在空气中微生物的测定中,应从哪几个方面确定采样点?_百度作业帮
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在空气中微生物的测定中,应从哪几个方面确定采样点?
在空气中微生物的测定中,应从哪几个方面确定采样点?
1.时间.不同时间段采集,如清晨,工作时（或上学时）,下班（或放学后）等.2.空间.不同地点采集,草坪上,教室内,走廊上,食堂里等等.3.是否加盖.等等2015版中国药典 ――微生物限度检查法培训栗壮总则微生物检验标准体系特征? 一百多年来，人们努力提高在“有菌的环境”生产“无菌的产品”的能 力，事实证明这一努力至今仍充满挑战。? 2015版中国药典微生物检验标准体系体现两大显著特征：? 全面与国际标准接轨 ? 为药品
微生物从终产品检验向过程控制转变服务 重点：1、加强检验过程控制2、提高方法检出率 3、保证结果可靠性3微生物限度检查法格式变化? 参照ICH（人用药物注册技术要求国际协调会）整合修订 ? 新的修订案将微生物限度检查法分为3个附录，即 ? 《非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》 ? 《非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》 ? 《非无菌药品微生物限度标准》4Presentation title in footer | 00 Month 0000微生物检查体系的调整2010版分类依据 质控分类 检验体系 评价 按微生物类别分 细菌、真菌 选择培养、或者人为区分 容易造成漏检2015版按营养条件分 需气、厌气菌 直接与培养条件对应 简便、严谨5Presentation title in footer | 00 Month 0000微生物检测环境2010版 检测环境 2015版应在洁净度10000级背景 应在受控洁净环境（不低于D 下的局部100级单向流空气 级洁净环境）下的局部洁净 区域内进行 度不低于B级单向流空气区域 内进行其他要求： ? 检验过程及环境既要最大可能防止样品受污染，又要防止检测过程对 环境和人员造成的危害。? 活动区域的合理规划及区分，将提高微生物实验操作的安全性和可靠 性。6Presentation title in footer | 00 Month 0000《非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》总则微生物计数法? 1、微生物计数法用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数 ? 2、明确规定本法不适用于活菌制剂的检查 ? 3、明确规定本检查法可采用替代检查方法，包括自动检测方法，但 必须证明其替代方法等效于药典规定的检查方法。 ? 4、应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域 内进行。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 ? 5、尽可能去除或中和供试品的抗菌活性。若使用了中和剂或灭活剂 ，应确认其有效性及对微生物无毒性。 ? 6、如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用 中和剂或灭活剂的相容性。9Presentation title in footer | 00 Month 000010Presentation title in footer | 00 Month 0000可替代方法的使用参照中国药典附录《药品微生物检验替代方法验证指导原则》证明替 代方法等效于药典规定的检查方法。11Presentation title in footer | 00 Month 0000环境监测：参考：9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则1、监测项目监测项目 微生物限度检查 空气悬浮粒子 检测频率 每季度一次浮游菌沉降菌 表面微生物（手套及操作服）每季度一次每周一次 每周一次培养基：一般采用胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA），当监测结果有疑似 真菌或考虑季节因素影响时，可增加沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)。12Presentation title in footer | 00 Month 0000尘埃粒子监测? 监测方法：参照GB/T
《医药工业洁净室（区）悬浮粒 子的测试方法》 ? 监测设备：? 空气尘埃粒子计数器，多为光散射粒子计数器? 工作原理： 当取样气流中的尘埃颗粒通过计数器散射腔的光敏感区时，光 遇到粒子时发生散射，这些光脉冲信号经光电二极管转换成电脉冲 信号，电脉冲次数反映粒子数，脉冲幅值反映粒子的粒径。 ? 一台仪器可同时测定多个粒径通道的粒子。采样点? 不得少于2个14请根据报告内容更新采样量15请根据报告内容更新尘埃粒子标准16请根据报告内容更新容易被忽略的UCL值：? UCL的计算：平均值均值的95%置信上限，微粒每立方米 （粒/m3）? s ? 95%UCL ? X ? t0.95 ? ? ? m?各个平均值的采样点数 （m）t!”2 6.33 2.94 2.45 2.16 2.07-9 1.9悬浮粒子结果评定1、单个采样点平均值 2、所有采样点UCL值微生物监测? 浮游菌监测： ? 收集悬浮在空气中的生物性微粒，通过专门的培养基，在适宜的生 长条件下，让其繁殖到可见的菌落并进行计数，从而判定洁净环境 中单位体积空气中菌落数的多少。 ? 沉降菌监测： ? 用暴露法收集降落在培养皿中的活生物性粒子，然后加以培养、繁 殖后加以计数得到。 ? 表面微生物监测： ? 用来监测环境、设备和人员的表面微生物量。 1、接触碟法 2、棉签擦拭法监测方法空气微生物监测---浮游菌和沉降菌孰优孰劣？? 沉降菌测试 ? 属于被动式取样法，对空气环境破坏小 ? 放置时间长，可以做时间段的环境监控 ? 取样方法并不能给出定量的数据 ? 空气浮游菌测试? 主动式采样法，定量且对微生物无选择性? 时间“点”的采样浮游菌监测监测方法：GB/T 《医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法》 监测设备：浮游菌检测仪21请根据报告内容更新采样要求采样点同尘埃粒子要求 采样量要求：22请根据报告内容更新取样点选择的考虑因素：C 微生物污染最有可能对实验结果造成负面影响的的位置；C 微生物最容易增殖的位置； C 取样点的选择是否应有统计方面的考虑，或者是否是基于网格状分布的 ？在常规监测中，某些位点是否需要轮换进行取样？ C 能够代表那些在清洁、灭菌或者消毒的过程中最难以达到的区域； C 可能有助于污染扩散的活动； C 在指定位点的取样活动是否会干扰环境，从而造成实验结果的误差？23Presentation title in footer | 00 Month 0000沉降菌测试? 监测方法：《医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》 ? 监测工具： ? 一般使用直径为90mm的沉降碟。 ? 沉降碟优势： ? 价廉、轻便、对空气环境破坏较小 ? 放置时间：? 为了尽可能地获得可靠性数据，沉降碟的放置时间不宜过短，至 少为半小时，但不得超过4 小时。? 应对沉降碟的暴露时间进行确认，以保证暴露后的培养基不会因 失水等原因而影响微生物的正常生长。?限度检查若选择A级，则检查工作台面沉降菌的日常监测采样点数不少于3个， 且每个采样点的平皿数应不少于1个。表面微生物监测? 接触碟法是将接触碟对规则表面或平面进 行取样，然后置合适的温度下培养一定时 间并计数 ? 