还原型茚三酮显色长时间暴露是否被氧化

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2014-12-12 01:17 标签： 茚三酮
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木素呈色反应的机理是什么
呈色反应（一）双缩脲反应1、原理尿素加热至180℃左右,生成双缩脲并放出一分子氨.双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物,此反应称为双缩脲反应.蛋白质分子中有肽键,其结构与双缩脲相似,也能发生此反应.可用于蛋白质的定性或定量测定.反应式如下：双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有.含有一个肽键和一个―CS―NH2,―CH2―NH2,―CRH―NH2,―CH2―NH2―CHNH2――CH2OH或CHOHC H2N H2等基团的物质以及乙二酰二胺等物质也有此反应.NH3也干扰此反应,因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+.因此,一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应,但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽.2．试剂（1）尿素（2）10%氢氧化钠溶液（3）1%硫酸铜溶液（4）2%卵清蛋白溶液3．操作取少量尿素结晶,放在干燥试管中.用微火加热使尿素熔化.熔化的尿素开始硬化时,停止加热,尿素放出氨,形成双缩脲.冷后,加10%氢氧化化钠溶液约1ml,振荡混匀,再加1%硫酸铜溶液1滴,再振荡.观察出现的粉红颜色.要避免添加过量硫酸铜,否则,生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色.向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液约2ml,摇匀,再加1%硫酸铜溶液2滴,随加随摇.观察紫玫瑰色的出现.（二）茚三酮反应1．原理除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外,所有α―氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质.β―丙氨酸、氨和许多一级胺都呈正反应.尿素、马尿酸、二酮吡嗪和肽键上的亚氨基不呈现此反应.因此,虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应,但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸.在定性、定量测定中,应严防干扰物存在.该反应十分灵敏,1:1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应,是一种常用的氨基酸定量测定方法.茚三酮反应分为两步,第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛,水合茚三酮被还原成型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质.此反应的适宜pH为5~7,同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同,酸度过大时甚至不显色.2．试剂（1）蛋白质溶液 100ml2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清：水=1：9）（2）0.5%甘氨酸溶液（3）0.1%茚三酮水溶液（4）0.1%茚三酮-乙醇溶液3、操作（1）取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml,再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液,混匀,在沸水浴中加热1~2分钟,观察颜色由粉色变紫色再变蓝.（2）在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液,风干后,再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液,在微火旁烘干显色,观察紫红色斑点的出现.（三）黄色反应1、原理含有苯环结构的氨基酸,如酷氨酸和色氨酸,遇硝酸后,可被硝化成黄色物质,该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠.多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸,所以有黄色反应,苯丙氨酸不易硝化,需加入少量浓硫酸才有黄色反应.2、试剂（1）鸡蛋清溶液 100ml将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀,然后用6层纱布过滤.（2）大豆提取液 100ml（3）头发（4）指甲（5）0.5%苯酚溶液 50ml（6）浓硝酸 200 ml（7）0.3%色氨酸溶液 10 ml（8）0.3%酪氨酸溶液 10 ml（9）10%氢氧化钠溶液 100 ml3、操作向7个试管中分别按下表加入试剂,观察各管出现的现象,有的试管反应慢可略放置或用微火加热.待各管出现黄色后,于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性,观察颜色变化.（四）考马斯亮蓝反应1、原理考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调.在酸性溶液中,其以游离存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色.它染色灵敏度高,比氨基黑高3倍.反应速度快,约在2分钟左右时间达到平衡,在室温一小时内稳定.在0.01~1.0mg蛋白质范围内,蛋白质浓度与A595nm值成正比.所以常用来测定蛋白质含量.2、试剂（1）蛋白质溶液（鸡蛋清：水=1：20） 5 ml（2）考马斯亮蓝染液 300 ml考马斯亮蓝G250100g溶于50 ml95%乙醇中,加100 ml85%磷酸混匀,配成原液.临用前取原液15 ml,加蒸馏水至100 ml,用粗滤纸过滤后,最终浓度为0.01%.烯丙基缩水甘油醚与胶原多肽反应的研究_百度文库
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