛋白分孓 对表皮与真皮的结合发挥出核心的作用，在大部分的细胞中优先与整合蛋白(integrin) α 3β 1结合根据细胞还与整合蛋白α6β1、α6β4结合。已解奣层粘连蛋白_5的α 3链 G2结构域的α 3G2A序列(RERFNISTPAFRGCMKNLKKTS)、G3结构域的KRD序列为对整合蛋白 的主要的结合部位此外，据了解层粘连蛋白-5作为三聚体被分泌后，受到蛋白酶的限制性水解 (limited degradation)从而除去存在于α 3链C末端的G4和G5结构域，从190kDa (非 剪切型)转换为160kDa(剪切型)用通常的方法分离的层粘连蛋白-5不存在G4、G5结 構域。据了解这种α3链剪切型层粘连蛋白-5与非剪切型层粘连蛋白-5相比，具有高 的细胞粘附促进活性、运动促进活性、和神经再生促进活性(J. Biol. Chem. ,280(2005), )本发明的层粘连蛋白_5，没有特别的限制可以为含有G4和G5结构域状态的非剪 切型，或者也可为除去G4和G5结构域全部或部分的剪切型此外，层粘连蛋白-5蛋白质可以为天然型或者也可为保持其生物学的活性、尤 其是细胞粘附促进活性的状态下的、1个以上的氨基酸残基被修饰後的修饰型。此外本发 明的层粘连蛋白-5蛋白质只要具有本说明书记载的特征即可，其起源、制法等不受限制 即，本发明的层粘连蛋白-5疍白质可以为由天然产的蛋白质、通过基因工程的手法得到的 重组DNA所表达的蛋白质、或者化学合成蛋白质的任一种层粘连蛋白-5蛋白质的來源没有特别的限制，优选为人来源的蛋白质在为了获 得再生医疗材料等而养人多能性干细胞时，从避免使用来源于其他动物的材料的意义来 看优选使用人来源的层粘连蛋白_5。本说明书中的序列表的序列号1 6表示人层粘连蛋白-5的α 3链、β 3链和、2 链的碱基序列和氨基酸序列本发明中使用的层粘连蛋白-5蛋白质，优选为由下述的α 3 链、β 3链和Y 2链的各亚基构成的蛋白质所述α 3链为具有序列号2的氨基酸序列或 1354-No. 1529 禾P No.1530-No. 1713層粘连蛋白-5的各链为具有对应序列号表示的氨基酸序列中缺失、附加、或置换 1个以上的氨基酸残基的氨基酸序列。这种具有与天然的蛋白質同源的氨基酸序列的蛋白 质也可在本发明中使用在α 3链、β 3链和Y 2链的各氨基酸序列中，可变更的氨基酸数 并没有限定优选为1 300个氨基酸残基、1 200个氨基酸残基、1 150个氨基酸残基、 1 120个氨基酸残基、1 100个氨基酸残基、1 80个氨基酸残基、1 50个氨基酸残 基、1 30个氨基酸残基、1 20个氨基酸残基、1 15個氨基酸残基、1 10个氨基酸残基、1 5个氨基酸残基。更优选为能够通过公知的定点突变法修饰的数个氨基酸残基例 如，1 10个氨基酸残基、1 5个氨基酸残基众所周知，在本技术领域中通过进行氨基酸的保守置换能够获得保持原有功能的 蛋白质或多肽此种置换包括用具有类似的物悝化学特性的残基置换氨基酸，例如用其 他残基置换1个脂肪酸残基(Ile、Val、LeU或Ala)；或者在碱性残基Lys和Arg、酸性残基 Glu和Asp、酰胺残基Gln和Asn、羟基残基Ser和Tyr、或芳香族残基Phe和Tyr之间进行置换。此外本发明中使用的层粘连蛋白-5可以为与序列号2、4、6所记载的氨基酸序列 具有至少80 %、85 %、90 %、95 %、98 %或99 %的同源性，且能够促进细胞粘附活性的蛋白 质对层粘连蛋白-5与层粘连蛋白-1的构成亚基的结构进行比较时，各亚基间的氨基酸 序列的同源性为50%以丅尤其上述的α链的G结构域的同源性低，为约25%同源性通过相同残基的数目除以已知的序列或已知序列结构域中的残基的总 数再乘以100来計算。使用标准的参数来决定序列的同源性的计算机程序可利用例 如 Gapped BLAS T PSI-BLAST(Nucleic Acids Res. 25，1997)、BLAST(J. Mol. Biol. 215 :403-410,1990)、和 Smith-Waterman (J. Mol. Biol. 147 :195-197,1981)。优选使 用这些程序的默认设定但可根据要求改变这些设定。本发明的层粘连蛋白-5蛋白质除了具有本说明书记载的特征外其起源、制法等 不受限制。即本发明的层粘连蛋白-5蛋白质可以为汾泌层粘连蛋白-5的人或动物细胞 的养液上清、或从该养上清纯化得到的天然型层粘连蛋白-5蛋白质。然而通过使用本 技术领域中已知的重组DNA技术来表达各亚基从而能够有效地制造作为基因重组蛋白质 的层粘连蛋白_5然而从避免不必要的动物性因子的意义出发，特别优选获得的層粘连蛋 白-5为人重组蛋白质基于包含编码层粘连蛋白-5 α 3链的序列号1的核酸残基No. I-No. 5139的DNA 序列、编码β 3链的序列号3的核酸残基No. 121-Νο. 3630及编码、2链的序列号5的核酸 残基No. 118-Νο. 3696的碱基序列来设计引物，以适当的cDNA文库作为模板通过聚合酶链 反应(PCR)扩增目标序列，从而可以制造层粘连蛋白_5此種PCR手法为本技术领域中所 广泛知晓的手法，记载于例如“PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications， Academic Press, Michael, et al.,1990，。将编码层粘连蛋白-5的各链基因的DNA引入适当的载体中使用可在各种宿主中 表达的表达载体将其导入真核生物或原核生物细胞的任一者中，使其表达各个链从而得 到所期望的蛋白质。能够用于表达层粘连疍白-5的宿主细胞没有特别的限制，可列举出 大肠杆菌、枯草杆菌等原核宿主细胞以及酵母、真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等真核生粅 宿主。另外特别优选以下述的实施例中所使用的人胎儿肾细胞株HEK293作为宿主细胞。通过转化、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、基洇枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微 注射(direct microinjection)等能够将为表达层粘连蛋白_5而构建的载体导入上述宿 主细胞中使含有载体的细胞在适当的养基中苼长，产生本发明中使用的层粘连蛋白-5 蛋白质从细胞或养基中纯化，从而获得层粘连蛋白-5蛋白质纯化通过使用尺寸排 阻色谱法(size exclusion chromatography)、HPLC、离孓交换色谱法、和免疫亲和色谱法 (immunoaffinity chromatography) ^jftiH^T °

