实时荧光定量 PCR ―一科学准确的定量方法 实时荧光定量 PCR 技术于 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司推出，由于该技术 不仅实现了 PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规 PCR 相比，它具有特异性更强、有效解 决 PCR 污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 一. 实时荧光定量 PCR 原理 所谓实时荧光定量 PCR 技术，是指在 PCR
反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积 累实时监测整个 PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1.在荧光定量 PCR 技术中，有一个很重要的概念―― Ct 值。C 代表 Cycle，t 代表 threshold，Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如 图 1 所示）。图 1. Ct 值的确定 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR 反应的前 15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧 光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍， threshold = 10 ′ SDcycle 即：6-153. Ct 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线 性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表 Ct 值（如图 2 所示）。因此，只要获得未 知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。图 2. 荧光定量标准曲线 4. 荧光化学 荧光定量 PCR 所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料〔2〕。现将其原理 简述如下： 1） TaqMan 荧光探针： PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针， 该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时， 报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的 5’－3’外切酶活性将探针酶切降解， 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离， 从而荧光监测系统可接收到荧光信号， 即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成 完全同步。如图 3 所示。图 3. TaqMan 荧光探针工作原理 2）SYBR 荧光染料：在 PCR 反应体系中， 加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双 链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证 荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。 二．内标在传统定量中的意义 1．几种传统定量 PCR 方法简介〔3〕： 1）内参照法： 在不同的 PCR 反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引 物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在 PCR 产物中，由 于内标与靶模板的长度不同， 二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来， 分别测定其荧 光强度，以内标为对照定量待检测模板〔4〕。 