每碟取样面积约为25 cm2，微生物计数结 果以CFU/碟报告? 取样方法要经过验证25请根据报告内容更新? 使用接触碟的水平采样点方法：培养基表面应与采样点接触不少于 10s，向整个接触表面施加恒定均匀的压力（如施加的质量约为25g/cm2），不得有环形或线性运动。装置有接触并拿开后，要加盖并尽快用适当的培养条件培养。26请根据报告内容更新? 棉签擦拭法是接触碟法的补充，用于不规则表面的微生物监测，特别 是设备的不规则表面。? 棉签擦拭法是采用合适尺寸的无菌模板确定擦拭的面积，取样后，棉 签置合适的缓冲液或培养基中，充分振荡，再用平皿涂布法或平皿浇 注法计数。? 每个棉签取样面积为约25 cm2，微生物计数结果以CFU/棉签报告。? 接触碟法和棉签擦拭法采用的培养基、培养温度和时间同浮游菌或沉 降菌监测。? 表面菌测定应在实验结束后进行27培养基? 环境浮游菌、沉降菌及表面微生物监测用培养基一般采用胰酪大豆 胨琼脂培养基（TSA） ? 当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时，可增加沙氏葡萄糖 琼脂培养基(SDA)。28请根据报告内容更新培养条件GBT
医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法USP1116 无菌工艺环境的微生物控制与监测29请根据报告内容更新微生物动态标准注： （1）表中各数值均为平均值； （2）单个沉降碟的暴露时间可以少于4小时，同一位置可使用多个沉 降碟连续进行监测并累积计数。30 Presentation title in footer | 00 Month 0000警戒限和纠偏限? 药品洁净实验室应根据历史数据，结合不同洁净区域的标准，采用 数理统计方法，制定适当的微生物监测警戒限和纠偏限。? 限度确定后，应定期回顾评价，如历史数据表明环境有所改善，限度应作出相应调整以反映环境实际质量状况。31请根据报告内容更新警戒限和纠偏限（1）数据表示建议的环境质量水平，也可根据检测或分析方法的类型确 定微生物纠偏限度标准。 （2）可根据洁净区域用途、检测药品的特性等需要增加沉降碟数。 （3）A 级环境的样品，正常情况下应无微生物污染。32 Presentation title in footer | 00 Month 0000偏差处理? 当微生物监测结果超出警戒限度和纠偏限度时，应当按照偏差处理 规程进行报告、记录、调查、处理以及采取纠正措施，并对纠正措施的有效性进行评估。? 关键区域（A 级）微生物监测数值若大于15CFU，应视为控制失 败，为重大偏差。应迅速彻底调查原因。33Presentation title in footer | 00 Month 0000微生物鉴定? 建议对受控环境收集到的微生物进行适当水平的鉴定。 ? 尤其当超过监测限度时，微生物鉴定信息有助于污染源的调查。 ? 关键区域分离到的菌落应先于非关键区域进行鉴定。 ? 微生物鉴定参照微生物鉴定指导原则（通则9204）进行。34请根据报告内容更新计数方法微生物计数方法新增涂布法 ? 1、平皿法：包括倾注法和涂布法 ? 2、薄膜过滤法 ? 3、最可能数法（MPN 法） 选择原则：? 根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择? MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量 很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法 ? 所选方法的适用性须经确认36 Presentation title in footer | 00 Month 0000适用性检查一、适用性检查内容? 培养基适用性检查 ? 计数方法适用性试验 ? 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行计数 方法适用性试验38Presentation title in footer | 00 Month 0000二、试验菌2010版 大肠埃希菌2015版 铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 白色念珠菌、黑曲霉 白色念珠菌、黑曲霉39Presentation title in footer | 00 Month 0000菌液制备? 1、试验菌株传代次数不得超过5代 ? 2、用缓冲液将试验菌新鲜培养物制成适宜浓度的菌悬液? 3、菌液制备后室温放置应在2 小时内使用；保存在2～8℃可在24小时内使用。 ? 4、稳定的黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使 用。40Presentation title in footer | 00 Month 0000三、阴性对照? 适用性检查试验中应平行做阴性对照，确认试验条件是否符合要求。 ? 阴性对照试验应无菌生长。 ? 如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。41Presentation title in footer | 00 Month 0000四、培养基体系最突出的变化：微生物质控分类及培养基体系 2010版 分类依据 项目1 项目2 按微生物类别分 细菌数 营养琼脂 霉菌及酵母菌数 玫瑰红钠琼脂 2015版 按营养条件分 需氧菌总数 胰酪大豆胨琼脂（TSA） 霉菌及酵母菌总数 沙氏葡萄糖琼脂（SDA）评价检验条件不能满足控制要求 客观、严谨42Presentation title in footer | 00 Month 0000微生物计数用培养基2010版 2015版1、营养琼脂用于细菌计数 2、玫瑰红钠用于霉菌和酵 母菌计数 3、酵母浸出粉胨葡萄糖琼 脂用于酵母菌计数 4、菌液制备用稀释液： 0.9%氯化钠溶液 2010版试 验 菌 株 1、营养琼脂：大肠埃希 菌、金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌 2、玫瑰红钠琼脂：白色 念珠菌、黑曲霉1、胰酪大豆胨琼脂和胰酪大豆胨肉汤用于 需氧菌总数测定 2、沙氏葡萄糖琼脂用于霉菌和酵母菌总数 测定 3、菌液制备用培养基：H7.0无菌氯化钠-蛋 白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液2015版 1、胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、枯 草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、 黑曲霉 2、胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、铜 绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌 3、沙氏葡萄糖琼脂：白色念珠菌、黑曲霉43Presentation title in footer | 00 Month 0000培养基成分对比培养基 成分 营养琼脂 配方：（g/L） 胨 10.0 牛肉浸粉 3.0 氯化钠 5.0 琼脂 14.0 细菌 胰酪大豆胨琼脂TSA 配方：（g/L） 胨 20.0（15.0胰酪胨；5.0大豆胨） 氯化钠 5.0 琼脂 15.0 TYMC需氧菌总数考察对象44Presentation title in footer | 00 Month 0000培养结果对比45Presentation title in footer | 00 Month 0000培养基成分对比培养基 玫瑰红钠琼脂培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基 SDA配方成分作用配方：（g/L） 配方：（g/L） 蛋白胨 5.0 酪蛋白胨 5.0 磷酸二氢钾 1.0 肉蛋白胨 5.0 玫瑰红钠 0.0133 葡萄糖 40.0 硫酸镁 0.5 琼脂 15.0 葡萄糖 10.0 琼脂 14.0 胨提供碳源和氮源;葡萄糖提供能源; 磷酸二氢钾为缓冲剂;硫酸镁提供必 蛋白胨提供碳源和氮源;葡 须的微量元素;玫瑰红钠作为选择性 萄糖提供能源，琼脂是培养 抑菌剂可抑制细菌的生长，并可减 基的凝固剂。 