穿刺菌和甘油菌的区别冷冻保藏加穿刺菌和甘油菌的区别和菌液有先后顺序吗？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2023-08-04 02:39 标签： 穿刺菌和甘油菌的区别
准备材料：甘油保存菌种时，准备甘油、离心管、枪头的工具并消毒灭菌。 调配比例：根据菌种调配甘油，一般甘油和菌液的比例是20:80。 控制温度：根据冷藏时间使温度在零下20度或零下70度。 注意事项：严格控制温度。
1、准备材料
甘油保存菌种时，首先要根据需要保存的菌种，准备足够的甘油、离心管、枪头的工具，其中离心管要准备2ml容量大小，将准备好的工具放在121度的环境中消毒灭菌20分钟。
2、调配比例
根据菌种调配甘油，采用20%的甘油来保存菌种，那么甘油和菌液的比例就是20:80，菌种不同甘油的比例也不同，例如链球菌属保存时，除了甘油还需要少量的生理盐水制作保存液。
3、控制温度
将纯化后的菌种放入调配好的甘油保存液中，放在零下20度或者零下70度的环境中冷藏，温度不同保存的时间长短也不一样，零下20度的最多只能保存1年，而零下70度的保存时间为2-4年。
4、注意事项
甘油保存菌种时，必须要经过消毒灭菌，严格控制冷藏的环境温度，以免出现菌种死亡或者被污染，另外用来保存的菌种与标准菌菌株的特性不同，冷冻的降温速度要保持在1度/分钟。
　　
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2023-03-07 02:21生活知识生活百科菌种保存方法(微生物菌种保存方法概述)
文章插图
一、通行和保存方法
有些微生物经过冷冻或干燥处理后会很快死亡，所以在这种情况下，只能求助于继代培养和保存 。继代培养是定期转移菌种，培养后保存 。它是最基本的微生物保存方法，如酸奶等常用生产菌种的保存 。继代培养时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度要尽量降低 。培养温度通常略低于最适生长温度 。如果是产酸菌株，应在培养基中加入少量碳酸钙 。
一般大多数菌种的保存温度为5℃，厌氧菌、霍乱弧菌等微生物菌种和部分病原真菌可在37℃保存，而蘑菇等大型食用菌可直接在室温下保存 。虽然传代保存的方法简单，但其缺点也很明显，如:
(1)应变管卫生棉条往往容易发霉；
②该菌株的遗传性状容易变异；
③反复传代后，菌株的致病性、形成生理活性物质的能力和形成孢子的能力下降 。
④需要定期补种，工作量大；
⑤杂菌污染的机会很多 。
二、液体石蜡覆盖保存法
与前一种方法相比，这种方法可以更长时间地保存菌株，适用于霉菌、酵母菌、放线菌和好氧菌的保存 。这种方法可以通过限制氧气供应来防止干燥和削弱微生物代谢 。这种方法具有简单方便的优点，也适用于不适合冷冻干燥的微生物(如产孢能力低的丝状菌)的保存，而一些细菌如固氮菌、乳杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌和沙门氏菌，以及一些真菌如根霉、草青霉、毛霉和根霉不适合用这种方法保存 。
三、载体保存方法
即一种将微生物吸附在合适载体上进行干燥和保存的方法 。常用的方法包括以下几种，如:
①土壤保存法:主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保存 。方法是在灭菌后的土壤中加入菌液，在室温下立即干燥或使细菌繁殖，然后干燥，然后冷藏或在室温下密封保存 。原则上，要保存的土壤应为肥沃的可耕地，土壤应风干、粉碎、过筛、灭菌 。微生物在土壤中繁殖后干燥保存的方法是:取适量土壤(5g)，放入带棉塞的试管中，加水或充分稀释的液体培养基(含水量为土壤最大持水量的60%)，然后高压灭菌 。接种大量待保存的微生物，培养至肉眼能确认菌丝，移入干燥器，短时间干燥或风干，密封，冷藏或室温保存 。
②砂保存方法:取干净的砂，过筛除去大砂粒，用磁铁吸出砂中的铁屑，然后用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗数次，干燥后放入试管或安瓿中保持2 ~ 3 cm深，然后干热灭菌，加入1mL菌种培养液，充分混合后放入真空空干燥器中 。也可以将两部分水洗砂(用盐酸预处理)和一部分贫瘠过筛的黄土混合、灭菌后保存 。
③硅胶保存方法:用6 ~ 16目无色硅胶代替沙子，干热灭菌，然后加入菌液 。加入菌液时，由于硅胶的吸附热往往会升高温度，所以要尽量冷却 。