2）竞争法： 选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。 在同一反应管中， 待测 样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化 PCR 产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高 效液相将两种产物分开， 分别测定荧光强度， 根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数 〔5〕 。 3）PCR－ELISA 法： 利用地高辛或生物素等标记引物， 扩增产物被固相板上特异的探针所结合， 再加入抗地 高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物， 最终酶使底物显色。 常规的 PCR－ELISA 法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的〔6〕。 2．内标在传统定量中的作用 由于传统定量方法都是终点检测，即 PCR 到达平台期后进行检测，而 PCR 经过对数 期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在 96 孔 PCR 仪上做 96 次重复实验， 所得结果有很大差异（见图 4），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标 后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作 半定量、粗略定量的方法。图 4. 相同模板在同一台 PCR 仪上进行 96 次扩增的扩增曲线图 终点处检测产物量不恒定； Ct 值则极具重现性 三．内标对荧光定量 PCR 的影响 1．实时荧光定量 PCR 无需内标实时荧光定量 PCR 技术有效地解决了传统定量只能终点检 测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对 每个样品 Ct 值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量 PCR 无需内标是 建立在两个基础之上的：1）Ct 值的重现性 PCR 循环在到达 Ct 值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期 （对数期），此时微小误差尚未放大，因此 Ct 值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增 或同一时间不同管内扩增，得到的 Ct 值是恒定的。（见图 4） 2）Ct 值与起始模板的线性关系由于 Ct 值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标 准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量 PCR 是一种采用外标准曲线定量的 方法。 2．内标对实时荧光定量 PCR 的影响若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则 PCR 反应变为双重 PCR，双重 PCR 反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的 起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著〔7,8〕。但由于待测样品的起始拷 贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方 法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。 