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SARS-CoV核衣壳蛋白的表达与免疫研究
摘　要：依据GenBank中SARS基因组序列,采用人工合成的方法合成编码SARS病毒N蛋白的全基因(1296bp)序列,再与设计的CTL特异性表位基因(195bp)重组后,克隆到pET-28a(+)质粒中,重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.利用SARS患者恢复期阳性血清,鉴定表达蛋白.进一步纯化后免疫马,并用ELISA方法检测血清抗体效价.结果显示SDS-PAGE表明所表达的蛋白相对分子质量约为55000 Da,与预计大小相符;Westernblot显示表达的蛋白具有良好的抗原性和特异性.对表达蛋白形成的包涵体进行洗涤,得到的蛋白纯度可达到70.1%.切胶纯化免疫马后,获得的抗SARS抗体滴度达1:2560.为亚单位疫苗研制和精制抗SARS抗体免疫制剂提供基础.
优质期刊推荐SARS-CoV N蛋白免疫原性和致病性的初步研究
优秀研究生学位论文题录展示SARS-CoV N蛋白免疫原性和致病性的初步研究专　业: 免疫学关键词: 急性呼吸道综合征 SARS冠状病毒 核壳蛋白 树突状细胞 巨噬细胞 免疫原性分类号: R373.1　
R563.8形　态: 共 172 页　约 112,660 个字　约 5.389 M内容阅　读:
内容摘要严重的急性呼吸道综合征severeacuterespiratorysyndrom，SARS是一种传染性极强的呼吸系统疾病，2002年11月至2003年7月在我国内地和世界上30多个国家和地区出现流行，引起全世界高度关注。世界卫生组织于日确认，引起SARS的病原体是冠状病毒的一个变种，称为SARS相关冠状病毒SARS-associatedcoronavirus，SARS-CoV，其扩散范围之广，传播速度之快和对全球经济影响之严重为近年来发现传染病之最，对人们的身体健康和生命安全构成了严重威胁。为了预防SARS-CoV的再次出现，研制有效的预防SARS-CoV感染的疫苗，探讨SARS-CoV的致病机理指导临床用药乃当务之急。本研究利用N基因重组的疫苗免疫鼠，通过分析其诱导体液免疫和细胞免疫的能力研究其免疫原性；并且利用N基因重组的腺病毒感染肺上皮细胞、巨噬细胞和树突状细胞，探讨其在SARS-CoV急性感染中炎性细胞因子的产生机制，为认识SARS-CoV的致病机理奠定基础。第一节SARS-CoVN基因重组腺病毒载体的构建为了研究N蛋白的免疫原性及致病性，利用PfuDNApolymerase，通过PCR的方法扩增到目的基因，首先通过酶促反应构建N基因重组的转移载体，经过测序验证之后，将N基因重组的转移载体与腺病毒表达载体通过酶促反应进行同源重组，获得N基因重组的腺病毒，并对此病毒进行PCR和Westernblot鉴定分析。另外，将此重组的腺病毒感染VeroE6细胞，通过Westernblot鉴定分析N蛋白的表达。测序结果表明，N基因重组的腺病毒转移载体含有全长N基因为1269bp，与GeneBank中的AY304495株SARS-CoV的标准序列进行比对一致率100。在N基因重组的腺病毒表达载体质粒中以PCR的方法扩增到1269bp的DNA片段，N基因重组腺病毒表达质粒转染的293A细胞获得重组的腺病毒，然后，将其感染VeroE6细胞。通过Westernblot分析上述293A细胞和VeroE6细胞都有48kDa的N蛋白表达。这些结果表明，成功地构建了N基因重组的腺病毒。第二节SARS-CoVN基因重组DNA疫苗和腺病毒疫苗在BALB/c小鼠体内诱导N蛋白特异的免疫应答的初步研究针对SARS-CoV感染的临床特点，为了预防SARS-CoV的再次出现，研制有效的能够诱导体液和细胞免疫应答的SARS-CoV的基因疫苗是非常必要的。本研究中我们构建了N基因重组的真核表达质粒pcDNA3.1-N和N基因重组的复制缺陷的腺病毒载体疫苗rAd-N，将这两种疫苗以不同的组合连续4次免疫接种BALB/c小鼠来探讨哪一种组合能够诱导最强的体液和细胞免疫应答。结果显示，对于试验组而言，无论体液免疫还是细胞免疫的水平都比对照组高；正向免疫组合先免疫DNA疫苗再以病毒疫苗加强的方案和逆向免疫组合先以病毒疫苗免疫再以DNA疫苗加强的方案中的异源性载体组合都可以有效地诱导体液免疫，异源性组合诱导的体液免疫与同源性组合相比有明显的不同。在细胞免疫的检测中发现，对CTL的诱导中重组腺病毒组与异源性组合的免疫原性区别不大，都能诱导较强的CTL应答。对淋巴细胞增殖反应和分泌IFN-γ的检测发现，异源性载体免疫组合比同源性载体组合的免疫原性要强得多。