缓某些霉菌因生长过快而导致菌落 漫延生长;琼脂是培养基的凝固剂。46Presentation title in footer | 00 Month 000047Presentation title in footer | 00 Month 0000五、培养基适用性检查2010版 2015版微生物计数用的成品培养基、由脱水培养 基或按处方配制的固体和液体培养基检查范围 固体培养基加菌量50～100CFU 玫瑰红钠：23～28°C不大于100CFU 胰酪大豆胨琼脂TSA：30～35°C培养 胰酪大豆胨肉汤TSB：30～35°C培养 沙氏葡萄糖琼脂SDA：20～25°C培养 细菌不超过72h，真菌不超过5天培养温度 营养琼脂：30～35°C培养时间 细菌：48h真菌：72h可接受标 准70%固体培养基（与对照培养基）： 50%～200%（0.5～2） 液体培养基（与对照培养基管比较）： 生长良好48Presentation title in footer | 00 Month 0000六、计数方法适用性试验主要变化2010版 （1）术语变化：计数方法验证。 （2）细菌用三种菌株进行验证。 （3）菌液加入方式：平皿计数验 证时菌液和供试液同时加入平皿， 加菌量为50～100cfu。 2015版 （1）术语变化：计数方法适用性试验 （2）总需氧菌计数用五种菌株试验。 （3）菌液加入方式：菌液加入供试液 中，使每mL供试液或每张滤膜所过滤 的供试液中含菌量不大于100cfu，且 所加菌液的体积不超过供试液体积的 1%。备注：培养时间、可接受标准同培养基适用性检查 1、接种菌悬液的体积不大于供试液的1% 2、菌悬液含菌量不大于100cfu 3、抗菌或抑菌活性的标准：回收率低于50%49计数方法适用性试验1、供试品制备2010版 1、液体供试品 2、固体、半固体或黏稠性供试品 3、需用特殊供试液制备方法的供试 品： (1)非水溶性供试品 (2)膜剂供试品 (3)肠溶及结肠溶制剂供试品 (4)气雾剂、喷雾剂供试品 (5)贴剂供试品 (6)具抑菌活性的供试品。 2015版 1、水溶性供试品 2、水不溶性非油脂类供试品 3、油脂类供试品 4、需用特殊方法制备供试液的供试 品： ⑴膜剂供试品、 ⑵肠溶及结肠溶制剂供试品、 ⑶气雾剂、喷雾剂供试品、 ⑷贴膏剂供试品备注：1、体系上供试液制备移至计数方法适用性试验部分，结构上更合理。 2、供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1 小时。供试品制备方法⑴ 水溶性供试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或 pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨肉汤培养基溶解或稀释制成 1:10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀 释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合 的供试品原液作为供试液。 ⑵ 水不溶性非油脂类供试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨肉汤培养基制备成 1:10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释剂中加入表面活性剂 如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液 pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀 释。51⑶ 油脂类供试品 取供试品，加入经过滤除菌的十四烷酸异丙酯使溶 解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌 性的无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般不超过40℃ （特殊情况下，最多不超过45℃），小心混合，若需要可在水浴 中进行，然后加入预热的稀释剂使成1∶10供试液，保温，混合， 并在最短时间内形成乳状液。必要时，用含适宜浓度的无菌聚山梨 酯80或其他无抑制性无菌表面活性剂的稀释剂进一步10倍系列稀 释。52⑷需用特殊方法制备供试液的供试品 膜剂供试品 取供试品,剪碎,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或 pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨肉汤培养基，浸泡，振摇，制 备成1∶10的供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时 ，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。 肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品，加入pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 （用于肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂） ，置45℃水浴中,振摇,使溶解,制备成1∶10的供试液。必要时，用 同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释53气雾剂、喷雾剂供试品 取供试品,置冰冻室冷冻约1小时，取出，迅速 消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温， 并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。用无菌注射器从每一容 器中吸出全部药液于无菌容器中混合，然后取样检查。 贴膏剂供试品 取供试品,去掉防粘层，将粘贴面朝上放置在无菌玻璃 或塑料器皿上，在粘贴面上覆盖一层适宜的无菌多孔材料（如无菌 纱布），避免贴膏剂粘贴在一起。将处理后的贴膏剂放入盛有适宜 体积并含有表面活性剂（如聚山梨脂80或卵磷脂）稀释液的容器 中，振荡至少30分钟。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10 倍系列稀释。54稀释液2010版 （1）pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨 2015版 （1）pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液缓冲液（2）pH7.2无菌磷酸盐缓冲液 （3）pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 （用于肠溶制剂）或pH7.6无菌 磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制 剂）（2）pH7.2无菌磷酸盐缓冲液（3）pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于 肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液 （用于结肠溶制剂） （4）增加胰酪胨大豆肉汤培养基 ●不局限上述稀释液552、接种和稀释2010版 试验组 供试液和菌液同时加 入平皿中 2015版 供试液中加入规定量的菌液 供试液，不加菌液按照试验 组进行试验供试品对照组 供试液直接加入平皿 中菌液对照组直接加入菌液到平皿 中取不含中和剂、灭活剂及表 面活性剂的稀释液加入规定 量的菌液中和剂、灭活剂及表面活性 剂的稀释液中加入规定量菌 液中和剂对照组 稀释剂对照组模拟样品受到污染时的真实情况！