51利用荧光蛋白对大肠杆菌蛋白质Tat转运系统的研究
上亿文档资料，等你来发现
51利用荧光蛋白对大肠杆菌蛋白质Tat转运系统的研究
生物化学与生物物理学报；ISSN；ACTABIOCHIMICAetBIOPHYSI；CN3121300ΠQ；利用荧光蛋白对大肠杆菌蛋白质；Tat转运系统的研究；张明；1,2,3；潘仁瑞余增亮吴龙飞；112；(1,;；法国国家科学研究中心细菌化学研究室,马赛1340；摘要,结果表明海葵红色荧光蛋白聚集在细胞质内,T；Tat系统,但是海葵红色荧
生物化学与生物物理学报ISSNACTABIOCHIMICAetBIOPHYSICASINICA):702-706CN3121300ΠQ利用荧光蛋白对大肠杆菌蛋白质Tat转运系统的研究张　明21,2,3　潘仁瑞　余增亮　吴龙飞1123(1,;法国国家科学研究中心细菌化学研究室,马赛13402cedex3)摘要　　,结果表明海葵红色荧光蛋白聚集在细胞质内,T信号肽和Tat转运酶的共同作用下,以折叠形式转运至周质空间。,。同时,揭示了Tat信号肽需要一定的高级结构才能行使功能;Tat信号,而且也参与蛋白质的折叠。因此,绿色荧光蛋白是非常理想的报告蛋白,可用于研究Tat系统,但是海葵红色荧光蛋白易于聚集而不适合于此目的。关键词　　荧光蛋白;报告蛋白;Tat转运系统;信号肽;蛋白质折叠　　细菌蛋白质Tat转运系统是1998年在大肠杆菌中发现的一种蛋白质转运系统,因被转运的底物信号肽上含有双精氨酸(RR)保守序列核心SΠT2R2R2x2[1～9]F2L2K,所以称为Tat(twin2argininetranslocation)转运系统。这些底物是一些与细菌厌氧呼吸和细菌分裂有关的酶或蛋白质,所以Tat转运系统与细菌的生命活动有着十分密切的关系。底物蛋白除含有双精氨酸信号肽(Tat信号肽)这一特性外,还以折叠的形式转运,未折叠的线状蛋白质则通过Sec转运系统。大肠杆菌Tat转运系统的功能单位Tat转运酶由三种Tat蛋白(TatA、TatB和TatC)组成。蛋白质序列分析表明Tat蛋白都是穿膜蛋白,经免疫共沉淀实验证实了TatA、TatB和TatC共存于细胞[10～12]膜上,分离了TatAB和TatABC复合体。并在体外反应体系中组装了具有活性的TatABC复合[13]体。TatB和TatC是Tat转运酶的重要成分,近来的研究还表明TatC的氨基酸种类和分布对转运功[14～16]能有着重要的影响。这些研究进展对Tat转运系统的进一步研究无疑有很大的促进作用。自Tat转运系统发现以来,多以天然依靠Tat转运系统转运的酶作为报告蛋白,如大肠杆菌的三甲胺基2N2氧化物还原酶[TMAO(trimethylamineN2oxide)reductase,TMAO还原酶]、氢化酶22(hydroge2nase22)等厌氧呼吸酶。一般通过酶活性或蛋白质印迹等方式来测定酶的转运与否和转运的多少,但这些指标会受酶活性测定条件及测定的敏感性等的影响。为了建立更为直接、方便的检测手段,尝试用海葵红色荧光蛋白(DsRed2)和水母绿色荧光蛋白(GFP)作为报告蛋白,将TMAO还原酶的信号肽(TorA2RR)基因与荧光蛋白基因重组来研究细菌蛋白质Tat转运系统。由于荧光蛋白正确折叠后才能[17]形成荧光,所以可根据荧光的有无和分布确定荧光蛋白的折叠和转运状况;通过定量测定荧光的强弱确定Tat转运系统的转运效率,从而明确影响转运的因素。本研究表明,连接在TorA2RR信号肽下游的红色荧光蛋白在大肠杆菌中虽可正确折叠后产生红色荧光,但不能转运至周质空间。经同样处理的绿色荧光蛋白可正确折叠,并以折叠形式在Tat蛋白的参与下转运至周质空间。进一步以赖氨酸(K)不同程度地取代信号肽中的精氨酸形成新的信号肽(TorA2KR,TorA2RK和TorA2KK),以研究精氨酸对绿色荧光蛋白转运的影响。发现转运效率与取代的精氨酸位置有一定的相关性。揭示精氨酸是绿色荧收稿日期:　　接受日期:欧盟“INCOindividualfellowshipsforyoungresearchersfromdevelopingcountries”(No.IB12CT)、中国科学院海外杰出学者基金资助(No.)3联系人:Tel,+;Fax,+;e2mail,rs2mrs.frAug.,2003张　明等:利用荧光蛋白对大肠杆菌蛋白质Tat转运系统的研究703光蛋白高效率转运所必需的,而且第二个精氨酸比第一个精氨酸更重要。这种一级结构的改变导致介导转运功能的降低或丧失,说明信号肽一级结构的变化可能影响高级结构的形成及被Tat系统有效地识别,进而影响其功能。同时,显示Tat信号肽对蛋白质折叠和转运都有至关重要的作用。公司合成。采用ExpandhighfidelityPCRsystem(RocheMolecularBiochemicals)在梯度PCR合成仪合成。酶切鉴定扩增片段。1.2.4　扩增片段的基因克隆和序列分析　　绿色荧光蛋白基因PCR产物经纯化后,用NheI和Hin2dIII酶切后克隆到质粒pRR2colV相应位点。红色荧光蛋白基因PCR产物经纯化后,用NheI和NotI酶切后克隆到质粒pRR2gfp,连接转化TG1后,在,,,DNA序列测定由。