对于层粘连蛋白-5，在日本特开中有详细的记载援引于本说明书中。增殖多能件干细胞的方法本发明Φ在含有层粘连蛋白-5的体系中养多能性干细胞。本发明中“含有 层粘连蛋白-5的体系”是指在多能性干细胞的养体系中以任意的状态含囿层粘连蛋 白-5，其方式没有特别的限制本发明中，为了在含有层粘连蛋白-5的体系中养多能性干细胞优选的方式为 使用用层粘连蛋白-5处悝后的养容器。但并非限定于此本发明的“含有层粘连蛋白-5 的体系”还包括为了养多能性干细胞而在养基中添加层粘连蛋白-5的方式等。此外本发明中“用层粘连蛋白-5处理后的养容器”，是指对其表面实施层粘连 蛋白-5包被等处理的养容器此外本发明的“养容器”，没有特别的限制为了防止细 菌的混入可使用灭菌处理后的、且适合于养细胞的任意材料、任意形状的容器。作为此种 养容器的例子可列举絀本技术领域中一般使用的养皿、养烧瓶、养盘、96孔板、48 孔板、12孔板、6孔板、4孔板等养板、养瓶等，但并不限定于此对养容器的表面用層 粘连蛋白包被的处理技术，为本技术领域公知的技术本领域技术人员，可根据本发明的目 的而采用任意的养容器并将该容器用层粘连疍白-5进行处理使用层粘连蛋白-5处理 后的该容器用于通过本发明的方法养多能性干细胞。处理养容器时所使用的层粘连蛋白-5的量没有特別的限制。优选的是在以 0. 05 μ g/ml以上、优选0. 5 15 μ g/ml、更优选3. 75 μ g/ml 15 μ g/ml的层粘连蛋白_5 溶液进行处理时，能够获得良好的结果如本说明书中后述的下述實施例所述，本发明人等发现对于小鼠ES细胞，重组 人层粘连蛋白-5与Matrigel、层粘连蛋白混合物或其他胞外基质蛋白相比表现出较强的 粘附活性，从而完成了本发明此外，还发现本发明中能够用LIF和无血清养基用以重组 人层粘连蛋白-5包被后的养板在MEF非存在下维持养小鼠ES细胞在MEF非存在下 的小鼠ES细胞的养以往在用以明胶包被后的养板在胎牛血清(FBQ存在下进行。采 用本发明的方法进行养时小鼠ES细胞在不存在MEF和FBS的条件丅也能表现出与通常 法同等的增殖，进而还可以确认维持其未分化性此外，采用本发明的方法进行养时还 维持了其分化多能性。此外还进行了人iPS细胞的研究，结果如下述的实施例所示对于人iPS细胞，重 组人层粘连蛋白-5也表现出较强的粘附活性此外，用以重组人层粘連蛋白-5包被后的 养板养人iPS细胞时在无血清的条件下形成集落，从而能够进行维持养进而，通 过本发明的方法养的人iPS细胞维持了未分化性因此，本申请发明的方法包括在不含有支持细胞和血清的养基中养多能性细 胞的工序更优选在不含有人以外的动物性来源的物质的養基中进行养。关于人ES细胞过去作为代替MEF的支持材料，尝试了 Matrigel、纤连蛋白、层 粘连蛋白_1、1型胶原蛋白、4型胶原蛋白等多种胞外基质蛋白其粘附活性均为数％以下 (Stem Cell. 24,06)。本发明中通过在细胞粘附效率极差的、多能性干细胞， 例如人ES细胞或人iPS细胞的维持养中利用层粘连蛋白-5的較强的粘附活性能够改 善在MEF非存在下的粘附效率和增殖效率。此外为了将人ES细胞或人iPS细胞利用于再生医疗，作为构建完全不含有动物來源的物质的养体系的材料重组人层粘连蛋白-5是 有用的。这样本发明中，通过用层粘连蛋白-5进行处理多能性干细胞对养容器的细 胞粘附效率提高，即使不使用通常在多能性干细胞的养中所需的支持细胞也能够有效 地增殖该细胞。本说明书中的“支持细胞(饲养细胞)”是指为了达到使多能性干细胞发生增殖 或分化的目的而调整养条件时所使用的发挥辅助作用的其他细胞。在ES细胞、iPS细胞 等多能性细胞的凊况下采用以往的一般方法，使用小鼠来源的初代养成纤维细胞作为 支持细胞从而由该支持细胞向多能性细胞提供生长因子等营养物，因此使细胞的养成 为可能根据本发明，通过层粘连蛋白-5的强力的粘附效率即使不使用所述支持细胞，也 能够养ES细胞、iPS细胞等多能性幹细胞此外，本发明中“支持材料”是指为了辅助细胞的增殖而使用的蛋白质性的因子 本发明中使用层粘连蛋白-5作为支持材料。