56 Presentation title in footer | 00 Month 00003、抗菌活性的去除或灭活 ――供试品前处理原因 ?1、溶解性较差 ?2、供试品抗菌活性（选择适宜方法处理或去除供试品抗菌活性）57抗菌活性处理方法? 稀释方法 ? 中和方法 ? 薄膜过滤方法 ? 联合使用上述方法 ? 离心沉淀法仅适用于制备细菌计数或控制菌（细菌）检查用的供试 液，规定的500 转/分钟、不超过3 分钟只用于去除供试液中的沉 淀物。采用该方法时，供试液中的样品颗粒大小、粘稠度及污染的 微生物大小，转速等直接影响着样品中微生物的回收，易造成检验 结果不能真实反映供试品的污染情况。因此，供试液制备时尽量避 免使用该方法，更不宜采用高速离心沉降集菌。584、供试品中微生物的回收? 微生物的回收可采用平皿法、薄膜过滤法或MPN法? 平皿法包括倾注法和涂布法。每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿 ，以算术均值作为计数结果。? MPN 法仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，本法不适用于霉菌计数。 ? 制备的供试液至少3 个连续稀释级，每一稀释级取3份 分别接种至3 管 装有TSB培养基中，同法测定菌液对照组菌数。 ? 根据微生物生长的管数从表中查总需氧菌的最可能数。59 Presentation title in footer | 00 Month 0000供试品中微生物的回收? 薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于 0.45μm,直径一般为50mm,滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。 ? 使用时,应保证滤膜在过滤前后的完整性。? 每张滤膜总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。? 每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。同法测定供试品对照组及 菌液对照组菌数。60Presentation title in footer | 00 Month 0000培养条件2010版 细菌数：营养琼脂 30℃～35℃ 3天 2015版 需氧菌总数（TAMC）：胰酪大 豆胨琼脂 30℃～35℃ 3～5天霉菌及酵母菌数：玫瑰红钠琼脂 霉菌和酵母菌总数（TYMC）： 23℃～28℃ 5天 沙氏葡萄糖琼脂 20℃～25℃ 5～7天 以往的研究：嗜热型微生物最适生长温度为45℃～58℃ 嗜温型为25℃～43℃ 嗜冷型为10℃～18℃ 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌最适生长温度为37℃ ，白色念珠菌和黑曲霉最适生长温度为28℃，均为嗜温型微生物61 Presentation title in footer | 00 Month 00005、结果判断计数方法 结果判断薄膜过滤法 平皿法 MPN法（试验组菌落数??供试品对照组菌落数）/菌液对照组 菌落数 比值应在0.5～2之间 试验组菌数应在菌液对照组菌数的95%置信限内若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求,那么选择 回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检查。62Presentation title in footer | 00 Month 0000供试品检查1、供试品检验量2010版 除另有规定外，一般 供试品检验量为10g 或10ml，膜剂为 100cm2；贵重或微量 包装药品的检验量可 以逐减。除另有规定 外，口服固体制剂不 低于3g，液体制剂采 用原液者不得少于 6ml，采用供试液者 不得少于3ml，外用 药品不得少于5g。 2015版 （1）除另有规定外,一般取10g或10ml供试品 进行检测；对于液体或固体气雾剂，取10个容 器单位检测；对于透皮吸收贴剂，取10贴检验。 （2）每一计量单位（如片剂、胶囊剂、注射 剂）活性物质含量小于或等于1mg，每g或ml 活性物质含量低于1mg。这种情况下，检验量 应不少于10个剂量单位、10g或10ml。 （3）对用作活性物质的材料，样品量有限或 批量极小（如：小于1000nk或1000g）的，除 更少检验量被证明合理外，检测量应为批量的 1%。 （4）对于批量少于200的产品（如临床诊断用 品），取样量可减少至2个单位。对于批量少 于100的产品，取样量减少至1个单位。64Presentation title in footer | 00 Month 00002、阴性对照2010版 2015版附录109页和110页：（1）平皿法：取试验用的稀释液（1）排版放在所有检验及验证之前，更为合理。同时说明所有检验1ml ，置无菌平皿中，注入培养基， 活动需要进行阴性对照。凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌 生长。 （2）薄膜过滤法：取试验用的稀（2）为确认试验条件是否符合要求，应设立阴性对照组，以稀释剂 代替供试品，阴性对照组应无菌生 长。供试品检查时也需要进行阴性释液1ml ，照上述薄膜过滤法操作， 对照试验，如果对照有菌生长，应 不得有菌生长。65 Presentation title in footer | 00 Month 0000进行偏差调查。3、计数2010版 按计数方法的验证试验确认的程序 进行供试液的制备，用稀释液稀释 成1：10、1：102、1：103等稀释 级的供试液。 2015版 按照计数方法适用性试验确认的计 数方法进行供试品中需氧菌总数、 霉菌和酵母菌总数的测定。66Presentation title in footer | 00 Month 00004、培养2010版 2015版（1）描述方式：计数方法包括平皿法和薄膜过滤法，检查时，按已 验证计数方法进行供试品细菌、霉（1）描述方式：按计数方法适用性试验确认计数方法进行供试品中 需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的菌和酵母菌数测定。（2）培养条件：细菌30～35℃培 养3天，霉菌和酵母菌23～28℃培 养5天，必要时可适当延长7天。测定。（2）培养条件：胰酪大豆胨琼脂 平板在30～35℃培养3～5天，沙 氏葡萄糖琼脂平板在20～25℃培养 5～7天；MPN法和供试品接种， 所有试验管在30～35℃培养3天67Presentation title in footer | 00 Month 0000结果判断1、计数要求2010版营养琼脂培养基用于细菌计数；玫 瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母2015版需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培 养基上生长的总菌落数（包括真菌菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数菌落数）；霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总 菌落数（包括细菌菌落数）。