美国 Texas 大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结 论是： 内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的， 而外标准曲线的定量方法是一种准确的、 值得信赖的科学方法〔9〕。 Applied Biosystems 公司的 7700 型实时荧光定量 PCR 仪是全球公认的荧光定量 PCR 的 金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进 行定量。 综上所述，利用外标准曲线的实时荧光定量 PCR 是迄今为止定量最准确，重现性最好 的定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、 病原体检测等诸多领域〔10,11,12,13〕。 乙型病毒性肝炎 1.乙肝的概念 乙肝是由 HBV 引起的世界性传染病。 全世界约 3 亿多乙肝表面抗原(HBsAg)携带者， 其中 我国约占 1．3 亿人，且 1／4 的携带者可发展为慢性肝病。通过母婴传播，新生儿感染 HBV 后约 80％一 90％可成为慢性 HBV 携带者，根据有关资料统计计算，每年约有 80?00 万新生 儿成为 HBV 携带者，其中一部分婴儿当成年后发展为肝硬化及肝癌，直接影响下一代健康。 乙肝的传染源是急性和慢性乙肝病人及 HBV 携带者，其中以慢性乙肝病人和携带者为最 重要。黑猩猩、长臂猿等灵长类动物也可为传染源，但意义不大。 乙肝黄疸型与非黄疸型的比例为 1：100。由于无黄疸型比例高，常被误诊。因此，该型 是乙肝极为重要的传染源。2.乙肝的传染途径 乙型肝炎传播途径广而复杂，大致可归纳为以下几方面： (1)医源性传播医源性传播是乙肝的重要传播途径之一；它主要通过输血或血制品，或被病人的血液或 体液污染的医疗器械及物品， 或意外摄入污染的血液和体液等， 使乙肝病毒经皮肤或粘膜进 入人体而感染。医务工作者与患者之间，患者与患者之间，均可存在直接或间接地传播。 (2)母婴传播 母婴传播是世界性乙肝传播途径。我国母婴传播率平均为 60％。孕妇发生乙肝的时间距 离分娩日期越近，婴儿感染乙肝的危险性越高。怀孕头 6 个月发生乙肝，有足够的时间产生 抗体，使胎儿获得保护，仅 6％的婴儿受感染；怀孕最后 3 个月发生乙肝，69％婴儿受感染； 产后头 2 个月发生乙肝，75％婴儿受感染。妊娠后期感染率增高的原因可能与胎盘的渗漏、 宫缩及较易通过胎盘有关。 HBV-DNA 阳性产妇的新生儿 HBsAg 阳性率明显高于 HBV-DNA 阴性产妇的新生儿。凡是 HBV-DNA 在母亲血清中浓度大于 10pg／10ul，即使其子女出生时接受 HBIG 和乙肝疫苗的联 合预防，也难以阻止 HBV 感染。 HBeAg 阳性母亲所生的婴儿中有 85％成为 HBsAg 携带者， HBeAg 阴性母亲所生的婴儿 而 仅有 31％成为 HBsAg 携带者，抗-HBe 阳性母亲所生的婴儿仅 12．3％成为 HBsAg 阳性。 母亲血清中 HBsAg 滴度越高，婴儿感染 HBV 的百分率越高。当母亲血 HBsAg 滴度为 1： 32，1：128，1：256 和 1：512 时，婴儿感染 HBV 的百分率分别为 22.2％、50％、65.2％和 88.8％。 分娩时携带 HBsAg 母亲的阴道分泌物和刚出生的新生儿咽喉部分泌物、胃内容物 HBsAg 阳性率达 95％以上，羊水为 30％以上。HBsAg 阳性母亲的乳汁、唾液、月经血中均可检到 HBsAg。发生母婴传播的原因：①母血通过胎益渗入胎儿； ②母血或母亲其他含血体液感染婴儿表面创伤或眼结膜； ③婴儿在分娩过程中经口吞下母血、羊水或阴道分泌物。 (3)性接触传播 性接触是乙肝的重要传播途径。乙肝或 HB3Ag 携带者的唾液、精液和阴道分泌物中均可 检测到 HBV，因此，可通过接吻、性交将 HBV 传给对方。 (4)非肠道外途径传播 ①粪(尿)-口途径传播 在乙肝病人粪便和尿中均可检测到 HBsAg 存在，且证明有传染性。 