2gfp和pRR2DsRed2转化　　转化pRR2gfp和pRR2DsRed2到MC4100A及各tat基因缺陷株B1LKOA、BODA、ELV16A和SecY基因缺陷株CU164A中。显微镜观察荧光分布并用CCD相机(ColorCoolViw,PhotomicSciences)摄像并处理(Im2agePro2Plussoftware)。1.2.6　细胞各组分的制备　　细胞培养如前,添加0.2%阿拉伯糖诱导荧光蛋白基因表达。收获细胞采1　材料和方法(MaterialsandMethods)1.1　材料1.1.1　菌株和质粒　　实验菌株TG1(Δ(lac2pro)Δ5ΠF’traD36proA+B+lacZΔsupEthihsd-MC4100A(FΔ(argF2lac)U169+flb5301deoC1MC4100AΔ(ΔtatB)、ELV16A(如同ΔtatA)和CU164A(如同[18,19]MC4100AsecY39cs,zhd233∷Tn10)。质粒p2DsRed2(amp,DsRed2)购自Clontech公司、pRR2DsRed2(amp,DsRed2克隆于pRR2gfp)、pgfpmut2R(ampR,gfpgene)[17]、pRR2colV(amp,cvaC克隆于[18]RpBAD8730)、pRR2gfp(amp,gfp克隆于pRR2[18,19]pRKgfp、colV)、pKRgfp、pKKgfp、pAR2gfp。RR1.1.2　培养基　　采用Luria2Bertani(LB)培养基,必要时添加氨苄青霉素(100mgΠL)(Amp)和阿拉伯糖(2gΠL)(APA)或葡萄糖(2gΠL)(APG)。1.1.3　主要化学试剂　　限制性内切酶、T4连接酶、聚合酶等购自RocheMolecularBiochemicals公司。1.2　方法1.2.1　培养条件　　前培养取单一菌落接种于4～5mLLB或APG培养基中,37℃、120rΠmin振荡培养过夜或至A600为0.6时,100倍稀释后进行扩大培养。1.2.2　抗阿拉伯糖菌株的筛选　　将待处理菌涂布于含曙红次甲基蓝(EMB)和阿拉伯糖的LB平板培养基上,37℃过夜培养,挑取紫红色的单菌落,分离纯化。1.2.3　克隆荧光蛋白基因　　为克隆绿色荧光蛋白基因,设计引物为:gfpup(5′2aagaaggagatataa),gfpdown(5′catgcagcaaaggag23′2tgaccatgaagcttg),并在上下游分别引入了NheI,pstIcatgcctgc23′和HindIII酶切位点。为克隆红色荧光蛋白基因,设计了引物:DsRed2up(5′2tcgccaccatggctagctccg),DsRed2down(5′agaacgtca23′2ctattaggcttgactgca),并在上下游分别引入了NheI,gacaagttggta23′NotI酶切位点。以上引物均由MWG2BiotechFrance用溶菌酶2EDTA2冰水渗透压处理,获得细胞周质空间成分,再用FrenchPress法得到细胞质成分。1.2.7　电泳　　10%聚丙烯酰胺凝胶电泳40mA、40min。1.2.8　定量测定荧光蛋白的强度　　制备细胞周质空间和细胞质成分,经活性凝胶电泳后,定量测定细胞不同组分中的荧光量(SpexFluorologIII荧光仪)。[3]2　结果(Results)2.1　抗阿拉伯糖菌株的筛选因为torA2gfp重组基因的表达受控于阿拉伯糖启动子,但araD缺陷菌株分解阿拉伯糖会产生有害的中间代谢物。在EMB2阿拉伯糖平板上筛选了抗阿拉伯糖代谢的紫红色MC4100A、B1LKOA、CU164A、BODA和ELV16A菌株。各菌株在含阿拉伯糖的培养基上生长正常。2.2　荧光蛋白基因扩增产物的克隆及序列分析海葵红色荧光蛋白基因和水母绿色荧光蛋白基因的PCR扩增产物经酶切后与相应载体连接,经氨苄青霉素抗性和表型筛选后,分别提取质粒并酶切鉴定,得到二个与相应荧光蛋白基因片段大小相似的片段(0.69kb和0.73kb),序列测定的结果进一步说明目的基因已克隆于载体中。重组质粒分别命名为pRR2DsRed2和pRR2gfp。2.3　荧光蛋白在不同细胞中的分布704　　　ACTABIOCHIMICAetBIOPHYSICASINICAVol.35,No.8　　　　　将所得的重组质粒pRR2gfp和pRR2DsRed2分别转化MC4100A、CU164A、B1LKOA、BODA和ELV16A各菌,得到了一系列的转化子。经纯化分离,培养后提取质粒,分别用NheI和HindIII酶切、NheI和NotI酶切鉴定,确定含有相应的荧光蛋白基因。经阿拉伯糖诱导培养,荧光蛋白基因在各菌株中均能表达。在MC4100AΠpRR2DsRed2和B1LKOAΠpRR2DsRed2细胞中只能观察到红色荧光点(图1)。此结果表明虽然DsRed2溶解性较DsRed有所提高,但是红色荧光蛋白仍聚集在细胞内不能被输送出去。与此相反,在野生型菌MC4100AΠgfp,因突变株ELV16AΠ)Π2(ΔtatB)和2)中,绿色荧光只,且细胞成对或呈短链相连不分离(图2)。聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果显示MC4100A和CU164A菌株的细胞周质空间提取液有绿色荧光蛋白条带;但对于B1LKOA和BODA菌株只在细胞质提取液中有荧光蛋白条带,在周质空间提取液中没有荧光蛋白条带(图3)。在细胞质提取液中绿色荧光蛋白是以带有信号肽的前体形式存在,而在细胞周质空间中由于绿色荧光蛋白转运后信号肽被切除,。Fig.3　TranslocationofthegreenfluorescentproteininthewildtypestrainsandthetatmutantsStrainswereseparatedon10%nativepolyacrylamidegelsandinspectedun2derUVlamp.(A)Wildtypestrain(WT).(B)secY.(C)ΔtatC.(D)ΔtatB.1,2,fractionsofperiplasm.2.5　信号肽中双精氨酸对绿色荧光蛋白转运的影响通过荧光分光光度计测定细胞质内(图4,白色块带)和周质空间中(黑色块带)的绿色荧光强度,结果表明取代了保守序列中的不同双精氨酸形成的Fig.1　SynthesisanddistributionofredfluorescentproteinfusedtotheTorA2RRsignalpeptideinthewildtype(WT)strainandtheΔtatCmutant信号肽TorA2KK,TorA2KR和TorA2RK降低了荧光蛋白的转运效率。第二位精氨酸的取代比第一位精氨酸的取代的负作用大,完全取代则不介导绿色荧光蛋白的转运。此外,TorA2KR,TorA2RK和TorA2KK总体荧光量较TorA2RR总体荧光量逐渐有所下降。Fig.4　Effectoftwinargininemotifsubstitutionsonthetrans2locationofGFPinthewildtypestrain)andinthecytoplasm(□)wereFluorescencesofGFPintheperiplasm(■quantifiedbySpexFluorologIII.Thearbitraryunitsoffluorescencewerein2dicated.Fig.2　SynthesisanddistributionofgreenfluorescentproteinfusedtotheTorA2RRsignalpeptideinthewildtypestrainsandtheΔtatmutants3　讨论(Discussion)3.1　作为细菌Tat转运系统报告蛋白的外源荧光2.4　绿色荧光蛋白的转运制备细胞周质空间和细胞质提取液,进行活性蛋白性质上有差异通过实验证明不同的外源荧光蛋白由于其自身性质的差异,在作为细菌Tat转运系统的报告蛋白Aug.,2003张　明等:利用荧光蛋白对大肠杆菌蛋白质Tat转运系统的研究705时表现出不同的结果。在野生型MC4100A和CU164A菌株中,绿色荧光蛋白可以转运至周质空间以成熟形式存在[图3(A),(B)]。而在各tat基因缺陷株B1LKOA和BODA中绿色荧光蛋白仅以前体的形式存在于细胞质中,没有转运到周质空间[图3(C),(D)],这说明绿色荧光蛋白在大肠杆菌中可正确折叠,并在tatB和tatC基因产物的共同参与下转运,与Sec系统无关。因而可作为Tat转运系[19]统的报告蛋白。海葵红色荧光蛋白虽可正确折叠发出红色荧光,但不能转运。活性凝胶电泳实验表明,在MC4100A菌株和tat液中均有红色荧光蛋白条带,,23%同一性,(分子量分别为27kD和[20]28kD),三维空间结构相同。尤其重要的是两者荧光基团都是在蛋白折叠后,由3个氨基酸通过自我催化氧化反应形成环状结构而产生的。绿色荧光蛋白以单体形式存在,而红色荧光蛋白则为四聚体[21]并易于聚集,以致于在胞内聚合形成大分子而不能转运而积聚在细胞质中。从而也说明了转运通道的大小是一定的,不允许太大的分子通过。故红色荧光蛋白不宜作为报告蛋白。3.2　双精氨酸是绿色荧光蛋白高效率转运所必需的早期的研究表明Tat信号肽的双精氨酸对蛋白质转运起着决定性的作用,绝大多数情况下不可取[22,23]代。用改变的信号肽TorA2RK,TorA2KR和To2rA2KK介导绿色荧光蛋白的转运来研究双精氨酸在转运中的作用,TorA2KR的转运效率高于TorA2RK,表明信号肽中第二个精氨酸比第一个精氨酸重要。TorA2KK不能介导绿色荧光蛋白转运,表明精氨酸对信号肽的功能有极大的影响。这说明了精氨酸可能不仅通过其极性基团与Tat转运酶相互作用,还必须形成一定的高级结构才能发挥信号肽的作用。3.3　信号肽不仅引导蛋白质的转运还影响蛋白质系统的信号肽则使下游绿色荧光蛋白不能正确折[24]叠,这些提示存在于折叠蛋白质外部的信号肽对折叠有着显著的作用。Tat信号肽和Sec信号肽都具有三个相同的区域,但两者的氨基酸组成有着明显的差异[25],因而可推测信号肽上的氨基酸组成对蛋白质折叠有直接的影响。已有文献证明,存在于折叠蛋白质外部的前导肽对蛋白质的折叠确实有一定的影响。。