69Presentation title in footer | 00 Month 00002、计数干扰2010版 2015版若营养琼脂培养基上长有霉菌和若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有 长的细菌使霉菌及酵母菌的计数结果 细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、 不符合微生物限度要求，可使用含抗细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基 生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂 葡萄糖琼脂培养基或选择性培养基 培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂 （如玫瑰红钠琼脂培养基）进行霉菌 培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼 和酵母菌总数测定。使用选择性培养 脂培养基中的细菌数进行比较，以菌 基时，应进行培养基适用性检查。若 落数高的培养基中的菌数为计数结果。 采用MPN法，测定结果为需氧菌总 数。70 Presentation title in footer | 00 Month 00003、计数结果2010版 供试品的细菌数、霉菌数和酵母菌 数其中任何一个不符合该品种项下 的规定，应从同一批样品中随机抽 样，独立复试两次，以三次结果的 平均值报告菌数。 2015版 无相关内容描述。在实际操作过程 应依据附录9203 药品微生物实验 室质量管理指导原则：结果的判断 和检测报告――异常结果出现时， 应进行偏差调查71Presentation title in footer | 00 Month 00004、计数标准2010版无规定2015版增加： 各品种项下要求执行的微生物限度标准解释如下： 101cfu为可接受的最大限度为20； 102cfu为可接受的最大限度为200； 103cfu为可接受的最大限度为2000；以此类推。 若供试品的需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的检查结果均符合该 品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品 种项下的规定，判供试品不符合规定。2010版无规定2015版例如：当标准为101cfu，不同于以往10cfu规定的以10的指数规定 标准，考虑了微生物计数结果的可变性，即计数结果的精密度，而 非类似化学检验结果。故要求我们需要在结果判断时或制定内控标 准时，对于结果的判断或历史数据的分析需要用风险分析的手段进 行评估。制定标准时需要依据历史数据，工艺过程，用药人群等进 行相应分析，制定合理的内控标准，即总原则为在内控标准的控制 下产品无任何质量风险。72新的理念1、MPN法适用范围：含菌量较低的供试品细菌总数测定。可作为平 板计数法和薄膜过滤法不适用时的补充、 2、供试液制备中增加“分散均匀”的概念，并非一定要溶解。 3、表面活性剂使时，在确认对微生物无毒性的同时，需要确认与使 用的中和剂或表面活性剂的相容性。4、偏差调查概念引入。73引入偏差调查偏差调查：（1）当检验结果出现超常或超标时均需要进行偏差调查。（2）调查范围人、机、料、法、环。 （3）偏差调查的范围至少包括： 1）微生物鉴别―初步确定污染源 2）原始数据以及阴阳性对照回顾。 3）培养基及所用的其他耗材是否满足质量标准要求。 4）取样环境是否满足要求。5）同期进行检验的其他结果是否正常。6）消毒剂是否在有效期内，且消毒是否正确。 7）必要情况下进行相应的复试。74 Presentation title in footer | 00 Month 0000微生物超标结果处理（OOS调查）关键术语解释OOS 结果：? 实验得到不符合质量标准的结果。即超标结果。? 复验： 用相同实验样品或由取自某批次的原始样品中得到或制备的新 的实验室样品来重复一个实验。 行动措施： ? 实验不破坏样品：核对原来样品情况，实验方法，人员，试剂，对照品 ，仪器等进行检查。 ? 实验破坏了样品：核对样品信息，实验方法，人员，试剂，对照品， 仪器等并回顾实验情况，对相关批次的样品进行检查。76不合格（OOS）结果举例：OOS调查程序实验室初步评价 OOS原因不明确，重测 OOS原因不明确，重检 OOS原因不明确，重新取样 非实验室原因，生产质量回顾 最终结论：处理/预防/评价/报告确定OOS原因 实验室原因生产操作者误差 生产工艺误差舍弃OOS结果 重检/重测原料、设备故障、环境因素等不合格（OOS）结果? 不合格（OOS）检验结果的调查系统对于决定一种产品是被发放或是报废起着至关重要的作用，也是复检、重新取样的基础。OOS结果可分为三类：? 实验室误差； ? 非生产工艺性误差（操作者误差）； ? 生产工艺误差。78实验室错误类型实验室错误类型:试剂分析人员 样品 实验程序实验方法培训计算 吸液或移取 称量实验仪器79实验室调查阶段实验室调查阶段：?人员：化验员同其主管或其他指定人员一起实施 ?目的：确定OOS结果的有效性 查找实验室误差80复核内容? 计算 ? 原始数据 ? 实验记录文件，确认遵循正确操作流程和检验方法 ? 计算公式验证 ? 实验使用仪器、试剂 ? 所用仪器均经校验并且操作正确（包括影响实验结果的软件复核） ? 所用试剂、培养基 ? 所使用的菌种实验环境? 实验环境（层流操作台和生物安全柜的环境监测结果）? 本次实验的阴性对照是否成立 ? 该样品的历史数据81实验室调查阶段? 实验室以外人员也可包含在审核中，审核应文件化并被批准。?若调查表明OOS结果为实验室错误，应记录结论并经批准，重复分析。 ?适当的时候OOS可被纠正而不通过复验，如：计算错误。 ?若实验规程中需配制样品，重复分析时可用最初分析时的样品，但要 求样品配制正确，复验期间是稳定的； ?当样品不稳定或其稳定性不确定时，从实验室样品中重取一部分进行 重复分析。82实验室调查阶段? 若分析实施前样品不具代表性、受污染或降解，结论应文件化并批准。?分析应该在下一步的实验室样品重复进行，样品应来自原始样品或重新取样的样品，还应考虑实验室初始样品所做的其他项目，评估是否应 重复测定。必须遵守：数据存档 最初分析的包含OOS结果的数据和来自复验的数据应该保存在实验 室记录中83扩大范围调查阶段?若调查表明结果有效，或原因不确定，则扩大调查以确定OOS结果可 能的原因和它的影响。 ?调查通常包括实验室以外的部门，如：生产，质量保证，质量规范执 行，供应商。信息审核：? ? 制造工艺 试验物料或产品历史??84中控试验其他试验项目结果 物料或产品实验的前史 供应商信息COA?扩大范围调查阶段审核目的?弄清原因，是否为非工艺或操作工或与工艺相关的错误，并提供信息 以支持来自复验或重新取样复验结果的结论 ?若确信是由于生产错误或产品问题，信息审核应包括制造部人员，指 出工艺过程引起了OOS结果。852009-02复验复验：若无结论或不能确定OOS原因，进行复验. 复验程序要求： 1、制定复验计划指出复验的设计纲要和目的； 2、复验计划应文件化并批准； 3、复验的设计与数量依据最初的OOS调查结论，并依靠科学的判断明 确指出（建议复验过程所得到的结果数量应至少是最初实验结果数量的 两倍，复验的次数应在SOP中规定。)4、对实验室原始样品或更多的来自相关批次取出的样品进行复测；86复验复验规程注意事项a.最初的试验结果;b.物料或产品的自然性状及历史; c. 试验方法; d.其他试验项目结果， e.中间体结果; f. 试验方法，分析的原因; g.第二个化验员进行复验;h.两个化验员分别独立复验，对照样品的分析;f. 第二个实验室的参与87复验? 