粪便污染严重的地区， 乙肝发病率较高， 且有乙肝经水传播和日常生活接触暴发的报道。HBV 感染的家庭聚性， 有调查材料证明， 双亲 HBsAg 阳性， 子女阳性率 100％， 双亲 HBsAg 阴性，子女阳性率为 44．4％，父亲 HBsAg 阳性，子女阳性率为 56．4％，母亲 HBsAg 阳性， 子女阳性率为 61．9％。 ②唾液-口途径传播 急性乙肝病人的唾液检出 HBsAg 达 76％。 无症状 HBsAg 携带者的唾液检出率为 37.63％。 有人用电子显微镜检查乙肝病人的唾液标本，发现直径约为 20nm 的球形颗粒，说明乙肝病 毒可随乙肝病人的唾液排出。由此说明乙肝通过唾液-口途径传播。 ③血-口途径传播 有资料报道，从病人血标本检测的实验室工作人员，误将血清吸入口中。在抢救患乙肝 大出血的病人、外科医师、病理医师、护士等乙肝发病率较高，除了病人的粪尿和其他体液 因素外，血-口传播也起到一定的作用。 (5)吸血昆虫传播 经国内外不少医学专家们对蚊虫、臭虫、虱和蠓进行了大量研究，这些吸血昆虫均具有 机械地传播 HBV 的作用。3.乙型病毒性肝炎有哪些类型？有哪些临床表现？ 乙肝的表现比较复杂，与人体的免疫状态甚为密切。免疫反应强烈者可发生急性重症肝 炎， 细胞免疫功能低下者易变为慢性肝炎或慢性病毒携带者， 与抗肝细胞膜成分抗体直接损 伤肝细胞’或与抗体依赖性淋巴细胞毒反应(ADCC)的肝损伤有关。肝细胞基因组 HBV-DNA 整合和乙肝病毒基因的变异可导致肝炎慢性化。Tc 细胞在识别肝细胞膜上病毒抗原后，攻 击肝细胞，使之释放 HBV，如机体免疫功能低下，难以清除 HBV，呈长期持续 HBV 感染，最 终可导致肝癌的发生。由于这些原因，可导致发生以下几种临床类型。 (1)急性乙肝超病隐匿，一般发热不显著，在前驱期或黄疸前期多见血清病样反应，如皮 疹、关节痛。一般表现为乏力、厌食、恶心、呕吐、肝区痛等。在症状显著者肝功检查异常， 大部分病人均无明显症状，体检时可发现肝肿大，有少数病人可搞及脾大。急性无黄疽型占 急性乙肝病例 2／3 以上，病程约 3 个月，急性黄疸型占乙肝病 1／3 以下，病程平均 1 个月 左右。 (2)慢乙肝是指急性肝炎病程超过半年以上未愈者。 反复出现消化道症状、 肝区不适或肝 脾肿大、压痛、质地改变，肝功能起伏波动很大，皮肤黝黑、蜘蛛痣、肝掌以及伴外多脏器 损害，如关节炎、肾炎、结肠炎、甲状腺炎、心肌炎、胸膜炎和眼口干燥综合征等。如不进 行积极治疗控制病情发展，很容易发展为肝硬化甚至肝癌。 (3)重症肝炎此型病人往往以急性肝炎起病，常出现危急症状，在发病后 10 天内出现肝 昏迷等症状者称为急性重型，在发病后 10 天以上出现肝昏迷者称为亚急性重型肝炎。①急性重症肝炎(暴发型肝炎、急性肝坏死) 急性肝炎起病，黄疸逐日加深，有明显出血倾向，肝萎缩、肝臭、烦躁不安、谵妄、定 向力或计算能力障碍、嗜睡昏迷。多数呈现脑水肿伴肝肾综合征、少尿尿闭或氮质血症。血 清总胆红素大于 171umol／L 以上，胆碱酯酶降低及凝血酶原时间延长。 ②亚急性重症肝炎除具有急性重症肝炎的临床表现外，有高度乏力、腹胀、厌食及腹水 或肝昏迷、肝肾综合征及变为坏死性肝硬化。 ②慢性重症肝炎也称慢性肝炎亚急性肝坏死。表现同亚急性肝坏死，但其基础于慢性肝 炎、肝硬化及其他慢性肝功能损害者。 ④淤胆型乙肝一般均以急性肝炎起病，随病情的发展，症状体征恢复但黄疽与日渐增， 且类似其他肝内胆汁淤积型表现。 但要除外胆内外胆道系统病变或梗阻引起的黄疸。 此型一 般预后良好。4.体检发现 HBsAg 者应做哪些检查? 要根据当地医院的条件而定。’ (1)乙肝感染指标两对半(或三对)及 HBV-DNA。 (2)同时查肝功能：ALT、AST，A／G、TBI(总胆红素)，一分钟，胆红素，ALP(碱性磷酸 酶)，GGT(Y 谷氨酰住∧?。 (3)肝脾 B 型超声检查，以了解肝脾形态改变。5.乙肝表面抗原在体内存在的时间有多长? (1)HBsAg 出现时间 感染乙肝病毒后，HBsAg 为首先出现的病毒标志物。从感染到血中出现 HBsAg 的时 间间隔，与接种和感染的途径及其数量有关。