嗜热真菌高产木聚糖酶及其酶法制备低聚木糖的研究--CNKI机构馆在线
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嗜热真菌高产木聚糖酶及其酶法制备低聚木糖的研究
作&&&&者：
来&&&&源： 湖北工业大学
摘&&&&要： 低聚木糖是由2～7个D-木糖以β-1,4-木糖苷键连接而成的低聚合度功能性多糖。在低聚木糖制备的多种方法中,酶水解法是最为方便有效、针对性好、可控性强的方法,而产木聚糖酶菌种的选择和工艺条件的优化成为能利用该方法的关键因素。本文以嗜热真菌Thermomyces lanuginosus DSM10635为出发菌株,采用原生质体紫外线和亚硝酸复合诱变方法,最终筛选出一株性能稳定且木聚糖酶高产的突变株(T-U-03-10),在此基础上进行诱变菌株液态发酵产木聚糖酶工艺的优化以及利用所产木聚糖酶制备低聚木糖的最适酶解工艺条件的研究。
1.本试验确定了该菌株原生质体制备的最适条件:酶系及酶解浓度为0.01g/mL纤维素酶+0.01g/mL蜗牛酶(体积比1:1混合),菌龄为58h,酶解时间为2.5h,酶解温度为30℃～34℃,稳渗剂为0.6mol/L的甘露醇;原生质体的数目可达4.47×10~6个/mL,再生率为4.74%。采用15W紫外灯30cm处照射原生质体5min,筛选出一株命名为T-U-03突变株,再以亚硝酸处理T-U-03原生质体120s,均通过透明圈初筛和摇瓶复筛,最后选育出一株木聚糖酶高产菌T-U-03-10,产酶活力高达1510U/mL,与出发菌株酶活1011U/mL相比,提高了49.36%。
2.首先通过单因素实验确定了最适碳源、氮源及表面活性剂,其分别为玉米芯、尿素、吐温-80;再利用SAS-JMP软件,对培养基的主要成分进行PB实验和响应面实验,确定了最佳培养基组分为:玉米芯为4.570%,尿素为1.797%,KH2PO4为0.497%,ZnSO4 0.2%,MgSO_4·7H_2O 0.03%,CaCl_2 0.03%,FeSO_4·7H_2O 0.03%,Tween-80 0.03%以单因素方法确定了最适发酵条件为:接种量为培养基中孢子数约10~5～10~6个/80mL,培养时间7d,培养基初始pH6.5～7.0,发酵温度50～52℃,转速180～200r/min,装液量90mL/250mL。在此条件下,菌株的产酶活力高达到1726.80U/mL,较优化前酶活提高了14.36%。
3.初步探讨了该突变株产酶的基本酶学性质,其结果为:该酶对底物的特异性较强,最佳反应温度为65℃,热稳定范围不高于65℃,则该酶的稳定性较好。酶促反应最适pH值为6.8且在该条件下酶的稳定性较好,其存活率仍为85.20%。低浓度的Mg~(2+)、Mn~(2+)和高浓度的Fe~(2+)、Zn~(2+)对该酶都具有明显的的激活作用;但Hg~(2+)对该酶抑制作用极大,甚至在高浓度下使酶完全失活,而Cu~(2+)、Co~(2+)也均有较大的抑制作用,其失活率分别在10.40%和19.46%。该酶液在室温下保存不稳定,应尽量置于4℃低温下保存。经测定木聚糖酶的米氏常数约为38.71mg/mL,最大反应速率约为277.78μmol/(mL.min)。
4.采用嗜热真菌产的木聚糖酶来制备低聚木糖,且主要对酶解工艺条件进行了探讨。通过单因素及正交试验确定出低聚木糖酶法制备的最佳工艺条件为:酶解时间为2.5h,底物浓度为4%,酶的添加量为每克底物加酶量120U。酶解液经碳柱过滤纯化后,由HPLC分析测定该糖液主要成分为木二糖、木三糖及木四糖其含量占低聚木糖组分约74.56%。
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? ABSTRACT6-12
? 第1章 引言12-21
1.1 概述12-16
1.1.1 木聚糖12
1.1.2 产木聚糖酶菌株12-13
1.1.3 木聚糖酶13
1.1.4 低聚木糖13-16
1.2 微生物原生质体诱变育种的研究进展16-18
1.3 酶法制备低聚木糖的研究进展18-19
1.4 本课题研究的意义及内容19-21
1.4.1 研究意义19-20
1.4.2 研究内容20-21
? 第2章 木聚糖酶高产突变株的选育21-35
2.1 实验材料21-23
2.1.1 菌种21
2.1.2 培养基21
2.1.3 主要试剂及药品21-22
2.1.4 主要仪器22-23
2.2 实验方法23-26
2.2.1 原生质体的制备和再生23
2.2.2 诱变方法23-24
2.2.3 突变株筛选方法24
2.2.4 遗传稳定性试验24
2.2.5 木聚糖酶活力的测定24-26
2.3 实验结果与分析26-34
2.3.1 原生质体的制备26-30
2.3.2 原生质体再生30