复验分为两个或多个步骤，每一步骤完成后应伴随审核。若第一次复验 结果与最初OOS结果一致，复验结束； ? 若第一次复验结果在质量标准之内或是典型性的，进行进一步的复验。 ? 规定的复验完成后，不再进行更多的复验，补充的复验实施前其计划应 文件化并批准。 ? 所有样品、样品的制备、试剂、溶液应该安全的保留至调查完成。? 所有复验数据保存在实验室记录中882009-02重新取样重新取样原则：? 若调查表明取样过程有误或决定复验但无足够量先样品进行复验， 应考虑重新取样。 ? 实验项目的设计和数量应是明确的且基于科学的判断。 ? 所有实施重新取样的样品试验所获得的数据应该保存在实验室记录 中。89调查结论? 扩大范围调查后得到的结论应是明确的且基于对获得的信息的科学判断。除非有合理的科学理由否定原OOS结果，原始结果和扩大范围调查研究的结果都将上报。 ? 若复验结果是OOS的，应评估发生该事件的潜在影响。? 若调查能确定问题的原因，应尽可能找到合理的实际的确定原因。并考虑以下方面： 1、 物料或产品的处理； 2、试验批次物料或产品回收的整改计划（包括回制和再加工）； 3、预防事件再发生的整改计划；904、对相同物料或产品的其他批次和其他物料或产品的批次的潜在影响。调查结论? 若结论是某批次产品不合格，则应采取必要整改行动，防止此类事件的再次发生，并对相同物料或产品的其他批次进行评估。? 得出的结论和采取的行动应该文件化并被批准，除非有合理的科学的理 由以否定源于最初实验的OOS结果，所有的最初结果和扩大范围的调查研究过程中获得的结果都将上报? 失败调查研究：当扩大范围调查研究表明商业批次产品是失败时应进行 失败调查研究，包括以下内容? 1、造成失败的原因；? 2、确定防止事件再次发生的整改行动； ? 3、评估对相同物料或产品其他批次的潜在影响。91调查结论? 失败调查应依据规定程序进行，使其文件化并批准。 ? 任何调查的最终目的是确定问题所在和实施一个永久的解决措施。 必须明确： ? 在所有的步骤中，基本点在于结论是基于事实或合理的科学的判断，任意武断的对结果的否决、复验和重新取样（3R问题即：REJECTIONOF RESULTS，RESAMPLING， RETESTING） 是不应该发生的； ? 所有调查研究、所下的决定、所采取的行动必须经批准并文件化。92注意事项? 有些公司重复检验直到得到满意的结果，然后没有科学依据的忽视 OOS结果。检验至合格是不科学和不允许的。一个样品复验的最多次数应事先在SOP明确规定，不同的检验方法允许复验的次数可能不同，但应遵守科学合理原则，复验次数不能根据结果调整。注意事项? 在明确确定了实验室错误的情况下，原样复验结果合格，再检验 结果将取代最初检验结果．应该保留最初结果注明测定结果无效 ，在OOS调查记录上记录相关人员的签名、注上日期，并应包括 对错误的讨论、主管的注释，结束实验室调查 ? 若没有实验室错误或统计错误发生，就没有科学依据使原来的 OOS结果无效。 ? 所有的检验结果，通过的和可疑的，都应有报告，并保存。
《非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》控制菌结果判断趋向多样化控制菌检查中将原来大肠菌群的检测改为耐胆盐的革兰氏阴性菌，另 外培养基体系也有较明显的变化，较少的生化实验或采用其它适宜 方法进一步鉴定（镜检、生化、色谱光谱技术、分子生物学等） 修订前 大肠菌群 大肠埃希菌 沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 梭菌 白色念珠菌99 Presentation title in footer | 00 Month 0000修订后 耐胆盐革兰阴性菌 大肠埃希菌 沙门菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 梭菌 白色念珠菌? 新增内容：对替代方法的认可，本检查法可采用替代的微生物检查 法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检 查方法 ? 较大变动：结果判断方式，在各控制菌项下，生化实验和“应进行 分离、纯化及适宜的鉴定试验。”改为较少的生化实验或采用其它 适宜方法进一步鉴定100 Presentation title in footer | 00 Month 0000使用无选择性增菌培养基培养，可以使受损伤的细菌得到修复，提高 检出率。增菌培养 ? ? ? ? TSB 营养肉汤 BL 乳糖胆盐 发酵培养 基选择性增菌 ? 麦康凯肉 汤 ? RV肉汤选择性琼脂 ? 麦康凯琼 脂 ? VRBG ? XLD101 Presentation title in footer | 00 Month 00001、培养基种类培养基种类减少（培养基体系有明显变化） 2010版：22种 2010版胆盐乳糖培养基 4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基 曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基 乳糖胆盐发酵培养基 乳糖发酵培养基 营养肉汤培养基 四硫磺酸钠亮绿培养基 胆盐硫乳琼脂培养基或沙门、志贺氏属琼脂培养基 三糖铁琼脂培养基 溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基 绿脓菌素测定用培养基 亚碲酸盐肉汤培养基 卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇盐琼脂培养基 梭菌增菌培养基 哥伦比亚琼脂培养基 沙氏葡萄糖肉汤 沙氏葡萄糖琼脂培养基 念珠菌显色培养基 吐温 80玉米琼脂培养基修订后：14种 2015版肠道菌增菌肉汤 紫红胆盐葡萄糖琼脂 麦康凯肉汤 麦康凯琼脂 RV沙门菌增菌肉汤 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂 三糖铁琼脂培养基 溴化十六烷基三甲铵琼脂 甘露醇氯化钠琼脂 梭菌增菌培养基 哥伦比亚琼脂 沙氏葡萄糖肉汤 沙氏葡萄糖琼脂 念珠菌显色培养基103 Presentation title in footer | 00 Month 0000104 Presentation title in footer | 00 Month 00002、培养基适用性检查测试指标测试指标 菌株 接种量促生长能力 见表 不大于100抑制能力 见表 不少于100 （不超1000） 规定的最长时间指示能力 见表 不大于100培养时间规定的最短时间规定的最短时间105 Presentation title in footer | 00 Month 0000控制菌检查 耐胆盐革兰阴性 菌 大肠埃希菌培养基 肠道菌增菌肉汤 紫红胆盐葡萄糖琼脂 麦康凯肉汤 麦康凯琼脂 RV沙门菌增菌肉汤 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂 三糖铁琼脂培养基 溴化十六烷基三甲铵琼脂 甘露醇氯化钠琼脂 梭菌增菌培养基 哥伦比亚琼脂 沙氏葡萄糖肉汤 沙氏葡萄糖琼脂 念珠菌显色培养基特性 促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示特性 促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示特性 促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示特性 指示能力 促生长能力 抑制能力 促生长能力+指示特性 抑制能力 促生长能力 促生长能力 促生长能力 促生长能力+指示特性 促生长能力+指示能力 抑制能力试验菌株 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 乙型副伤寒沙门菌 金黄色葡萄球菌 乙型副伤寒沙门菌 乙型副伤寒沙门菌 铜绿假单胞菌 大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 生孢梭菌 生孢梭菌 白色念珠菌 白色念珠菌 白色念珠菌 大肠埃希菌沙门菌铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 梭菌 白色念珠菌106 Presentation title in footer | 00 Month 00003、试验菌2010版控制菌检查方法的验证2015版方法适用性试验 ……..