如数量大，则时间间隔短，约 2 ?/FONT&3 周。如输入 HBsAg 阳性的血液，在输血后 2 周可检测出 HBsAg。用放射免疫法检测，可在接 种后 6 天检测到 HBsAg。如数量小，则间隔时间长，可达 3?/FONT&4 个月，长达 6 个月以上。 一般在感染后 29?/FONT&43 天或(18?/FONT&84 天)出现。(2)出现与肝炎症状出现的时间 一般在 HBsAG 出现后 1?/FONT&7 周(平均 4 周)出现肝炎症状和肝功能异常，此时常常接 近 HBsAg 滴度达高峰时间。 有人认为症状和肝功能异常出现的早迟与感染途径有关， 经血感 染者 65 天，经口感染者 98 天在血中出现 HBsAg。(3)HBsAg 持续时间在自限性感染时，大多数病人的 HBsAg 在血中持续时间为 1?/FONT&6 周；最长可达 20 周。一般在肝炎症状出现后 1?/FONT&4 周内大多消失。通常在患者血清转氨酶达高峰后 1?/FONT&12 周消失，如超过 6 个月仍不消失，患者可能变为慢性肝炎及慢性乙肝病毒携带 者。(4)HBsAg 自发清除率 HBsAg 携带者的自发清除率不一，与病毒是否整合于肝细胞，病毒有无基因变异与病人 自身免疫系统功能状态有关。 国内资料报告为 28.1％， 国外报告最高为 4.5％。 什么叫 HBsAg 无症状携带者? 国内外医学家们通过大量的临床及实验研究， 提出 HBsAg 无症状携带者应符合以下三条 标准： (1)血清中 HBsAg 持续阳性半年以上； (2)肝功能基本正常；无临床症状和体征； (3)组织学检查大多有轻微的炎症或非特异牲变化。 HBsAg 无症状携带者的 H8sAg 持续存在血中可达数年、数十年，甚至终生。虽然无症状 和体征，肝功也大多正常，但肝组织都有不同程度的损伤。因此，临床上已不再使用所谓的 HBsAg 健康携带者这一名词。而将其视为乙肝病毒慢性轻度感染的一种隐匿过程，这样可能 更客观地反映实际状况， 对已符合上述三条标准的无症状 HBsAg 携带者， 作为携带者本人和 医师均不能完全忽视，要定期半年至 1 年要复查乙肝三对(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、 HBcAg、HBcAb)和 HBV-DNA 以及肝功能。随时了解动态变化。6.长期表面抗原阳性是什么原因? HBsAg 持续阳性的原因是 HBV-DNA 已与宿主细胞 DNA 发生了整合，整合后的 HBV-DNA 只 能表达 HBsAg，不能表达 HBeAg 和 HBcAg，DNA 也不能复制，故不能装配成完整的病毒颗粒， 血中只有其外壳(HBsAg)是不会传染的。现所有的抗病毒药物对这种整合型的 HBV 无清除能 力，不能进入细胞内杀灭病毒，只对细胞外病毒有一定效果。 整合后的 HBV 会不会再度活跃并能复制，长期整合在病人细胞 DNA 中会不会诱导癌变等 问题尚有争议，有待进一步研究，但要定期(半年到 1 年)复查，如有临床症状表现，应及时 到医院检查，了解其动态变化。 7.HBsAg 无症状携带者的演变过程及转归 大致可分为以下 4 种情况。 (1)经过一定时期的携带后，部分 HBsAg 携带者可自发清除体内的 HBsAg。血液中出现乙 肝表面抗体(抗-HBs)。此时机体已产生清除 HBsAg 的能力。(2)持续稳定的 HBsAg 无症状携带状态，可达数年、数十年，甚至终生，且无组织学和 肝功能等变化。 (3)有部分无症状 HBsAg 携带者可出现肝功能异常， 发生急性肝炎。 此种情况要与非 HBsAg 搓带者或急性乙肝相区别： ①从病史中可了解到患者家庭成员中有慢性乙肝或 HBsAg 携带者，本人以前为 HBsAg 携 带者。 ②除 HbsAg 阳性外，发病初期有高滴度的抗-HBc。 ②HBsAg 与 HBeAg 持续阳性者，并易发展为慢性乙肝。 (4)个别 HBsAg 无症状携带者可变为慢性．肝炎、肝硬化及原发性肝细胞癌。虽然乙肝病 毒在肝癌中的确切作用尚不清楚，但确是诱发肝癌的首要因素。8.什么叫乙肝表面抗体?有什么意义? 