如下述的实施例中所示层粘连蛋白-5与各 种胞外基质相比，具有较高的粘附能力作为多能性干细胞的支持材料是优异的。此外本发明中多能性干细胞的“分化”，是指丧失具有分化成所有组织的潜在能 力即丧失分化多能性变成具有构成特定组织的细胞的性状。例如可通过測定Ecatl、ERaS、 Nanog, 0ct4、RexU Sox2, Utfl等多能性干细胞的未分化标记评价养中的多能性干细胞 是否未发生分化。如下述的实施例3、4所示评价由本发明的方法养的ES細胞的传代导 致的分化，结果显示进行10次以上传代养也未发生分化，保持了未分化状态此外，如 下述实施例5所示通过由本发明的方法养的ES细胞的传代评价了分化多能性的维持， 结果仍显示即使进行传代也维持了分化多能性。此外如下述实施例11所示，由本发明的方法养的人iPS细胞进行5周传代 养也未发生分化，保持了未分化状态此外，如下述实施例12所示对本发明养的人iPS 细胞还能够诱导分化。本发奣的一个方式中可通过在养容器的内部表面包被层粘连蛋白-5后进行 干燥等，用层粘连蛋白-5处理养容器在层粘连蛋白-5处理后的养容器中裝入在 GMEM、DMEM等多能性干细胞的养中一般使用的养基，在该养基中添加多能性干细胞 接着，在公知的适当的养条件下例如在37°C、5%二氧化碳氣相条件下等进行该多能性 干细胞的养，但这并非是进行限定本发明的优选的一个方式中，进一步优选除了含有层粘连蛋白-5的体系外，还 在养基中加入适当的添加物添加物优选为血清以外的添加物，更优选不含有人以外的 动物来源的物质并非对其进行限定，添加物嘚一个例子为血清替代品血清替代品是指，使其含有 与血清类似的成分而构成的人工的液体组合物通过添加该血清替代品，即使在血清不存 在的情况下也能够增殖细胞另外，作为血清替代品的一个例子可使用添加有各种氨基 酸、无机盐类、维生素、白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、抗氧化成分的血清替代品。各种氨基酸包 括例如甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺酸、L-谷氨酸、L-苯丙 血清替代品(KSR)为hvitrogen公司市售的ES细胞用血清替 代品。如下述实施例3和实施例4那样本发明的优选的方式为在养基中添加10%左右 的KSR，并在该养基中养多能性干细胞此外，使用下述实施例6所示组成的血清替代品也是本发明的优选方式实施例 6中公开了包含甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、丝氨酸、 苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸等氨基酸，硫胺素、抗坏血酸等维生素银、铝、钡、鎘、钴、 铬、锗、锰、硅、钒、钼、镍、铷、锡、锆等微量金属元素，溴、碘、和氟等卤素以及，白蛋白、还原 型谷胱甘肽、转铁蛋白、胰岛素、亚硒酸钠等成分的血清替代品的组成然而，构成本发明的 血清替代品的成分不限定于这些，可施加各种改变如用类似的其他成分置换等。此外血 清替代品所含有的各成分的含量也不限定为实施例6所记载的内容，可根据细胞的性质、 实验的目的而进行适当調整作为添加物，只要是与KSR同样的成分和发挥同样的功能的添加物即可2.层粘连蛋白-5作为细胞支持材料的用涂本发明还涉及层粘连蛋白-5莋为用于增殖多能性干细胞的细胞支持材料的用 途。如前所述那样层粘连蛋白-5由于在细胞粘附中具有强力的作用，因此在不含有支持 细胞和血清的养基中养多能性干细胞时层粘连蛋白-5是有用的3.多能性干细胞的养用试剂盒本发明进一步涉及包含用层粘连蛋白-5处理后的养容器和血清替代品的多能 性干细胞的养用试剂盒。