2.3.3 原生质体紫外诱变处理结果30-32
2.3.4 亚硝酸诱变处理结果32-34
2.4 小结34-35
? 第3章 突变株产木聚糖酶发酵工艺的研究35-50
3.1 实验材料35-36
3.1.1 菌种35
3.1.2 原料35
3.1.3 培养基35
3.1.4 主要试剂及药品35-36
3.1.5 实验仪器36
3.2 实验方法36-39
3.2.1 孢子悬液的制备36
3.2.2 摇瓶培养条件36
3.2.3 发酵培养基优化36-37
3.2.4 发酵培养条件优化37-38
3.2.5 木聚糖酶活的测定38-39
3.3 实验结果与分析39-49
3.3.1 发酵培养基优化39-45
3.3.2 发酵条件优化45-49
3.4 小结49-50
? 第4章 T-U-03-10 产木聚糖酶基本酶学特性的研究50-59
4.1 实验材料50
4.1.1 菌种50
4.1.2 主要药品及试剂50
4.1.3 主要仪器50
4.2 实验方法50-52
4.2.1 粗酶液的制备50
4.2.2 酶活的测定50-51
4.2.3 不同底物对酶活的影响51
4.2.4 最适酶促反应温度的确定51
4.2.5 酶的热稳定性试验51
4.2.6 最适酶促反应pH 的确定51
4.2.7 最适pH 值酶的稳定性试验51
4.2.8 金属离子对木聚糖酶活的影响51-52
4.2.9 酶液的存储稳定性实验52
4.2.10 木聚糖酶的动力学参数的测定52
4.3 实验结果与分析52-58
4.3.1 不同底物对酶活的影响52-53
4.3.2 最适酶促反应温度的确定53
4.3.3 酶的热稳定性试验53-54
4.3.4 最适酶促反应pH 的确定54-55
4.3.5 最适pH 值酶的稳定性试验55
4.3.6 金属离子对木聚糖酶活的影响55-56
4.3.7 酶液的存储稳定性实验56-57
4.3.8 木聚糖酶动力参数的测定57-58
4.4 小结58-59
? 第5章 酶法制备低聚木糖工艺条件的研究59-69
5.1 实验材料59-60
5.1.1 主要试剂及药品59-60
5.1.2 主要仪器60
5.2 实验方法60-63
5.2.1 玉米芯木聚糖的制备60
5.2.2 酶法水解制备低聚木糖单因素实验60-61
5.2.3 酶解正交实验61
5.2.4 低聚木糖的纯化61
5.2.5 分析测定方法61-63
5.3 结果与分析63-68
5.3.1 不同酶解时间对酶解效果的影响63-64
5.3.2 不同底物浓度对酶解效果的影响64-65
5.3.3 不同酶的添加量对酶解效果的影响65
5.3.4 正交实验结果及分析65-66
5.3.5 低聚木糖成分的 HPLC 图谱分析66-68
5.4 小结68-69
? 第6章 总结与展望69-71
6.1 总结69-70
6.2 创新点70
6.3 展望70-71
? 参考文献71-75
? 致谢75-76
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京公网安备75号当前所在位置：&&一种内切型木聚糖酶的制备方法
一种内切型木聚糖酶的制备方法
项目编号：
技术简要说明
本发明公开了一种以农业废弃物玉米芯为原料经微生物发酵方法制备内切型木聚糖酶的方法。筛选得到一株绿垂曲霉(Aspergillus?viridinutans)，可直接利用农业废弃物玉米芯产生高产量的内切木聚糖酶，并通过生化方法进行纯化，得到可水解木聚糖生产木糖含量低、聚合度为2到5的低聚木糖产品的内切型木聚糖酶，该木聚糖酶可用于工业化生产低聚木糖。
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专利权信息
专利类型：发明
专利申请日：
公开(公告)日：
申请(专利权)人：北京工商大学
申请人：北京工商大学
公开(公告)号：CNA
分类号：C12N
发明(设计)人：李秀婷;朱运平;腾超;孙宝国;宋红霞
国别省市：11
总流量：269
录入日期： 18:40
温馨提示：该专利受国家知识产权法保护。如您希望使用该专利，请联系专利权人，获得专利权人的授权许可。
１．一种内切型木聚糖酶的制备方法，其特征在于：富含半纤维素的玉米芯为原料，以一株新型木聚糖酶产生菌株——绿垂曲霉对该原料进行微生物发酵处理，制备高产量的内切型木聚糖酶，该酶可生产出该木糖含量低、聚合度为２至５的低聚木糖，并具有改善馒头的品质的作用。
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申请（专利）号
授权公告号
法律状态公告日
法律状态类型&
&实质审查的生效
&实质审查的生效&IPC(主分类):C12N
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