当感染乙肝病毒后，如出现乙肝表面抗体阳性，表示人体受乙肝病毒感染后进入肝炎恢 复期。如在体检发现抗-HBs，则说明既往有过乙肝病毒感染或接种过乙肝疫苗；抗-HBs 是 一种保护性抗体，如果体内能维持相当高的滴度，可防止一般乙肝病毒再次感染，如输入含 有一定数量乙肝病毒的血液，也不能 100％保证，不再受乙肝病毒的感染。’ 约 10％一 20％发生关节炎和皮疹伴有免疫复合物的乙肝患者， HBsAg 血症和肝炎症状 在 开始时可检出抗-HBs。 绝大多数自限性 HBV 感染者， 仅在血中 HBsAg 消失后才检测出抗-HBs。 很多病人在 HBsAg 刚消失时，即使用最敏感的检测方法，也不能检测出抗-HBs。约 1／2 的 自限性乙肝病毒感染者，其 HBsAg 消失到抗-HBs 出现之间的间隔时间可达数月。约 10％一 过性 HBsAg 血症患者检测不出抗-HBs。在乙肝恢复期，抗-HBs 逐渐上升，可持续多年。 抗-HBs 出现的迟早，与以往是否感染过乙肝病毒有关，首次感染者出现较迟，再次感染 者出现较早。首次感染也可表现为隐性感染，肝功能检查及肝组织学检查均为正常，多数病 人在感染后 4-5 个月时出现抗-HBs，且滴度不高，持续 6 个月至 3 年后消失。 再次感染者不出现 HBsAg。如果过去已有隐性乙肝病毒感染，则抗-HBs 滴度低，不能防 止乙肝病毒感染。在再次感染乙肝病毒后，2 周内即出现抗-HBs，且滴度较高。慢性 HBsAg 搜带音，不应有抗-HBs 阳性，但当 HBsAg 消失后，抗-HBs 可迅速出现。这是因为 HBsAg 携 带者液体免疫不完全，机体产生的少量抗体(抗-HBs)已结合于抗原抗体复合物中。 因此，该抗体既不能检出，又无法对病毒产生足够的免疫反应 o9.有单一的抗 HBs 阳性存在吗?在注射过乙肝疫苗或高价乙肝免疫球蛋白(HBIG)后出现单一的抗-HBs 是正常现象， 说明 疫苗和免疫球蛋自已产生了免疫效应。在正常人群中有 5％一 10％的人仅检出单一抗-HBs， 大多数滴度较低，可能是非特异性反应，HBcAg 比 HBsAg 的免疫原性强，抗-HBc 比抗-HBs 的滴度相对要高得多，因此，只出现抗-HBs 而不出现抗-HBc 是较少见的；虽有单一较高滴 度的特异性的抗-HBs， 常是无保护性的抗-HBs-IgM， 并不表示乙肝病毒感染的恢复或存在对 乙肝病毒的免疫。10.有些 HBsAb 阳性者病情已好转，偶尔还有 HBV-DNA 检测阳性?如何解释？ 绝大多数 HBsAb 阳性者，可以认为是过去感染有一定的免疫力，但也有 10％左右可有 HBsAg 或 HBV D NA 阳性。可能是处于病毒清除过渡期，HBsAg 逐渐清除且 HBsAb 也出现，仍 有残存病毒未彻底清除。但要注意有变异株感染的可能产生。HBsAb 虽因自然(野生株)感染 或接种疫苗而产生，但对后来的 HBV 变异株却不起作用，因此仍有 HBsAg 和 HBV D NA 的表 达而检出。 型的 HBV 都有簇抗原 a，免疫原性很强,抗 a 抗体可以抵抗任何亚型的 HBV 感染。通过近 几年的大量研究认为，HBV 的 S 基因变异，其编码合成的 HBsAg 的特性随之改变，同时存在 由原型毒株应答产生的 HBsAb，就不能与之结合而清除变异株的抗原，是 HBsAg 和 HBsAb 并存的常见原因 o11.如何诊断乙型肝炎? 乙肝的诊断较为复杂，分为急性乙肝，慢性乙肝，重型乙肝，慢性乙肝病毒携带者、乙 肝表面抗原携带者。 根据流行病学、 临床症状、 体征，乙肝病毒血清学标志，病毒复制标志， 肝功，基因变异，基因的整合，免疫学等有关知识综合进行判断。临床工作者，不要一看到 乙肝 2 对半的结果，随便表态，走两个极端，一是把病情说得根本无病，这样使病人对自己 病情根本不重视，结果不久或数年后变为慢性肝炎、肝硬化，有的很快恶化而死亡。二是有 的医师把很轻的病人，甚至把已经康复的病人说得很重，开上上千元的大处方，使病人精神 负担很重，且导致经费上浪费。因此，告戒医师，遇到乙肝病人，如没有这方面专业知识和 临床经验，不要信口开河，乱下结论，应指导病人到专科请专科医师诊疗。