血清替代品优选为KNOCKOUT 血清替代品(KSI )有时，也可 利用实施例6所示组成的血清替代品除此以外，该试剂盒可包含GMEM、DMEM等多能性干细胞的养用的养基并且， 若必要时该试剂盒还可进一步包含细胞养所需的其他添加物、应养的多能性幹细胞。 作为所述添加物的例子可列举出非必需氨基酸、丙酮酸钠、巯基乙醇或抗生素。可以此种 试剂盒作为1个包装体构成试剂盒或鍺也可仅将需要低温保存的多能性干细胞分开包装 从而制成的多个包装体形式的试剂盒。实施例以下基于实施例对本发明进行详细说明，本发明不受这些实施例的限制实施例1重组人层粘连蛋白_5(rLm5)的调制本实施例中按照公知的方法调制重组人层粘连蛋白-5蛋白质。将从导入了 α 3链(序列号1)、β 3链(序列号3)、Y 2链(序列号5)的cDNA 的人胎儿肾细胞株HEK293(Lm healthcare)共价结合有小鼠抗Lm-α 3 (抗层粘连蛋 白单克隆抗体(BG5)的抗体柱接着进行洗脱。另外單克隆抗体BG5为本发明人等用层粘连蛋白-α IBB链N末端片段为抗原按照公知的单克隆抗体制作方法制成的抗体。Hlyg的纯化rLm5在还原条件下变性后使鼡5 20 %凝胶通过SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳确认了 α 3链、β 3链、γ 2链的大小、纯度，结果可确认出分别为160kDa、135kDa、 105kDa的区带(band)图1中示出对纯化rLm5进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果的照 片。使用CS-Analyzer进行解析的结果纯化rLm5的纯度为约98%。在以下的实施例 中使用上述那样调制出的rLm5实施例2使用了小鼠ES细胞株EB3嘚粘附实验本实施例中示出了在使用各种细胞支持材料的情况下使用了小鼠ES细胞株EB3 发专业G6分子治疗学讲座干细胞控制领域提供的EB3细胞。粘附实验中使用了未添加FBS的与维持养基同样组成的无血清养基作为细 胞支持材料，使用牛明胶(SIGMA)、rLm5、Matrigel (注册商标BD)、人玻连蛋白(SIGMA)、 人IV型胶原蛋皛(BD)、人纤连蛋白(BD)、人层粘连蛋白-2 (Chemicon)及人层粘连蛋白 (SIGMA)。而且按下述那样制作用各种细胞支持材料进行处理后的养板，对各细胞支持 材料进行叻粘附实验用调整浓度后的各种胞外基质蛋白处理96孔板(Corning)，用1. 2 % BSA(SIGMA)溶液在37°C下封闭处理1小时将各种胞外基质蛋白的浓度调制成明胶 (Gl) 1. μ g/ml 的 3 个等級 的2倍稀释系列。用无血清养基洗涤EB3细胞后以30000个/孔接种到养板上，在37 °C、5 % C02、95%空气的气相条件下养30分钟及60分钟养后，用涡旋混合器(vortex mixer) 轻微振荡使粘附弱的细胞从养板表面浮起，用Percoll(GE healthcare)处理除去该细 胞将粘附的细胞用25%戊二醛(Nacalai)固定化，用2. 5%结晶紫(Nacalai)染色比较 相对细胞数。图2示出通過在养30分钟及60分钟后测定0D595来评价各种胞外基质蛋白给 EB3细胞的粘附所带来的影响的结果由图2的结果可知，rLm5与包括Lm-Mix在内的其他 各种胞外基质疍白相比表现出对EB3细胞较强的粘附活性。另外在粘附效率差的人ES细胞中，使用EHS来源层粘连蛋白时的粘附效率不足 1 %在现在最广泛使用嘚Matrigel (50 60 % EHS来源层粘连蛋白、30 % IV型胶原蛋白、 10%巢蛋白)中，粘附效率也只有3%在本实施例中，使用小鼠ES细胞时与以EHS层粘 连蛋白为主要构成成分的Matrigel、层粘连蛋白-2、大量含有层粘连蛋白-10/11的胎盘来 源的层粘连蛋白(Lm-Mix)相比，显示出更强的粘附活性这认为是本发明中使用的层粘连 蛋白-5的显著的效果。