T,尤其是第二位精氨酸;信号肽作用的发挥极有可能与具一定的高级结构有关,其功能不仅引导蛋白质转运还参与蛋白质的折叠。[26]　　致谢:我们由衷地感谢BérengèreIze博士,她对本文的修改提出了宝贵的意见。References1　SettlesAM,YonetaniA,BaronA,BushDR,ClineK,MartienssenR.Sec2independentproteintranslocationbythemaizeHcf106protein.Science,2):　WeinerJH,BilousPT,ShawGM,LubitzSP,FrostL,ThomasGH,ColeJAetal.Anovelandubiquitoussystemformembranetargetingandsecretionofcofactor2containingproteins.Cell,-1013　SantiniCL,IzeB,ChanalA,MüllerM,GiordanoG,WuLF.AnovelSec2independentperiplasmicproteintranslocationpathwayinEscherichiacoli.EMBOJ,):101-1124　SargentF,BogschEG,StanleyNR,WexlerM,RobinsonC,BerksBC,PalmerT.OverlappingfunctionsofcomponentsofabacterialSec2independentproteinexportpathway.EMBOJ,):　BogschEG,SargentF,StanleyNR,BerksBC,RobinsonC,PalmerT.Anessentialcomponentofanovelbacterialproteinexportsystemwithhomologuesinplastidsandmitochondria.JBiolChem,):　BerksBC.Acommonexportpathwayforproteinsbindingcomplexredoxcofactors?MolMicrobiol,):393-4047　BerksBC,SargentF,PalmerT,TheTatproteinexportpathway.MolMicrobiol,):260-2748　WuLF,IzeB,ChanalA,QuentinY,FichantG.Bacterialtwin2argin2inesignalpeptide2dependentproteintranslocationpathway:Evolutionandmechanism.JMolMicrobiolBiotechnol,):179-1899　ZhangM.ProgressonthebacterialTatproteintranslocationsystem.ProgBiochemBiophys,):326-328　　(引自:生物化学与生物物理进展)10　BolhuisA,BogschEG,RobinsonC.Subunitinteractionsinthetwin2argininetranslocasecomplexofEscherichiacoli.FEBSLet,-9211　SargentF,GohlkeU,deLeeuwE,StanleyNR,PalmerT,SaibilHR,BerksBC.PurifiedcomponentsoftheEscherichiacoliTatproteintrans2portsystemformadouble2layeredringstructure.EurJBiochem,1-336712　BolhuisA,MathersJE,ThomasJD,BarrettCM,RobinsonC.TatB的折叠水母绿色荧光蛋白本身是无信号肽的折叠蛋白,在水母和大肠杆菌中它可正确折叠,说明绿色荧光蛋白自身含有蛋白质折叠的信息。本研究表明结合于绿色荧光蛋白上的野生型Tat信号肽并不影响下游绿色荧光蛋白的折叠,但突变体TorA2KR、TorA2RK和TorA2KK总体荧光量较野生型TorA2RR总体荧光量逐渐有所降低。此外,结合于Sec转运706　　　ACTABIOCHIMICAetBIOPHYSICASINICAVol.35,No.8　　　　　andTatCformafunctionalandstructuralunitofthetwin2argininetrans2locasefromEscherichiacoli.JBiolChem,):3　YahrTL,WicknerWT.FunctionalreconstitutionofbacterialTattrans2locationinvitro.EMBOJ,):　AllenSC,BarrettCM,RayN,RobinsonC.Essentialcytoplasmicdo2mainsintheEscherichiacoliTatCprotein.JBiolChem,):5　