【摘要】：
目的:BCR-ABL阴性的骨髓增殖性肿瘤是一种以一系或多系髓系细胞恶性增殖为主要特征的造血干细胞性疾病,主要包括真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)。目前研究已证实JAK2V617F、JAK2 exon12、MPL W515K/L和CALR exon9基因突变是导致MPN发生的主要分子病因,约在90%的MPN患者中可检出以上任意一种基因突变。然而,大约有15%的ET和低于10%的PMF患者缺乏到以上驱动突变,被称为“三阴性”MPN。为了进一步探索三阴性MPN患者发病的分子病因,我们对临床上MPN患者的MPL基因的10号外显子进行了突变筛查,我们在三例“三阴性”MPN患者中发现了两种不典型MPL突变,分别为插入突变MPL A497-L498ins4和双位点突变MPLW515RQ516E。为了研究这两种不典型MPL突变是否为导致MPN发病的直接原因,我们拟通过慢病毒包装基因转导技术将这两种突变基因及其相应对照基因插入到小鼠原B淋巴细胞(Ba/F3)基因组中,从细胞水平探讨这两种不典型MPL突变的促细胞增殖作用及机制,为“三阴性”MPN分子发病机制、诊断和治疗提供一定的补充。方法:1.三阴性患者MPL基因10号外显子基因突变筛查和鉴定我们对临床上的新诊断的三阴性患者采用PCR法对MPL exon10基因进行扩增,PCR产物送华大基因公司测序,通过与基因库MPL基因序列进行比对,对三阴性MPN患者进行MPL突变筛查,发现了两种不典型MPL基因突变。对于双位点突变MPLW515RQ516E,采用TA-clone法进行鉴定以明确两个突变位点是否位于同一条DNA链上。2.构建MPL A497-L498ins4、MPLW515RQ516E及对照基因的慢病毒表达载体采用RT-PCR法逆转录获取MPLA497-L498ins4、W515RQ516E及对照基因组MPLW515L、MPLWT的cDNA,设计特异引物扩增MPL基因的全长编码序列(CDS),双限制性内切酶(Not I和EcoR I)分别酶切PCR扩增产物和慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV后,并将酶切产物回收,进行连接反应。将构建好的包含目的基因的慢病毒表达载体转化进入DH5α进行扩增,提取质粒,一代测序鉴定各目的基因序列,选取碱基无错配,插入和缺失克隆进行质粒大量提取。3.定点诱变构建MPLQ516E慢病毒表达载体根据MPL基因序列选择定点突变位点Q516E(GAG→CAG),按照QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit要求设计上下游引物,引物中包含了对应的突变碱基。以野生型MPL慢病毒表达载体为模板进行定点诱变PCR反应,DpnⅠ消化PCR产物,降解模板质粒,得到MPLQ516E慢病毒质粒。转化DH-5α感受态细胞,挑取克隆进行小量质粒提取,并进行测序鉴定,选取碱基无错配,插入和缺失克隆进行质粒大量提取。4.慢病毒包装建立稳定表达MPLA497-L498ins4、MPLW515RQ516E、MPLQ516E、MPLW515L、MPL WT及MSCV的Ba/F3细胞模型各组慢病毒表达载体即MPL A497-L498ins4、MPLW515RQ516E、MPLQ516E、MPLW515L、MPL WT和MSCV分别与包装质粒按一定比例脂质体法共转染293T细胞,48h后收集慢病毒悬液,感染Ba/F3细胞,72h后流式细胞术检测各组细胞感染效率,对于低于90%阳性率细胞进行分选,获得稳定表达各组目的和对照基因的Ba/F3细胞模型。MPLA497-L498ins4、MPLW515RQ516E突变对Ba/F3细胞不依赖IL-3增殖情况的分析IL-3因子是Ba/F3维持正常生长所必需的细胞因子。MPLW515L突变可以导致Ba/F3细胞不依赖IL-3自主增殖。本研究通过设计IL-3撤退实验观察不典型MPL A497-L498ins4和W515RQ516E突变在体外对细胞增殖作用的影响。表达MPLW515L突变的细胞作为阳性对照,表达MPLWT的细胞作为阴性对照,同时设立载体对照及未转染的Ba/F3空白对照。无IL-3条件下培养各组细胞,于0h、24h、48h、72h通过CCK-8试剂盒分别对各组细胞增殖情况进行检测,并统计分析。5.MPLA497-L498ins4、MPLW515RQ516E突变对配体TPO敏感性情况的分析TPO是MPL编码的血小板生成素受体的特异配体,MPL基因突变常导致细胞对配体TPO的高敏感性或不依赖性,而野生型MPL必须依赖一定浓度的TPO才可以维持细胞的生长。本研究旨在通过检测两种不典型MPL突变对TPO敏感性,进一步验证MPL A497-L498ins4和MPLW515RQ516E突变是否具有自主促细胞增殖能力。分组同上,各组细胞分别在不同浓度梯度TPO条件下培养96h(2ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/m、0.001ng/ml、0ng/ml),CCK-8法测定各组中Ba/F3细胞增殖情况并进行统计分析。6.MPL A497-L498ins4和MPLW515RQ516E突变体在不同浓度TPO条件下细胞周期G1、G2、S期比例分析为了进一步探讨突变体对于细胞周期的影响,本研究将各组细胞于不同浓度TPO(0ng/ml,0.1ng/ml,10ng/ml)条件下培养48小时后,收集各组细胞10~6个,PBS洗净残留培养基后,70%乙醇固定细胞4℃过夜,PI标记孵育30min后上流式细胞仪检测各组细胞周期G1、G2、S期比例并进行统计分析。