结论，本研究中正向免疫组合的方案比逆向免疫组合的方案免疫效应要强；在所有组合中，尤其以免疫组合pcDNA3.1-N/pcDNA3.1-N/pcDNA3.1-N/rAd-N诱导的抗体应答、淋巴细胞增殖应答、IFN-γ的分泌和CTL的应答水平比较强，有希望成为SARS-CoV疫苗的候选方案。同时也证明，先以SARS-CoVN基因重组的DNA疫苗免疫再以相同基因重组的腺病毒疫苗来加强免疫的方案能够诱导增强的小鼠体液和细胞免疫。第三节SARS-CoVN基因重组腺病毒感染对巨噬细胞和肺上皮细胞前炎症细胞因子mRNA表达和分泌水平的影响为了在蛋白质水平上明确SARS-CoV的致病机理，弄清楚究竟哪一种蛋白质诱导了炎性细胞因子的大量分泌，我们选择N蛋白作为我们的研究对象，构建了SARS-CoV全长的N基因重组的腺病毒，利用N基因重组的腺病毒感染人的单核细胞来源的巨噬细胞和人的肺上皮细胞A549，通过检测细胞培养上清中的炎性细胞因子的分泌水平和相应细胞因子的mRNA的表达水平，探讨N蛋白在SARS-CoV所引起的免疫损伤中所发挥的作用。试验结果表明，巨噬细胞被重组腺病毒rAd-N感染后检测到IL-1β和IL-8mRNA的表达，在4h、12h和24h时mRNA的表达水平是不断变化的，总趋势是在24h之内逐渐升高，和对照组rAd-LacZ感染相比有明显的差异P＜0.05。A549细胞被重组病毒rAd-N感染后只检测到IL-8mRNA表达水平的变化，其变化也是在24h之内逐渐升高，与对照组rAd-LacZ感染相比也有明显的差异P＜0.05。在4h、8h、16h和24h4个时间点取巨噬细胞和A549细胞被重组腺病毒rAd-N感染后的培养上清，进行ELISA分析，巨噬细胞所分泌的IL-1β和IL-8在24h之内的分泌是逐步升高的，与对照组rAd-LacZ感染有明显的差异P＜0.05。重组病毒感染后的A549细胞对IL-8的分泌在24h之内也是逐渐升高，与对照组相比也有明显差异P＜0.05。此结果证明N蛋白与SARS-CoV感染的急性期巨噬细胞和肺上皮细胞分泌大量的前炎症细胞因子有关，值得进一步研究。第四节树突状细胞的培养与鉴定DC作为体内专职的抗原提呈细胞具有摄取、处理和提呈抗原至T细胞的功能，是目前公认的体内抗原提呈功能最强的专职APC。但是，DC在体内含量甚微，仅占外周单个核细胞的0.1～0.5，难以分离和纯化。本研究从正常人外周血获取单核细胞，经体外GM-CSF联合IL-4及TNF-α培养，并通过其形态、表型及刺激活性等来鉴定DC。结果显示，通过GM-CSF联合IL-4、TNF-α的培养体系，诱导出了人外周血单核细胞来源的DC。形态学观察结果证实，成熟的DC呈悬浮状，形态不规则，表面可见明显突起，且细胞体积明显增大。FACS检测结果显示DC表面高表达相对特异性的标志，分别为CD4071.91、CD8063.40、CD8673.39、MHCⅡ90.34。经3H-TdR掺入法检测证明，本法所获得的DC在体外混合淋巴细胞培养中能强烈激发脐带血中原始T淋巴细胞的增殖，证实DC是成熟的。第五节SARS-CoVN基因重组腺病毒感染对树突状细胞前炎症细胞因子mRNA表达水平和分泌水平的影响为了在蛋白质水平上探讨SARS-CoV的致病机理，本研究在建立DC培养方法的前提下，利用SARS-CoV的N基因重组腺病毒rAd-N来感染未成熟和成熟的DC，探讨前炎症细胞因子的mRNA表达和分泌水平的动态变化。结果证明，用RT-PCR的方法在不同时间检测到rAd-N感染的DC对IL-6和TNF-α的mRNA表达有明显的变化，分别在4h、12h和24h收集被重组腺病毒rAd-N感染后的未成熟DC，通过RT-PCR检测mRNA表达，发现IL-6和TNF-αmRNA的表达水平前24h之内是逐渐升高的，和对照组rAd-LacZ感染相比有明显的差异p＜0.05。成熟DC被重组病毒rAd-N感染后也检测到IL-6和TNF-αmRNA的表达水平的变化，其变化也是在24h之内逐渐升高，与对照组rAd-LacZ感染相比也有明显的差异。这两组细胞相比，未成熟DC对两种炎症因子的表达都比成熟的DC要高。同时ELISA检测的结果与RT-PCR的检测基本一致：在4h、8h、16h和24h4个时间点取未成熟和成熟DC被重组的腺病毒rAd-N、rAd-LacZ感染后的培养上清，进行ELISA分析，在培养上清中只检测到IL-6和TNF-α，未检测到IL-1β和IL-8的分泌。未成熟DC分泌的IL-6和TNF-α在24h之内也是逐渐升高，与对照组相比有明显的差异p＜0.05。病毒感染后的成熟DC在24h对IL-6和TNF-α的分泌也是逐渐升高的，与对照组相比也有明显差异p＜0.05。本研究反应了N蛋白与SARS的急性期DC分泌过量的前炎症细胞因子有关，从而在蛋白质水平证明了SARS-CoV感染的炎症机理，值得进一步研究..……