实施例3使用了小鼠ES细胞株EB3的增殖检测本实施例中示出使用各种细胞支持材料时使用了小鼠ES细胞株EB3的增殖检测 的结果EB3细胞的维持养基使用与实施例2相同的养基。在增殖检测中使用添加了 10% KNOCKOUT 血清替代品(KSR) (Invitrogen)的养基(KSR-GMEM)来代替 10% FBS0 在用调整浓度后的各种胞外基质蛋白处理后的12孔板(NUNC)上以40000个/孔接种EB3 细胞。在37°C、5% C02、95%空气的气相条件下养2天后通过酶处理回收细胞，用计数 板计量细胞数再次，在用浓度调整后的各种胞外基质蛋皛处理后的12孔板上以40000个/孔 接种EB3细胞通过重复该操作，比较各种胞外基质对EB3细胞的增殖效果作为养基 验区内，使用预先以KSR-GMEM数次传代养而馴化的EB3细胞图3示出对在支持细胞的非存在下在维持养基⑶或KSR-GMEM(K)中养时各 种胞外基质给EB3细胞的增殖所带来的效果进行研究的结果。由图3的结果可确认在起 初的2 3次的传代中，K+Lm-Mix和K+Mg与其他实验区相比增殖迟缓。因此对于K+Lm-Mix和K+Mg以外的实验区进一步持续传代。对胞外基质在支持细 胞嘚非存在下对于EB3细胞的长期传代养时的细胞增殖所带来的效果进行了研究图4 示出理论上计算出最终细胞增殖为几倍的结果。由图4的结果鈳知rLm5表现出与以往作 为ES细胞的维持养体系而广泛使用的对照区(S+G1)同样的对于EB3细胞的增殖效果。图5示出在维持养的体系(S+G1)、rLm5的体系(K+Lm5)、及从rLm5恢复臸维 持养体系的体系(K+Lm5-4 — S+G1)中长期传代养的EB3细胞的形态如图5所示， K+Lm5的实验区的形态渐渐地变化为上皮细胞样当恢复至通常的维持养的体系時可确 认到(K+Lm5-4 — S+G1)再度形成集落。一般认为未分化的ES细胞形成集落由上述结果 得出如下启示通过在K+Lm5的实验条件下长期传代养，即使EB3细胞的形態变成上皮细 胞样也能够保持未分化性。实施例4未分化性标记的检测本实施例中对已知的小鼠ES细胞未分化标记Ecatl、ERas, Nanog、0ct4、RexU Sox2、Utfl的基因用RT-PCR来测萣这些未分化标记，从而研究了 rLm5是否对于EB3细胞 具有维持未分化性的效果使用TRIZOL (Invitrogen)从实施例3中传代10次以上而养的EB3细胞中提取 总RNA。提取后使用Thermo Script RT-PCR System(Invitrogen)通过逆转录反应合成 CDNA0以合成的cDNA为模板使用表2所示的引物进行PCR反应。各基因的变性反应在94°C 下进行30秒退火反应进行30秒，伸长反应在72°C下进荇20秒有关退火反应，Ecatl在 64°C的温度下进行Eras、0ct4、Utfl在61°C的温度下进行，Rexl在59°C的温度下进行 Nanog、Sox2在的温度下进行。图6示出在各养下对各种未分囮标记的表达进行研究的结果由该结果可 知，与通常能够维持的实验条件(S+G1)同样在rLm5包被且用KSR养的实验条件下 (K+Lm5-4,K+Lm5-2),EB3细胞也表达出所解析的所有未分化标记。此外可见，当恢复至通常的维持养的体系(K+Lm5-4 —S+G1)时这些未分化标记的表达恢复至与用通常的维持 养体系(S+G1)持续养时没有区别的程度。综上得出如下启示即使用K+Lm5传代养 10次以上EB3细胞也能够维持未分化性。表2 RT-PCR 2O)Gapdh5-CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3，(序列号 21)5-GACGGACACATTGGGGGTAG-3，(序列号 22)实施例5分化成3胚层系的分化能力的研究本实施例中示出对使用各种细胞支持材料养小鼠细胞株EB3时的分化能力的 维持进行研究的结果在实施例3中添加了 KSR的无血清条件化下养EB3细胞后，在维持养(S+G1) 的条件下进一步传代5次在血清条件下重新驯化后，进行分化诱导试验作为无血清 养基中的养条件，使用了明胶包被养板的体系(K+G1)和重组人层粘连蛋白-5 包被养板的体系(K+Lm5-4、K+Lm5-2)将它们在血清条件下驯化后的实验区标记为 K + Gl^S + GKK+ Lm5 - 4^S + GKK + Lm5 - 2与S + GL分化诱导按以下步骤进行。在不含LIF(ESGRO)的维持養基中悬浮细胞制作 1000个/滴的悬滴，2天形成胚状体将所形成的胚状体转移到细菌养板中，在不含有LIF的维持养基中进一步悬浮养5天此时嘚胚状体的状态如图7所示。将悬浮养的胚状体转移到用lmg/ml的Gl包被后的腔室玻片(chamber slide) (NUNC)上粘附养3天后用免疫染色检测分化标记，对ES细胞的分化能力(姠内胚层系、 中胚层系、外胚层系的细胞的分化)进行了研究此时，作为内胚层系的细胞的标记使用甲胎蛋白(AFP)作为中胚层系的细胞 的标記使用α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)，作为外胚层系的细胞的标记使用β_ΙΙΙ微 管蛋白(tubulin)免疫染色如下实施用4%甲醛将细胞固定化后，用添加了 0.1% Triton-XlOO(Nacalai)的5% FBS溶液进行封闭封闭后，用第一抗体和第二抗体处理进 一步进行 DAPI (Nacalai)染色，用 VECTASHIELD (VECTOR Laboratories)封片并用荧光显微 镜进行观察从而检测标记的表达。作为免疫染色中的第一抗体在检测甲胎蛋白时使用抗AFP多克隆抗体(DAKO)； 是用LIF存在下的通常的维持养体系(S+G1)进行养，同样地进行免疫染色有关4个实验区礻出了 在进行分化诱导操作的实验区和未进行分化诱导操作的 阴性对照的实验区之间，比较作为分化标记的AFP、α-SMA、β-III微管蛋白的表达的结 果(图8 图11)另外，图8表示S+G1的实验区的结果图9表示K + G1= S + Gl 的实验区的结果，图10表示K + Lm5 - 4=^S + Gl的实验区的结果图Ii表示 K + Lm5 - 2=>S + Gl的实验区的结果。其结果在所有的实驗区中，进行分化诱导操作的实验区全部确认到AFP、α-SMA、 β -III微管蛋白3个信号(图8下段、图9下段、图10下段、图11下段)另一方面，用通 常的维持养體系养的阴性对照的实验区并未确认到AFP、α -SMA、β -III微管蛋白3个 信号细胞分化的诱导并未发生(图8上段、图9上段、图10上段、图11上段)。该结果意菋着通过一系列的分化诱导操作起初可诱导细胞的分化EB 3细胞成为 表达AFP、α SMA, β -III微管蛋白等标记的3胚层系的分化细胞。由实施例4的结果和本 實施例的结果可得到如下启示用Lm5维持的ES细胞在维持未分化状态的同时还可维持 通过诱导而分化成多种细胞的分化多能性。实施例6与KSR不同嘚其他组成的血清替代品的调制调制出与上述的KSR不同的其他组成的血清替代品本实施例的血清替代品的组 成如表3所示。表3成分已知的血清替代品的组成甘氨酸(Nacalai)150mg/l组氨酸(Nacalai)940mg/l异亮氨酸(Nacalai)3400mg/l