④磁珠保存法:将菌液浸入烧结磁珠(或多孔玻璃珠)中后进行干燥保存的方法 。用1/2管高硅胶(或无水硫酸钙)填充螺旋口腔试管，铺玻璃棉，然后放入10 ~ 20个磁珠，干热灭菌后，接种菌悬液，最后冷藏，室温保存或减压干燥，然后密封保存 。这种方法对酵母特别是根瘤菌非常有效，可以保存长达两年半 。
⑤麸皮保存方法:在麸皮中加入60%的水，灭菌后接种培养，最后干燥保存 。
⑥纸(滤纸)的保存方法:将消毒后的纸浸入培养液或菌悬液中，常压或减压干燥，放入装有干燥剂的容器中保存 。
四.悬浮保存法
即使微生物悬浮在适当的溶液中 。常用的方法有:
①蒸馏水保存法:适用于霉菌、酵母菌和大多数放线菌，其菌体悬浮于蒸馏水中，可在室温下保存数年 。这个规律要注意避免水分蒸发 。
②糖液保存法:适用于酵母，如将其菌体悬浮于10%蔗糖溶液中，然后置于避寒避光处保存，最长可保存10年 。此外，缓冲溶液或盐溶液也可用于储存 。
动词 （verb的缩写）宿主保存方法
也就是微生物入侵宿主后的保存方法 。用于目前无法在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次体、螺旋体等 。它们必须在活的动物、昆虫和鸡胚中被感染和传代 。这种方法相当于一般微生物的传代培养和保存方法 。病毒和其他微生物也可以通过其他方法保存，如液氮保存和冷冻干燥保存 。【微生物菌种保存方法汇总 菌种保藏方法】不及物动词冷冻保存方法
适用于抗冻性强的微生物 。这些微生物可以在细胞外冷冻而不会受到损伤，而对于大多数其他微生物来说，在细胞外或细胞内冷冻会对细胞造成损伤 。采用这种保存方法时，应注意以下几点:
(1)选择适合冷冻干燥的菌龄细胞 。
②选择合适的培养基，因为随着培养基成分的变化，某些微生物的抗冻性往往表现出很大的差异 。
③选择合适的菌种浓度，菌种浓度越高，成活率越高，保质期越长 。
④最好不要添加电解质(如盐等) 。)注入细菌溶液中 。
⑤菌液中可加入甘油等保护剂，防止冷冻过程中大量细菌死亡的现象 。同样，也可以加入各种保护效果好的溶剂，如糖、去纤维血、脱脂奶等，但对于某些微生物，不加保护剂效果更好 。
⑥原则上应尽快进行冷冻处理，但加入保护剂后，可静置一段时间再进行处理 。
⑦就动物细胞而言，应在-20℃范围内，以1℃/min左右的速度缓慢降温，然后必须尽快降至保存温度；对于绝大多数微生物来说，这是没有必要的 。例如，结构复杂的原生动物可以在-35℃范围内缓慢冷却，而噬菌体必须通过上述两阶段方法冷冻 。
⑧如果长时间存放，存放温度越低越好 。
⑨取冷冻菌种时，应采取快速融化措施，即在35 ~ 40℃的温水中轻轻摇晃，使其快速融化 。就厌氧菌而言，应选择静置和融化的措施 。冷冻的细菌融化时，要尽量避免再次冷冻，否则细菌的存活率会明显下降 。
常用的冷冻保存方法包括:
①低温冰箱保存方法(-20℃、-50℃或-85℃):
冷冻保存时使用螺旋口试管方便，棉塞试管外还可包裹塑料薄膜 。菌液在储存过程中用量不宜过多，有的可加入保护剂 。另外，φ5mm的玻璃珠也可以用来吸附菌液，然后将玻璃珠放入塑料容器中，再放入低温冰箱保存 。
②干冰保存法(-70℃左右):
即将菌种管插入干冰中，然后放入冰箱冷冻保存；
③液氮保存法(-196℃):
它是应用最广泛的微生物保存方法 。
操作步骤如下:
A.装瓶管:用尽可能厚的细菌悬浮在含有适当防冻剂的灭菌溶液中(保存霉菌不需要防冻剂)，然后将此溶液分装于安瓿中0.2 ~ 1 ml，或直接接种于装有分散剂的安瓿中，或直接将菌丝体琼脂块悬浮于分散剂中 。
B.熔封封封瓶管:如果直接储存在气态液氮(-150℃ ~-170℃)中，则不需要熔封 。
C.检查安瓿管是否熔合良好:将熔合的安瓿管浸泡在4℃合适的颜料溶液中2 ~ 30分钟，然后观察颜料是否进入安瓿 。
d、缓冷:将熔封好的封瓶管放入小罐中，然后用液氮以1℃/min左右的速度冷却至-25℃左右，或放入-20℃ ~-25℃的冰箱中缓慢冷却30 ~ 60 min 。
e、快速冷却:最后浸入液氮中，快速冷却至-196℃ 。
七、冷冻干燥保存方法
原理是先冷冻微生物，然后减压升华除去水分 。事实上，细菌去除大部分水分后，细胞的生理活动就会停止，从而达到长期维持生命状态的目的 。这种方法适用于大多数微生物种类(包括噬菌体和立克次体等)的保存 。).冷冻干燥过程中，应注意以下问题:
a、冻干前培养条件:首先检查菌种纯度 。一般来说，建议在营养丰富且易于富集的培养基上培养待保存的微生物 。细菌年龄应达到对数生长期 。如果是有孢子或孢子的微生物，最好在孢子和孢子形成后保存 。菌液的浓度要高，如菌液应达到109 ~ 109~1010个/毫升 。
B.菌株编号的标记等 。:可以在安瓿外面做标记，也可以把标签封在安瓿里面 。