患者自己应到具 有专科的技术及条件好的医院求医，不要相信报刊，各种广告媒介的宣传，更不能请社会上 的游医诊治，否则给你带来严重的后果。12.乙型肝炎的预后如何? 乙肝病人，如能在急性期及时发现，积极进行综合性合理治疗，大部分是能顺利恢复健 康的，但体内乙肝病毒的有关免疫成分却很难清除，故常常变为慢性，迁延数年，反复肝功 能受损(肝病活动)，终至变为肝炎肝硬化甚或转为肝癌。感染乙肝病毒后可出现下列几种情况： (1)亚临床感染，无症状，又未经过疫苗注射，但血清抗-HBs 阳性； (2)急性肝炎，如果发病后 HBsAg 持续阳性达 6?2 个月以上，有可能转为慢性； (3)无症状携带者； (4)感染后 HBsAg 的滴度高于抗 HBs，形成较小分子的 HBsAg／抗-HBs 免疫复合物，引起 慢性肾小球肾炎、结节性动脉周围炎等并发症; (5)慢性肝炎反复活动可发展为重症肝炎。 一般而言，乙肝病毒感染后约 85％完全恢复，5％呈携带状态(HBsAg 阳性)；5％一 10％ 呈慢性肝炎，约 1％一 4％呈暴发性肝炎或融洽性坏死，1％发展为肝硬化或肝细胞癌。 乙肝病毒感染与原发性肝癌关系密切。从分子生物学角度来看，乙肝病毒与肝癌发病关 系有以下几方面： (1)乙肝病毒 DNA 整合， 是乙肝病毒感染后造成肝细胞基因组严重失去稳定性的标志， 可 能引起 DNA 的重排，以及 DNA 的丢失，因而激活或抑制一些与生长基因有关的表达，可能引 致肿瘤的发生。 (2)肝癌中游离复制型的 HBV D NA 多为缺陷型病毒，不能产生完整的病毒释入血液，认 为这种缺陷型病毒可能与致癌有关，亦可能为伴随现象。 (3)HBV 可能相当于促癌剂，由于肝细胞增殖，造成化学致癌引起突变的细胞，经克隆选 择而获优势，并形成增殖的病灶。 (4)HBV 感染，使肝细胞对化学致癌物的代谢及 DNA 修补过程，增强了化学致癌物的改变 和致癌作用。 HBsAg 携带者的预后，经过系统的观察，包括肝穿刺活组织检查后证明，HBsAg 携带者均 存在不同程度的病变， 随时间长短而分别表现为各型肝炎、 肝硬化或肝癌。 有资料显示 HBsAg 携带者追踪观察 12 年，其中 43％发生肝炎。从携带到发生肝炎的最短时间 1 个月，最长 11 年。平均 5.4 年。13.什么是乙肝的“大三阳”和“小三阳”，有何意义？ 乙肝“大三阳”是一个不科学的通俗叫法，一般是指乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝 e 抗原（HBeAg）、及乙肝核心抗体（HBcAb）阳性者。其说明体内乙肝病毒存在，而且乙肝病 毒复制活跃，传染性较强。乙肝“小三阳”是指 HBsAg、HbeAb、HbcAb 三项阳性，表明乙肝病毒复制减少，传染性 减少。14.有无能使乙肝表面抗原转阴的药物? 目前还没有能够肯定能使 HBsAg 阴转的药物。近来电视台、电台、报刊等大肆宣扬某人 是“乙肝转阴王”，特别强调能把 HBsAg 阴转，这些宣传是缺乏科学依据的。再次告戒患者 不要轻易地相信广告宣传。HBsAg 阳性的患者每年可有 1％一 2％的自然阴转率，也就是说， 不经任何治疗，这些患者中 HBsAg 会自然转阴，特别是 HBsAg 滴度很低患者更容易阴转。在 临床诊疗中常遇到病人述说：“某医师医术很高，几针药打下去，几付中药服完后 HBsAg 阴转了”。这实际上是医师恰好遇到 HBsAg 滴度很低(1：16 或 1；8 等)，很快就会自然转 阴的患者。近年经过广大医药工作者的艰苦努力，也研制出一些对 HBsAg 阴转的药物，但疗 效很低，一般不超过 10％。下面介绍对 HBeAg 阴转的药就有使 HBsAg 阴转的作用。但仍不 令人满意。有待进一步研究开发。目前，还以干扰素治疗为主，但有效率也仅为 40?0%。15.能使乙肝 e 抗原转阴的药物 1. 2. 3. 4. 5. 6. 潘生丁与卡介苗合用 肝炎灵（广豆根）注射液 猪荟多糖与乙肝疫苗合用 单磷酸阿糖腺苷（Ara-AMP）与胸腺肽合用 干扰素 日达仙（胸腺肽 a1）16.干扰素的疗效评价 干扰素治疗有效者，常有 ALT 水平下降或复常(在治疗中有可能出一过性上升，然后下 降)，HBV 复制指标，HBsAg、HBV-DNA 转阴，病情稳定，一般情况改善。