其成为3倍浓度调制成3倍浓缩氨基酸溶液。在该3倍浓缩氨基酸溶液中加入构成3倍 浓度所需用量的硫胺素、抗坏血酸、还原型谷胱甘肽以该溶液为溶液A。接着在蒸馏水 中溶解人转铁蛋白和BSA使其成为2倍浓度，调制成2倍浓缩BSA溶液以该溶液为溶液B。进而在蒸馏水中溶解所需用量的亚硒酸钠调制成7%亚硒酸钠溶液。以该溶液为溶液

C在所调制的溶液A、B、C中添加牛胰岛素溶液(SIGMA)囷微量金属元素，调制成本实施例 的血清替代品另外这里所添加的微量金属元素为组成已知的市售的！"race ElementB和 C(Mediatech Inc. ) 0本实施例中调制出的血清替代品并非市售品，只是组成已知^MM 7 #用添力D有t施彻丨6阶血清替代品的养某的研究本实施例中，在GMEM中添加实施例6中所调制出的血清替代品作为与KSR哃样的 血清代替物将其作为维持养基用于小鼠ES细胞的养。以下以这样调制出的养基为 养基Y然后，使用养基Y按照实施例3进行了增殖检測。进而按照实施例4进行了 未分化标记的检测进而按照实施例5进行了分化成3胚层系的分化能力的研究。(1)增殖检测使用了养基Y的增殖检测嘚结果如图12所示使用养基Y作为维持养基， 除此以外完全与实施例3同样地进行了实验。由使用了小鼠ES细胞株EB3的增殖检测的 结果可知以rLm5包被后用养基Y进行养的实验区(Y+Lm5-4、Y+Lm5_2)显示出对小鼠 ES细胞的增殖效果。此外与使用其他胞外基质(Gl、Lm-Mix、Mg)的实验区相比，使用Lm5 的情况可确认到更好嘚增殖(2)未分化标记的检测进行上述的增殖检测后，通过RT-PCR对各实验区的未分化标记的表达进行了研 究使用养基Y作为维持养基，除此以外完全与实施例4同样地进行了实验。与实施 例4同样地检测7种未分化标记的结果如图13所示即使在使用养基Y养小鼠ES细 胞的情况下，以rLm5包被的實验区(Y+Lm5)也确认到所有的未分化标记的表达由此得出 如下启示即使使用养基Y对rLm5的体系传代养10次以上，EB3细胞也能够维持未分 化性(3)分化成3胚層系的分化能力的研究此外，使用养基Y作为维持养基除此以外，通过与实施例5完全相同的方法 进行了分化诱导试验进行了分化诱导操莋的所有的实验区，均形成了与对照区(S+G1)形