c、安瓿的制备:将安瓿浸泡在2%HCl中过夜，用自来水冲洗3次，用蒸馏水刷洗，晾干，用棉塞塞住，贴上标签，干热灭菌或温灭菌后60℃烘干 。
D.添加保护剂:常用的保护剂有脱脂奶、12%蔗糖、普通肉汤加7.5%葡萄糖、血清加7.5%葡萄糖等 。甘油管保存法:在5mL菌种保存管中，将相同体积的菌悬液和40%甘油充分混合，然后放入-20℃的冰箱中保存 。
八、甘油管保存法
在5ml菌种储存管中，将相同体积的菌悬液和40%甘油充分混合，储存在-20℃的冰箱中 。
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　　菌种是主要的生物资源，也是食用菌生产首要的生产资料。一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低生产性能，能长期在生产中使用。因此，菌种保藏在食用菌生产上具有重要的意义。　　各种微生物由于遗传特性不同，因此适合采用的保藏方法也不一样。一种良好的有效保藏方法，首先应能保持原菌种的优良性状长期不变，同时还须考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。下面介绍几种常用的菌种保藏方法：　　（一）斜面低温保藏法　　将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。　　此法由于采用低温保藏，大大减缓了微生物的代谢繁殖速度，降低突变频率；同时也减少了培养基的水分蒸发，使其不至于干裂。该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。　　（二）石蜡油封藏法　　此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。　　由于液体石蜡阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而且又防止了水分挥发，使培养物不会干裂，因而能使保藏期达1～2年，或更长。这种方法操作简单，它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏效果较好，可保存几年，甚至长达10年。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。　　有试验指出，此法用于保藏红曲霉很合适，保藏1～2年后存活率为100％；也有报道显示，某些蕈菌菌丝用石蜡油保藏法，在3～6℃保藏时菌丝易于死亡，而在室温下反而较理想，这是值得注意的。　　（三）砂土管保藏法　　这是一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的放线菌、霉菌及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用。　　其制作方法是，先将砂与土分别洗净、烘干、过筛（一般砂用60目筛，土用120目筛），按砂与土的比例为（1～2）：1混匀，分装于小试管中，砂土的高度约1cm，以121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3次。50℃烘干后经检查无误后备用。也有只用砂或土作载体进行保藏的。需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养，再以无菌水制成108～1010个/ml菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰熔封管口（或用石蜡封口），置于干燥器中，在室温或4℃冰箱内保藏，后者效果更好。　　砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物移接方便，经济简便。它比石蜡油封藏法的保藏期长，约1～10年。中国科学院微生物研究所用砂土管保藏法保藏放线菌。　　（四）麸皮保藏法　　麸皮保藏法亦称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。其制作方法是按照不同菌种对水分要求的不同将麸皮与水以一定的比例1：（0.8～1.5）拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。　　此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。因操作简单，经济实惠，工厂较多采用。