全文目录英文缩略词表中文摘要英文摘要研究背景第一节 SARS-CoV N基因重组的腺病毒载体构建材料与方法结
果讨论参考文献第二节 SARS-CoV N基因重组DNA疫苗和腺病毒疫苗在BALB/c小鼠体内诱导N蛋白特异的免疫应答的初步研究第三节 SARS-CoV N基因重组腺病毒感染对巨噬细胞和肺上皮细胞前炎症细胞因子mRNA表达和分泌水平的影响第四节 树突状细胞的培养与鉴定第五节 SARS-CoV N基因重组腺病毒感染对树突状细胞前炎症细胞因子mRNA表达水平和分泌水平的影响结论综述一：SARS冠状病毒基因组编码蛋白的研究进展综述二：SARS-CoV疫苗的研究进展Enhanced induction of SARS-COV nucleocapsid protein specific immune response by use of DNA vaccination followed by adenovirus boosting in BALB/c mice
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> <font color=@3.1 > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 人体病毒学（致病病毒）其他分类:
> <font color=@3.8 > 医药、卫生 > 内科学 > 呼吸系及胸部疾病 > 肺疾病
& 2012 book.&&&&参见附件(184kb)。&&&&
摘要：目的
建立一种可用于严重急性呼吸综合征(SARS)早期诊断的简便、快速、灵敏的实验室检测方法。方法
采用化学发光免疫分析方法(chemiluminescenceimmunosaasy，CLIA)测定12种不同病毒培养上清和人血中SARS冠状病毒核衣壳蛋白(nucleocapsidprotein)抗原(SARS-CoV-N)。结果
7种不同SARS毒株测定均为阳性，12种非SARS毒株测定均为阴性，最低可检出核酸定量为6.3X101PFU/mL的SARS-CoV培养上清；测定63例临床确诊SARS的阳性血清样本，发病6～10d的样本检出率最高，可达100%；测定1 066例正常人样本，99.35%为阴性。结论
SARS-CoV的CLIA的灵敏度和特异性较高，并且简便、快速，在SARS的早期诊断中层示了良好的应用前景。
&&&&关键词：化学发光；免疫分析；严重急性呼吸综合征；N蛋白
&&&&中图分类号：R 392.33
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新西兰兔对SARS-CoV实验灭活疫苗的体液免疫应答
摘 要：目的：评价SARS-CoV广东F69分离株实验灭活疫苗的免疫效果。方法：病毒悬液经0．4％甲醛灭活后作为抗原，对新西兰兔进行免疫接种；采用ELISA法和微量细胞中和试验，检测血清特异性IgG抗体和中和
【题　名】新西兰兔对SARS-CoV实验灭活疫苗的体液免疫应答
【作　者】张传海 郭中敏 郑焕英 陆家海 王一飞 赵勇 杜雄伟 张美英
【机　构】中山大学,广州510080 暨南大学生物医药研究开发基地,广州510630 皖西学院生物系,六安237012 广东省疾病预防控制中心,广州510300
【刊　名】中国免疫学杂志,
2006(5): 420-421
【关键词】SARS-CoV 灭活疫苗 免疫原性 中和抗体
【文　摘】目的：评价SARS-CoV广东F69分离株实验灭活疫苗的免疫效果。方法：病毒悬液经0．4％甲醛灭活后作为抗原，对新西兰兔进行免疫接种；采用ELISA法和微量细胞中和试验，检测血清特异性IgG抗体和中和抗体的消长规律。结果：初次免疫后第3天，即能检测到抗SARS-CoV特异性抗体，第7天检测到中和抗体。二次免疫后，特异性IgG抗体和中和抗体效价于第6周左右分别达到1：8480的峰值水平。继续加强免疫，特异性抗体水平无明显变化。F69分离株与Z2-Y3广东分离株之间能够完全交叉中和。结论：F69毒株实验灭活疫苗具有很强的免疫原性。F69与Z2-Y3毒株之间尽管存在基因序列差异，但能够完全交叉免疫保护。
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SARS-CoV,灭活疫苗,免疫原性,中和抗体
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