BuchananG,deLeeuwE,StanleyNR,WexlerM,BerksBC,SargentF,PalmerT.Functionalcomplexityofthetwin2argininetranslocaseTatCcomponentrevealedbysite2directedmutagenesis.MolMicrobiol,):　GouffiK,SantiniCL,WuLF.TopologydeterminationandfunctionalanalysisoftheEscherichiacoliTatCprotein.FEBSLet,-7017　CormackBP,ValdiviaRH,FalkowS.FACS2optimizedmutantsofgreenfluouescentprotein(GFP).Gene,　IzeB,GérardF,ZhangM,ChanalAT,A,WuLF.Invivocherichiacoli.J,2002:-19　SantiniCL.,MA,IzeB,BlancoC,WuLF.TranslocationofgreenfluorescentproteinviatheTatsystemofEscherichiacoliandchangeofitsperiplasmiclocalizationinresponsetoosmoticup2shock.JBiolChem,):　YarbroughD,WachterRM,KallioK,MatzMV,RemingtonSJ.RefinedcrystalstructureofDsRed,aredfluorescentproteinfromcoral,at2.02?resolution.ProcNatlAcadSciUSA,):462-46721　BairdGS,ZachariasDA,TsienRY.Biochemistry,mutagenesis,andoligomerizationofDsRed,aredfluorescentproteinfromcoral.ProcNatlAcadSciUSA,):2　HalbigD,WiegertT,BlaudeckN,FreudlR,SprengerGA.Theeffi2cientexportofNADP2containingglucose2fructoseoxidoreductasetotheperiplasmofZymomonasmobilisdependsbothonanintacttwin2argininemotifinthesignalpeptideandonthegenerationofastructuralexportsignalinducedbycofactorbinding.EurJBiochem,):543-55123　NivièreV,WongSL.VoordouwG.2directedmutagenesisofthesignalpreventsexportofaβ2lacta2,,138(Pt10):2173-　BJSchroederD,WebberH,PhillipsGJ.GproteinfunctionsasareporterforproteinlocalizationEscherichiacoli.JBacteriol,):　CristóbalS,deGierJW,petitionbe2tweenSec2andTAT2dependentproteintranslocationinEscherichiacoli.EMBOJ,):　ChenLM,TangJG.Intramolecularchaperone―theroleofpropeptideinproteinfolding.ChineseBulletinofLifeScience,):35-39　　(引自:生命科学)AssessmentoftheEscherichiacoliTatProteinTranslocationSystemwithFluorescentProteinsZHANGMing(121,2,3,　PANRen2Rui,　YUZeng2Liang,　WULong2Fei1123KeyLabofIonBeamBioengineering,InstituteofPlasmaPhysics,theChineseAcademyofSciences,Hefei230031,CLaboratoiredeChimieBactérienne,UPR9043CNRS,31cheminJosephAiguier,13402Marseillecedex20,F3CollegeofLifeScience,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei230036,China)Abstract　　