中国科学院微生物研究所采用麸皮保藏法保藏曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等，其保藏期可达数年至数十年。　　（五）甘油悬液保藏法　　此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温度若采用-20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可达10年。　　将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在10％～15％，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。基因工程菌常采用本法保藏。　　（六）冷冻真空干燥保藏法　　冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。　　由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。但该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。　　保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。　　（七）液氮超低温保藏法　　液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。美国ATCC菌种保藏中心采用该法时，把菌悬液或带菌丝的琼脂块经控制致冷速度，以每分钟下降1℃/min的速度从0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。如果降温速度过快，由于细胞内自由水来不及渗出胞外，形成冰晶就会损伤细胞。据研究认为降温的速度控制在（1～10）℃/min，细胞死亡率低；随着速度加快，死亡率则相应提高。　　液氮低温保藏的保护剂，一般是选择甘油、二甲基亚砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊环、吐温80等，但最常用的是甘油（10%～20%）。不同微生物要选择不同的保护剂，再通过试验加以确定保护剂的浓度，原则上是控制在不足以造成微生物致死的浓度。　　此法操作简便、高效、保藏期一般可达到15年以上，是目前被公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。除了少数对低温损伤敏感的微生物外，该法适用于各种微生物菌种的保藏，甚至连藻类、原生动物、支原体等都能用此法获得有效的保藏。此法的另一大优点是可使用各种培养形式的微生物进行保藏，无论是孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可采用该保藏法。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。　　要使用菌种时，从液氮罐中取出安瓿瓶，并迅速放到35～40℃温水中，使之冰冻熔化，以无菌操作打开安瓿瓶，移接到保藏前使用的同一种培养基斜面上进行培养。从液氮罐中取出安瓿瓶时速度要快，一般不超过1min，以防其他安瓿瓶升温而影响保藏质量。并且取样时一定要戴专用手套以防止意外爆炸和冻伤。　　（八）宿主保藏法　　此法适用于专性活细胞寄生微生物（如病毒、立克次氏体等）。它们只能寄生在活的动植物或其他微生物体内，故可针对宿主细胞的特性进行保存。如植物病毒可用植物幼叶的汁液与病毒混合，冷冻或干燥保存。噬菌体可以经过细菌培养扩大后，与培养基混合直接保存。动物病毒可直接用病毒感染适宜的脏器或体液，然后分装于试管中密封，低温保存。　　在上述的菌种保藏方法中，以斜面低温保藏法、石蜡油封藏法、宿主保藏法最为简便，砂土管保藏法、麸皮保藏法和甘油悬液保藏法次之；以冷冻真空干燥保藏法和液氮超低温保藏法最为复杂，但其保藏效果最好。应用时，可根据实际需要选用。　　在国际著名的“美国典型培养物收藏中心”（简写ATCC），仅采用两种最有效的保藏法，即保藏期一般达5～15年的冷冻真空干燥保藏法与保藏期一般达15年以上的液氮超低温保藏法，以达到最大限度地减少传代次数，避免菌种变异和衰退的目的。我国菌种保藏多采用3种方法，即斜面低温保藏法、液氮超低温保藏法和冷冻真空干燥保藏法。　　来源：上海复祥生物科技有限公司　　联系电话：400-821-8510，021-35080510　　E-mail：xiangfbio@163.com

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