其疗效可达 50％以 上。有部分病人在治疗有效后停药 6?2 个月出现复发，但再用干扰素仍有效。 现阶段的各种治疗方法和药物很难达到清除 HBsAg 的目的，干扰素治疗慢性乙肝，使 HBsAg 阴转也令人不满意。 因此， 不能要求过高， 目前不能把 HBsAg 阴转作为主要治疗标准。 干扰素治疗慢性乙肝虽不尽人意， 但它的效果却是科学与客观的， 经过世界各地反复临床验 证和严格考核的，完全可以信赖。干扰素不但可抑制乙肝病毒的复制和清除乙肝病毒，且能 大大改善肝脏组织学病变，防止肝硬化、肝癌的发生。到目前为止，用一种药物治疗慢性乙 肝、抗病毒作用方面，还没有哪一种药物能与干扰素媲美。 24.治乙肝宜联合用药目前治疗慢性乙肝的药物有数十种，如何选择有效药物，如何联合用药呢？下面介 绍几种经临床验证确有疗效的药物及联合用药方案。 干扰素对成人期感染、转氨酶增高（ALT）、有病毒复制的患者疗效好，使用半年至一 年后，可使 30％～40％患者 HBV－DNA 或 HBeAg 转阴，肝功能恢复。但部分患者疗效差，且 价格较昂贵，不良反应也较多。 核苷类药物其中拉米夫定可抑制病毒复制，减轻肝脏坏死、炎症、纤维化，改善肝功。 但需长期服用，并注意耐药性的产生。 苦参素注射液为野生植物苦豆子提取药， 是国家“九五”攻关“慢性乙肝药物治疗新方 案研究”课题用药。 该药有抑制乙肝病毒作用， 用药 3 个月后对乙肝患者 HBeAg 与 HBV－DNA 阴转率分别为 44.4％和 45.3 ％，还可以改善肝功、退黄、防止肝硬化、升高白血球，迄今未发现明显不良反应，药费仅 为干扰素 1／10。 为提高疗效，防止复发，最好联合用药，即抗病毒药物加免疫调整药等，如：苦参素＋ 左旋咪唑涂布剂、苦参素＋胸腺肽、干扰素＋苦参素、干扰素＋拉米夫定、苦参素＋拉米夫 定＋大黄庶虫丸等在临 床上均有应用。如果再加保肝、抗纤维化药物，可防止肝硬化发生或发展。 25.肝炎病毒“数”着治 目前检查乙肝最常用的方法是乙肝病毒抗原和抗体的测定， 即“乙肝全套”。 但此项检 查的是乙肝病毒的抗原和人体对这些抗原的免疫反应， 并不能代表病毒本身， 无法知道体内 病毒的多少。另一方法是 PCR，多年的临床实验证明，常规 PCR 假阳性率、假阴性率太高， 重复性差，且不便定量。近年，新研制成功的荧光定量 PCR 的出现为乙肝的检测诊断提供了 新手段，大量临床标本测定结果证明，其特异性为 100％， 灵敏度可达 0.01fg （10－12mg）， 相当于 2.5 个乙肝病毒颗粒。荧光定量 PCR 对下列情况更是具有独特的诊断价值： 治疗前病人的筛选拉米夫定、 干扰素的疗效与病人体内的病毒量有密切关系， 治疗前进 行病毒定量检查，可以指导选择抗病毒药物，避免盲目用药。 治疗后疗效的观察由于乙肝全套结果不能反映体内病毒量的多少， 因此不能准确地判断 药物的疗效，而荧光定量 PCR 直接准确地测定体内病毒数量，有助于疗效的判断。 优生优育指导孕妇体内乙肝病毒的多少是影响乙肝宫内感染的重要因素。 怀孕前进行荧 光定量 PCR 检查，有助于选择有利的怀孕时机。乙肝孕妇进行荧光定量 PCR 检查，有助于准 确估计宫内感染的危险性。 疑难病人的诊断目前尚有 10％～15％的病毒性肝炎病原不明，用荧光定量 PCR 检查可 使部分病人得到及时的正确的诊断。 乙肝抗体阳性者的复查近年研究表明， 少数乙肝抗体阳性者体内仍存在乙肝病毒， 特别 是有肝炎症状和体征、肝功能异常的人更应进行荧光定量 PCR 检查，以促进病人康复。 乙肝的早期诊断在表面抗原出现以前即可确定是否感染了乙肝。26.肝炎患者少食蒜大蒜的有效成分具有较强的抗菌作用，对白喉、痢疾、伤寒、结核杆菌都有较强的抑菌 和杀菌作用，但迄今为止，尚未发现大蒜有抗肝炎病毒的 作用。相反，大蒜的某些成分对胃肠道有刺激作用，可抑制胃消化酶的分泌， 影响食欲和食物的消化吸收。据研究，大蒜 的挥发油可使血中红细胞、血红白减少，引起贫血等病，对肝炎患者的治疗和康复很不利。
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