确认耐胆盐革兰氏阴…….验证大肠菌群检查方法时，采取 试验菌 大肠埃希菌为验证菌株。性菌检查方法时，采取大肠埃希菌和 铜绿假单胞菌为试验菌。107 Presentation title in footer | 00 Month 00004、方法2010版 2015版验证方法 取规定量供试液及 适用性试验 按控制菌检查法取 10～100cfu试验菌接入增菌培养 规定量供试液及不大于100cfu的 基中，依相应的控制菌检查方法 试验菌接入规定的培养基中；采 进行检查。当采用薄膜过滤时， 用薄膜过滤时，取规定量供试液， 取规定量供试液，过滤，冲洗， 过滤，冲洗，试验菌应在最后一 试验菌应加在最后一次冲洗液中， 次冲洗液中，过滤后注入规定的 过滤后，注入增菌培养基或取出 培养基或取出滤膜接入规定的培 滤膜接入增菌培养基中。 养基中。依相应的控制菌检查方 法，在规定的温度及最短时间下 培养，应能检出所加试验菌相应 的反应特征。108 Presentation title in footer | 00 Month 00005、方法适用性试验结果判断：2010版 2015版结果判断 若上述试验检出试验菌， 结果判断 上述试验若检出试验 按此供试液制备法和控制菌检查法 菌，按此供试液制备法和控制菌检 进行供试品的该控制菌检查；若未 查方法进行供试品的该控制菌检查； 检出试验菌，应采用培养基稀释法。 若未检出试验菌，应消除供试品的 离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法 抑菌活性（《非无菌产品微生物检 等方法或联合使用这些方法消除供 查：微生物计数法》中的“抗菌活性 试品的抑菌活性，并重新进行方法 的去除或灭活”），并重新进行方法 验证。 适用性试验。 验证试验也可与供试品的控制 如果经过试验确证供试品对试 菌检查同时进行。 验菌的抗菌作用无法消除，可认为 受抑制的微生物不可能存在于该供 试品中，选择抑菌成份消除相对彻 底的方法进行供试品的检查。109 Presentation title in footer | 00 Month 0000供试品检查? 按方法适用性试验确认的方法进行 ? 阳性对照试验 ：方法同供试品的控制菌检查,对照菌的加量应不大于100cfu。阳性对照试验应检出相应的控制菌。? 阴性对照试验： 以稀释剂代替供试液照相应控制菌检查法检查，阴 性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。111 Presentation title in footer | 00 Month 00001、耐胆盐革兰阴性菌分类地位 需氧及兼性厌氧，可以耐受胆盐的革兰阴性无 芽孢杆菌，是包含大肠菌群在内的更大的一类菌 供试液制备 胰酪大豆胨肉汤-- 1:10供试液预培养 1:10供试液 20~25 ℃约2小时，细菌充分恢复但不增殖。耐胆盐革兰阴性菌未检出试验---标准中规定不得检出定量试验 ---标准中规定应小于101、102耐胆盐革兰阴性菌未检出试验1.2.预培养物---划线紫红胆盐葡萄糖琼脂有菌落生长---检出无菌落生长---未检出耐胆盐革兰阴性菌定量试验1. 取三个稀释剂预培养物分别接种肠道菌增菌肉汤 2. 划线紫红胆盐葡萄糖琼脂 3. 根据阳性或阴性结果查可能数表4. 判断1g或1ml供试品中含有耐胆盐革兰阴性菌最大可能数2、大肠埃希菌供试液制备 1:10供试液 （按计数法） 预培养 相当1g或ml供试液--适宜体积的胰酪大豆胨肉汤 30~35 ℃ 18~24h 选择增菌 取预培养物--麦康凯肉汤 42~44 ℃ 24~48h 分离培养 取麦康凯肉汤培养物--麦康凯琼脂平板 30~35 ℃ 18~72h 结果判断 麦康凯琼脂平板有菌生长 --- 分离、纯化及适宜的鉴定试验确证是否 为大肠埃希菌。是-- 判检出，否--判未检出 麦康凯琼脂平板无菌生长---未检出 关注： 1、增菌培养基未规定最低用量---适宜体积 2、增加预培养、增菌培养温度为42~44 ℃ 3、培养基变化 胰酪大豆胨肉汤 麦康凯肉汤 麦康凯琼脂 平板 4、取消MUG-I试验3、沙门菌供试液制备和预培养 预培养 样品10g或10ml―适宜体积的胰酪大豆胨肉汤 选择和分离培养 增菌 取预培养物0.1ml至10mlRVS（氯化镁孔雀绿沙门菌增菌培养基）增菌肉汤 分离 取少量增菌培养物―木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂 典型疑似菌 淡红色或无色 、透明或半透明，中心 有或无黑色 疑似菌―三糖铁高层斜面琼脂 高层穿刺斜面划线或采用其他适宜方式 鉴定 结果判断 1 、分离平板无菌落生长 2、 有菌落生长但结果阴性 3 、斜面不变红、底层不变黄；斜面黄色、底层不变黄不变黑 上述1、2、3均判未检出 三糖铁 1、 斜面红色 底层黄色； 2 、斜面黄色底层黄或黑色 适宜方法鉴定是否沙门菌，是判检出关注 ：培养基减少、改变； 预培养物取量减少（1ml―0.1ml）4、金黄色葡萄球菌供试液制备和预培养 预培养 相当 1g或 1ml供试液---适宜体积的胰酪大豆胨肉汤 选择和分离培养 甘露醇氯化钠琼脂 结果判断1 、有菌落生长 黄色菌落、或外周有黄色环的白色菌 落应分离纯化及 适宜的鉴定试验来确认是否为金黄色葡萄球菌2、无菌落生长或无上述疑似菌落生长、以及疑似菌鉴定为阴性 结果， 判未检出金黄色葡萄球菌3、疑似是菌鉴定为阳性结果，判检出金黄色葡萄球菌关注：减少培养基、未收载血浆凝固酶试验方法5、铜绿假单胞菌供试液制备和预培养 预培养 相当 1g或 1ml供试液---适宜体积的胰酪大豆胨肉汤 选择和分离培养 溴化十六烷基三甲胺琼脂 有菌落生长作氧化酶试验 氧化酶 1%二盐酸二甲基对本苯二胺试液阳性 30秒内红色-紫红色阴性 不变色结果判断 1、分离平板菌落 氧化酶阳性进行适宜鉴定试验，确认是否为铜 绿假单 胞菌，是判检出2、无菌落生长或鉴定结果为阴性时判未检出修订内容：增菌培养基BL改为预增菌胰酪大豆胨肉汤 溴化十六烷基三甲胺平板菌落未描述，均应作氧化酶试验 未收载绿脓菌素生化试验方法，强调适宜鉴定试验鉴定6、梭 菌供试液制备和热处理 选择和分离培养 过氧化氢酶试验 结果判断 梭菌增菌培养基 哥伦比亚琼脂培养基 厌氧培养（2010版为庆大霉素哥伦比亚琼脂培养基）1、哥伦比亚琼脂平板生长有带或不带芽孢的厌氧杆菌、过氧化氢酶阴性 ，应作适宜的鉴定试验确认是否为梭菌，是判为检出梭菌2、a 哥伦比亚琼脂平板未生长厌氧杆菌 b 疑似菌鉴定结果为阴性c 疑似菌过氧化氢酶阳性a、b、c均判为未检出梭菌 注意 1、培养基不加抗生素 2、厌氧杆菌未提革兰阳性7、白色念珠菌供试液制备和预培养 预培养 相当 1g或 1ml供试液---100ml沙氏葡萄糖肉汤 30~35 ℃ 3~5天（2010版 23~28 ℃ 48~72h） 选择和分离培养 沙氏葡萄糖琼脂 念珠菌显色培养基 30~35 ℃ 24~48h（2010版 23~28 ℃） 沙氏葡萄糖琼脂 疑似菌落呈乳白色，偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味， 培养时间稍长则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱褶。 