进行分化诱导操作的实验区(下段LIF-)与未进行分化诱导操作的阴性对照的实验区(上 段，LIF+)之间检测分囮标记表达的结果由图15 图21的下段(LIF-)可见，有关在分化诱导后进行免疫染色的体系所 有的实验区中AFP、α-SMA、β-III微管蛋白3个标记均完全表达。叧一方面由图15 图21的上段(LIF+)可见，未进行分化诱导的用通常的维持养体系养的阴性对照的实 验区未出现AFP、α-SMA、β-III微管蛋白的表达，细胞的汾化的诱导并未发生由以上得出如下启示在使用养基Y时rLm5也能够维持小鼠ES细胞的增殖，同 时所增殖的小鼠ES细胞保持未分化性由此可见，rLm5茬不存在饲养细胞和血清的条件 下能够成为小鼠ES细胞的有用的支持材料

养试验的结果。作为细胞支持材料使用了 Gl、Lm5、Lm2、Vn、Co及而。而且按下述那样制作用各 种细胞支持材料进行处理后的6孔板(Falcon)对各细胞支持材料进行了集落检测。作为 维持养基使用实施例8所述的MEF-CM。将各种胞外基质蛋白的浓度调制成Gl lmg/ml、Lm5 2 μ g/ml、Lm2 30 μ g/ml、Co 30 μ g/ml> Fn 30 μ g/ml> Vn 10 μ g/ml本实施例中仅对人iPS细胞的“团块”的状态进行了检测。细胞以1周1次用各 种胞外基质处理全蔀细胞的九分之一重播种到新准备的6孔板中。细胞在37°C、5% CO2, 95%空气的气相条件下养5周养5周后的细胞的形态如图27所示。

其结果为在所研究嘚各种胞外基质蛋白的实验区中，在传代后养1周时观察 到与阳性对照即SNL饲养细胞(Fd)的实验区同等程度的细胞增殖如图27所示，在养5 周后也观察到该倾向由该结果可知，rLm5能够维持与Fd大致同等的人iPS细胞的增殖 另外，Lm2在养中并未确认到集落形成实施例11人iPS细胞的未分化标记的检測本实施例中，对已知的人多能性干细胞的未分化标记NANOG、0CT4、S0X2的基因通 过RT-PCR检测上述未分化标记从而对rLm5对于人iPS细胞是否具有维持未分化性的效 果进行了研究。使用TRIZOL(Invitrogen)从实施例10中传代养5周后的人iPS细胞提取总 RNA提取后，使用Hiermo Script RT-PCR System Qnvitrogen)通过逆转录反应合成了 cDNA以所合成的cDNA为模板使用表4所示的引粅进行了 PCR反应。各基因的变性反应在 94°C下进行10秒退火反应进行15秒，伸长反应在72°C进行30秒有关退火反应，0CT4 30)RT-PCR的结果如图观所示在所有的實验区确认到所研究的3个因子的表达。 由此得到启示使用rLm5作为细胞支持材料养人iPS细胞时人iPS细胞维持了未分化性。实施例12人iPS细胞的分化诱導试验本实施例中示出对使用各种细胞支持材料养人iPS细胞时的分化能力的维持 进行研究的结果通过RT-PCR从诱导分化后的人iPS细胞检测分化标记，从而对使用各种 细胞支持材料所养的人iPS细胞是否能够维持分化能力进行了研究在实施例10中养3周后、即第3次传代时收集一部分细胞，使鼡其进行了分化 诱导试验分化诱导按以下步骤进行。在DMEM/F12中添加20% KSR、2mM谷氨酰胺、1 %非必需氨基酸及1(Γ4Μ 2-巯基乙 醇调制成养基将养中的人iPS细胞從养板剥离而制作“团块”，使用低吸附养板 (NUNC)在该养基中对上述团块”悬浮养8天将由此所形成的胚状体重新播种到以lmg/ml的Gl包被的6孔板(Falcon)中，進一步粘附养8天粘附养后的细胞的形态如图四所示。在不存在bFGF的养基中进行分化诱导 后的细胞中混杂有各种形态的细胞这意味着细胞發生了分化。这里的细胞形态与图27那 样的在bFGF存在下进行通常的维持养时是明显不同的从进行分化诱导操作后的人iPS细胞，按照与实施例11相哃的步骤进行RNA提 取和cDNA合成，以所合成的cDNA为模板使用表5所示的引物进行PCR反应。作为内胚 层标记使用S0X17和AFP ；作为中胚层标记，使用BRACHYURY和MSXl ；作為外胚层标记使 用PAX6 度下进行。此外仅⑶X2的伸长反应在72°C下进行15秒。RT-PCR的结果如图30所示在rLm5的实验区确认到与阳性对照即Fd的实验区 同样地表达了所研究的全部6个因子。由此得到以下启示rLm5对人iPS细胞具有维持分 化多能性的效果另一方面可知，在rLm5以外的几个胞外基质(Vn、Co等)的实验區中胚 40)CDX25，-GCAGAGCAAAGGAGAGGAAA-3(序列号 41)5，-CAGGGACAGAGCCAGACACT-3(序列号 42)本发明通过在含有胞外基质分子中的层粘连蛋白-5的体系中进行养，即使不 使用支持细胞和血清也能够使哆能性干细胞以未分化状态进行增殖。根据本发明的方法 不使用支持细胞、血清等动物来源的材料也能够养多能性干细胞，因此不存在免疫排斥、病毒感染等的危险性人来源的多能性干细胞根据其分化全能性具有作为再生医疗的细胞 材料的较大的利用可能性，尤其人诱導多能性干细胞(iPS细胞)不存在伦理性的问题并 且由于能够从患者本人的细胞来进行调制因而不存在免疫排斥的问题。[序列表自由文本]〈序列号1>序列号1表示人层粘连蛋白α 3链的碱基序列〈序列号2>序列号2表示人层粘连蛋白α 3链的氨基酸序列。〈序列号3>序列号3表示人层粘连蛋白β 3链的碱基序列〈序列号4>序列号4表示人层粘连蛋白β 3链的氨基酸序列。〈序列号5>序列号5表示人层粘连蛋白Y 2链的碱基序列〈序列号6>序列號6表示人层粘连蛋白Y 2链的氨基酸序列。〈序列号7_22>序列号7-22表示用于检测ES细胞的未分化性标记的、RT-PCR用引物的碱基序列〈序列号23-30〉序列号23-30表示鼡于检测人iPS细胞的未分化性标记的、RT-PCR用引物的碱基 序列。〈序列号31-42>序列号31-42表示用于检测人iPS细胞的分化标记的、RT-PCR用引物的碱基序列[序列表]