Thepossibilityofusingfluorescentproteinsasprobestostudythetwin2argininetranslocation(Tat)systemwasassessedinEscherichiacoli.Whenfusedtothetwin2argininesignalpeptideoftrimethylamineN2oxidereductase,theDsRed2redfluorescentproteinfromtheDiscosomasp.wassuccessfullysynthesizedandfoldedinE.colicells.However,RR2DsRed2aggregatedinsidethecells.Therefore,althoughDsRed2hasbeenengineeredfromDsRedforfast2ermaturationandlowernon2specificaggregation,itisstillnotcompatiblewithTat2dependenttranslocation.Incontrast,thejellyfishgreenfluorescentprotein(GFP)wasefficientlyexportedintoperiplasmevenwhentheRRmotifwaschangedtoKRorRK.TheseresultsshowthatGFPcanbeusedasanefficientreporterproteintostudyTatsystem,butDsRed2isnotsuitableforsuchpurposebecauseofitsaggregationproperty.Inaddition,whentheproteinconcentrationwassimi2lar,thefluorescenceintensityofKR2GFPandRK2GFPdecreasedcomparedwithRR2GFP,whichwouldsuggestthatthetwin2argininesignalpeptideisnotonlyessentialformediatingproteintranslocation,butalsoimportantforthefoldingofdown2streamprotein.Keywords　　TatproteinfoldingReceived:April7,2003　　Accepted:May20,2003ThisworkwassupportedbythegrantsfromINCOBursary(No.ICB12CT),andtheOutstandingOverseasChineseScholarsFundofChineseAcademyofSciences(No.)3Correspondingauthor:Tel,+;Fax,+;e2mail,rs2mrs.fr包含各类专业文献、专业论文、中学教育、幼儿教育、小学教育、各类资格考试、文学作品欣赏、外语学习资料、51利用荧光蛋白对大肠杆菌蛋白质Tat转运系统的研究等内容。
　15 4.3 利用 GFP 良好的融合性来标记蛋白质 ......图二 后来的研究证实了绿色荧光蛋白的发色团的结构...从开始的荧光大肠杆菌到现在的荧光兔子等, 荧光蛋 ... 　绿色荧光蛋白的研究进展及应用姜丽 摘要:源于多管...蛋白质对 温度、pH 变化的耐受性、抗胰蛋白酶消解...等利用农杆菌把含花椰菜花叶 病毒 35 启动子驱动... 　绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆与表达摘 要 实验目的在于利用大肠杆菌的快速繁殖来...后来,美籍华人钱永健系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理,并对它进行了 大刀... 　可以使对细胞有毒性的蛋白大量存在。 5.使用特定的...以防止大肠杆菌的转运系统达到饱和状 态 .因此,需要...(GST)及天然大肠杆菌蛋白 NusA,GrpE,BFR 等.需要... 　一个比较成功应用定向进化的例子是对红色荧光蛋白的...利用大肠杆菌进行真核生物蛋白质表 达会遇到生物活性...解决这些问题的出路一是研究开发新的表达系统, 如酵母... 　荧光光谱技术在蛋白质研究中的应用 摘要荧光光谱法对...文以及随后的一系列研究工作,奠定了至今还在使用的...标准曲线法是在同样条件下,以已知量的标准荧光蛋白... 　蛋白质:表面蛋白 20 % ~30% 结构蛋白 70 % ~...14.Sec 转运系统和 Tat 转运系统共性有哪些? 答:...一般不把那些酶如溶菌酶或大肠杆菌素等复合酶包括在... 　研究红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein,RFP)基因...依 DNA半保留复制原理,利用DNA聚合酶依赖于DNA模板...因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统[9]... 　键步骤[11],是基因克隆以及DNA文库构建等研究中频繁使用的一项重要的 常规操作...能超过细菌中蛋白量的 30 %,因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统[15...台州司法行政信息综合管理平台