7.MPLQ516E单点突变对Ba/F3细胞增殖作用分析(1)MPLQ516E单点突变对Ba/F3细胞不依赖IL-3增殖情况的分析为了探究Q516E单位点突变是否会影响双点突变的MPLW515RQ516E的功能,我们设计构建了稳定表达Q516E单点突变的细胞模型。通过IL-3撤退实验观察MPLQ516E突变在对细胞增殖作用的影响。表达MPLW515L突变的细胞作为阳性对照,表达MPLWT的细胞作为阴性对照,各组细胞均在无IL-3条件下培养,于0h、24h、48h、72h采用CCK-8试剂盒分别对各组细胞增殖情况进行检测,并统计分析。(2)MPLQ516E单点突变对配体TPO敏感性情况的分析为进一步探讨MPLQ516E突变对不同配体TPO浓度下TPOR活化的情况的影响,将MPLWT细胞作为阴性对照,再次证明MPLQ516E是否具有自主促细胞增殖活性。各组细胞分别在6种不同浓度梯度TPO条件下(2ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/m、0.001ng/ml、0ng/ml)培养96h,CCK-8法测定各组中Ba/F3细胞增殖情况并进行统计分析。8.MPL A497-L498ins4和MPLW515RQ516E突变体JAK2/STAT、PI3K/AKT以及MAPK/RAS活化情况分析各组细胞在无IL-3条件下培养48小时后,收集并提取各组细胞总蛋白,Simple Western检测JAK2,STAT1,STAT3,STAT5,p44/p42 MAPK,AKT等总蛋白以及各组蛋白相应位点磷酸化的蛋白,β-actin作为各组内参蛋白。比较无IL-3条件下,各组细胞JAK/STAT、PI3K/AKT、MAPK/RAS等信号通路活化情况。结果:1.两种不典型MPL突变的发现和鉴定通过对临床上新诊断的三阴性患者MPLexon10进行基因突变筛查,我们发现了两种不典型MPL突变,分别为插入突变MPL A497-L498ins4和MPLW515R和Q516E的双点突变。我们通过TA-clone对双点突变进行鉴定,发现MPLW515R和Q516E的双点突变是一种位于同一DNA链上,因而命名为MPLW515RQ516E突变。2.各基因慢病毒表达载体的构建与鉴定各基因MPLA497-L498ins4、MPLW515RQ516E、MPLW515L、MPLWT均成功连接到至慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中,经Sanger测序法分别对各目的基因序列进行鉴定,与基因库基因Blast比对分析,结果显示各组载体插入基因序列均无碱基错配,插入和缺失。通过定点诱变成功构建的MPLQ516E慢病毒表达载体,经Sanger测序检测鉴定,Blast比对分析结果显示载体序列准确,各组慢病毒表达载体构建成功。3.各目的基因慢病毒转导Ba/F3细胞,建立稳定表达目的基因的细胞模型并鉴定成功构建各组慢病毒表达载体后,通过脂质体法三质粒共转染293 T细胞,制备MPLA497-L498ins4、MPLW515RQ516E、MPLQ516E及阳性对照MPLW515L、阴性对照MPLWT、载体对照MSCV各基因慢病毒悬液,并感染Ba/F3细胞,72h后流式细胞术检测各组细胞感染效率,对感染效率低的细胞进行阳性克隆分选,使各组细胞GFP阳性率>90%。PCR和流式细胞术CD110标记分别鉴定各组细胞中目的基因mRNA和蛋白TPOR表达情况。所有结果显示稳定表达各组目的基因的Ba/F3细胞模型构建成功。4.MPLA497-L498ins4、MPLW515RQ516E在无IL-3培养条件下对Ba/F3细胞的增殖能力分析CCK-8法检测各组Ba/F3细胞在不同时间点不依赖IL-3生长情况,结果显示阴性对照各组细胞(MPL WT组、MSCV组及Ba/F3组)在各时间点细胞增殖均未出现明显细胞增殖,各组之间细胞数无统计学差异(P>0.05)。MPLA497-L498ins4组、MPLW515RQ516E组和MPL W515L组在48h、72h细胞均出现明显增殖,与各阴性对照组相比,均有统计学差异(P0.05)。5.MPLA497-L498ins4、MPLW515RQ516E突变对其配体TPO敏感性分析CCK-8法检测各组Ba/F3细胞在梯度稀释后的TPO条件的增殖情况,结果显示,在高浓度TPO(2ng/ml和1 ng/ml)浓度时,MPLA497-L498ins4、MPLW515RQ516E、MPL W515L、MPL WT四组细胞均呈现明显增殖,与载体对照MSCV和未感染Ba/F3比较有统计学差异(P0.05),MPL A497-L498ins4、MPLW515RQ516E、MPL W515L S期比例较MPLWT也均无统计学差异,分别为26.7%,36.9%,34.9%和26.3%。7.MPLQ516E突变对Ba/F3细胞的增殖能力分析为了进一步探究Q516E突变对MPLW515RQ516E双位点突变功能是否有一定影响,我们进一步设计单位点突变MPLQ516E并验证了该突变对Ba/F3细胞增殖作用。在无IL-3条件下,MPLQ516E突变细胞呈现较MPLW515L弱的促增殖活性(P
【学位授予单位】：山西医科大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2019