權利要求 1.一种增殖多能性干细胞的方法，所述方法包括在不含有支持细胞和血清的养基 中、且在含有层粘连蛋白-5的体系中养该多能性干细胞的工序

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能性干细胞为诱导多能性干细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法其中，所述诱导多能性干细胞为人的诱导多能性干 细胞

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能性干细胞为选自由胚胎干细胞、胚胎生 殖干细胞和种系干細胞组成的组中的细胞。

5.根据权利要求4所述的方法其中，所述多能性干细胞为胚胎干细胞

6.根据权利要求1 5中任一项所述的方法，其中茬养基中含有血清替代品。

7.根据权利要求6所述的方法其中，所述血清替代品含有选自由甘氨酸、组氨酸、异 亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、羟基脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、和缬氨酸 组成的组中的1种或多种氨基酸；由硫胺素和/或抗坏血酸组成的维生素；选自由银、铝、 钡、镉、钴、铬、锗、锰、硅、钒、钼、镍、铷、锡和锆组成的组中的1种或多种微量金属元素；选 自由溴、碘和氟组荿的组中的1种或多种卤素；以及选自由白蛋白、还原型谷胱甘肽、转铁 蛋白、胰岛素和亚硒酸钠组成的组中的1种或多种成分

8.根据权利要求1 7中任一项所述的方法，在含有层粘连蛋白-5的基础上进一步含 有其他胞外基质蛋白的体系中养所述多能性干细胞

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述其他胞外基质蛋白为胶原蛋白。

10.根据权利要求1 9中任一项所述的方法其在用层粘连蛋白-5处理过的养容 器中养所述多能性干細胞。

11.根据权利要求10所述的方法其中，所述层粘连蛋白-5为人层粘连蛋白-5

12.根据权利要求1 11中任一项所述的方法，其中所述多能性干细胞茬养中不发 生分化。

13.层粘连蛋白-5作为用于增殖多能性干细胞的细胞支持材料的用途

14.一种多能性干细胞的养用试剂盒，其包含用层粘连蛋皛-5处理过的养容器和 血清替代品

全文摘要 为了在不使用支持细胞、血清等动物性材料的体系中有效地增殖多能性干细胞，本发明提供了┅种增殖多能性干细胞的方法其包括在不含有支持细胞和血清的养基中、且在含有层粘连蛋白-5的体系中养该多能性干细胞的工序。

保田尚孝, 宫崎香, 山田宗弘, 高桥和利 申请人:东方酵母工业株式会社, 国立大学法人京都大学