疑似菌落转种念珠菌显色培养基 结果判断 1 、念珠菌显色培养基生长阳性菌落，作适宜的鉴定试验来确认是否为白色念珠 菌， 是判检出 2、无菌落生长或无上述疑似菌落生长、以及疑似菌鉴定为阴性结果，判未检出 白色念珠菌 关注：培养温度、时间改变各控制菌确认疑似菌关注点各控制菌项下确认疑似菌 体现出采用较少的生化实验，及均强调“采用适宜的方 法进行鉴定、确认。 在指导原则中指出----控制菌检查没有规定进一步确证疑 似致病菌的方法，若供试品检出疑似致病菌时，确认的 方法应选择已被认可的菌种鉴定方法，如细菌鉴定一般 依据《伯杰氏细菌鉴定手册》《非无菌药品微生物限度标准》参考欧美药典标准 限度标准由“数量”向“数量级”转变1、修订菌数标准表述方式：限度标准以指数形式10nCFU表示，最大 可接受限度值遵循2倍原则。 101cfu为可接受的最大限度为20； 102cfu为可接受的最大限度为200；以此类推。 虽然扩大了限度的标准，但是对过程控制的要求有了很大的提高， 培养基的营养能力也有很大提高，未来将向参数放行方向发展。124 Presentation title in footer | 00 Month 0000参考欧美药典标准2.检查指标 需氧菌总数：TAMC（替代细菌数） 耐胆盐革兰氏阴性菌（替代大肠菌群） 3.按照制剂类型进行分类控制 齿龈、皮肤制剂原辅料、中药提取物、中药饮片的控制呼吸道制剂耐胆盐革兰氏阴性菌的控制125限度标准制定原则及特点1、基于药品的9种给药途径及对患者的潜在危害划分风险等级，增加 控制项目 ? 齿龈、皮肤制剂、呼吸道制剂 严格控制潜在致病菌，从安全性角度考虑是否需无菌控制 ? 增加原辅料、中药提取物、中药饮片的控制 参考制剂的要求及生产工艺特点设置控制菌检查要求126非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准给药途径 需氧菌总数 霉菌及和酵母菌 （CFU/g、 总数（CFU/g、 CFU/ml或 CFU/ml或 CFU/10cm2） CFU/10cm2） 控制菌口服给药 固体制剂 液体制剂103 102102 101不得检出大肠埃希菌（1g）；含脏器提 取物的制剂还不得检出沙门菌（10g或 10ml）口腔黏膜给药制剂 齿龈给药制剂 鼻用制剂耳用制剂 皮肤给药制剂 呼吸道吸入给药制 剂127102101不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌（1g、1ml或10cm2）不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌（1g、1ml或10cm2） 不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、耐胆盐革兰阴性菌（1g 或1ml）102 102101 101非无菌化学药品及生物制品制剂的微生物限度标准给药途径 需氧菌总数 霉菌及和酵母 （CFU/g、 菌总数 CFU/ml或 （CFU/g、 CFU/10cm2） CFU/ml或 CFU/10cm2） 102 101 控制菌阴道、尿道给药 制剂不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、 白色念珠菌（1g、1ml或10cm2）,中药制剂还不得检出梭菌（1g、1ml 或 10cm2）直肠给药 固体制剂 液体制剂 103 102 102 102 不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 （1g或1ml）其他局部给药制 剂102102不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌 （1g、1ml或10cm2）化学药品制剂和生物制品制剂若含有未经提取的动植物来源的成份及矿物质还 不得检出沙门菌（10g 或10ml）。128非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准给药途径 需氧菌总数 （CFU/g或 CFU/ml或 cfu/10cm2） 104（丸剂3×104） 105 霉菌和酵母菌总数 （CFU/g或 CFU/mL或 cfu/10cm2） 102 5×102 控制菌固体口服给药制剂 不含豆豉、神曲 等发酵原粉 含豆豉、神曲等 发酵原粉 液体口服给药制剂 不含豆豉、神曲 等发酵原粉 含豆豉、神曲等 发酵原粉 固体局部给药制剂 用于表皮或黏膜不完整 用于表皮或黏膜完整不得检出大肠埃希菌 （1g）；不得检出沙门 菌（10g）；耐胆盐革 兰阴性菌应小于102cfu （1g）。 不得检出大肠埃希菌 （1ml）；不得检出沙门 菌（10ml）；耐胆盐革 兰阴性菌应小于101cfu （1 ml） 不得检出金黄色葡萄球 菌、铜绿假单胞菌（ 1g 或10cm2）；阴道、尿 道给药制剂还不得白色 念珠菌、梭菌（1g 或 10cm2）5×102 103102 102103 104102 102129 Presentation title in footer | 00 Month 0000非无菌含药材原粉的中药制剂微生物限度标准给药途径 需氧菌总数 （CFU/g或 CFU/ml或 cfu/10cm2） 102 102 霉菌和酵母菌总数 （CFU/g或 CFU/mL 或 cfu/10cm2） 102 控制菌液体局部给药制剂 用于表皮或黏膜 不完整 用于表皮或黏膜 完整102不得检出金黄色葡萄 球菌、铜绿假单胞菌 （1ml）；阴道、 尿道给药制剂还不得 白色念珠菌、梭菌 （1ml）130 Presentation title in footer | 00 Month 0000非无菌药用原料及辅料微生物限度标准 中药提取物及中药饮片的微生物限度标准需氧菌总数 霉菌和酵母菌总数 （CFU/g或 CFU/ml） （CFU/g或 CFU/mL） 药用原料及辅料 103 102 控制菌未做统一规定 因为原辅料可用于 生产不同剂型，控 制菌按照实际生产 的剂型进行控制 未做统一规定中药提取物103102中药研粉口服用 贵细饮片、直接 口服及泡服饮片未做统一规定未做统一规定不得检出沙门菌 （10g）；耐胆盐 革兰阴性菌应小 于104（1 g）131 Presentation title in footer | 00 Month 00002、兼顾国产药品的生产特点，保留中国药典对中药制剂分类特点 ? 是否含药材原粉、是否含豆豉神曲 ? 是否接触完整皮肤粘膜 3、贴剂 ? 因规格各异，以“10cm2”为单位控制限度132 Presentation title in footer | 00 Month 0000制药用水原水? 制药用水的原水通常为饮用水，要求符合GB
《生活饮 用水卫生标准》? 检测方法参照GBT 6 《生活饮用水标准检验方法 微 生物指标》134制药用水? 纯化水 采用循环方式保存（ 2010版GMP ） ? 注射用水 注射用水可采用70℃以上保温循环（2010版GMP） ? 灭菌注射用水 2010版GMP? 第一百条 应当对制药用水及原水的水质进行定期监测，并有相应 的记录。? 第一百零一条 应当按照操作规程对纯化水、注射用水管道进行清 洗消毒，并有相关记录。发现制药用水微生物污染达到警戒限度 、纠偏限度时应当按照操作规程处理。135 请根据报告内容更新2015版中国药典制药用水国家标准 检测 项目 纯化水 需氧菌 总数 检测量 不少于 1ml 检测 方法 薄膜过 滤法 培养基 国家标准R2A 琼脂培养基 每1ml 供试品中 30～35℃培养不 需氧菌总数不得过 100cfu 少于5天注射 用水需氧菌 总数不少于 100ml薄膜过 滤法R2A 琼脂培养基 每100ml 供试品中 30～35℃培养不 需氧菌总数不得过 10cfu 少于5天136 请根据报告内容更新Thank You!
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