导读：1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理，2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术，3.掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造，1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的，紫外光：10-400nm，即未知样的含量，各种类型的紫外-可见分光光度计，2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实一、实验目的 1.学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。 2.掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。 3.掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。 二、实验原理 1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。 紫外光：10-400 nm 可见光：400-780 nm（可被人们的眼睛所感觉） 特点：带光谱、分子光谱 应用：定性分析-最大吸收波长； 定量分析-朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法） a.定性分析原理： 吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状. b.定量分析原理： 根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。 定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。 c.仪器组成部件: 各种类型的紫外-可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。 2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理： （1）蛋白质可作定量分析的原因：蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1―1.0mg/mL。 （2）此种方法测量的准确度差一点的原因：由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所处的微环境也不同，所以不同蛋白质溶液在280nm的光吸收职也不同。据初步统计，浓度为1.0 mg/mL的1800种蛋白质及蛋白质亚基在280nm的吸光度在0.3―3.0之间，平均值为1.25+/-0.51。所以此种方法测量的准确度差一点。 （3）有嘌呤、嘧啶等核酸类干扰时的经验公式：若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外光的物质，在280nm处来测量蛋白质含量时，会有较大的干扰。核酸在260nm处的光吸收比280nm更强，但蛋白质却恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的含量。常用下列经验公式计算： 蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260
(A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值) 还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量： 蛋白质浓度（mg/mL）=F* A280*D*1/d 其中A280为蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度值；d为石英比色皿的厚度（cm）;D为溶液的稀释倍数；F为校正因子 （4）稀溶液中蛋白质浓度测定的经验公式：蛋白质的肽键在200―250nm有强的紫外吸收。其光吸收强度在一定范围与浓度成正比，其波长越短，光吸收越强。若选用215nm可减少干扰及光散射，用215nm和225nm光吸收差值与单一波长测定相比，可减少非蛋白质成分引起的误差，因此，对稀溶液中蛋白质浓度测定，可选用215nm和225nm光吸收差法。常用下列经验公式： 蛋白质浓度（mg/mL）=0.144（A215-A225） （A215和A225分别为蛋白质溶液在215nm和225nm处测得的吸光度值 三、仪器与试剂 仪器：TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管（10ml的5个），吸量管。 试剂：标准蛋白质溶液：5.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液（牛血清白蛋白）。 四、实验步骤 1.基本操作 （1）启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器,预热半小时。 （2）用吸量管分别吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比（参比溶液不可取出）. （3）在工作界面上选择测量项目为光谱扫描，设置扫描参数（起点：400nm，终点：250nm，速度：中，间隔：1.0nm，单次扫描） （4）将两个均装有0.9%NaCl溶液的1cm石英比色皿放入测量池中，进行基线扫描，然后选定量测定，校零，在调回光谱扫描。 2.吸收曲线的制作:（找出最大吸收波长） 将放在前面的比色皿中溶液换为0.3 mg/mL的蛋白质溶液，点击START进行扫描，得到如下吸收曲线，从曲线中我们可以看出此标准蛋白质溶液的最大吸收波长为278nm，此波长下的吸光度为0.1984。
3.标准曲线的制作： 在工作界面上选择测量项目为光度测量设置测量条件（测量波长：278.00 nm）。 用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在278nm处分别测定以上所配标准溶液的吸光度A278，记录如下： 浓度（mg/mL） A278 0.3 4 0.5 0.6 0.7 0.0.0.0.0.0.22
以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线： 4.样品测定： 配制三份待测蛋白质溶液，（取待测蛋白质溶液2.0mL分别于3只10mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度）按上述方法测定278 nm处的吸光度。得吸光度依次为0.5，0.3848。平均值为A278=0.3840,根据样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度为0.6101mg/mL。转换后待测蛋白质溶液的浓度为C= 0.6101mg/mL ?10 mL /2.0mL=3.0505mg/mL。 五、注意事项 准备工作： （1）在测量前应把机器预热半小时。 （2）溶液一定要配制准确,以防影响实验效果,保证点在一条直线上。 （3）由于蛋白质的紫外吸收峰常因PH值的改变而改变，故进行样品测定时的PH最好与标准曲线制作时的PH值一致。 测量工作： （1）吸收曲线绘制前必须进行光谱的扫描。 （2）.在作标准曲线进行定量前一定要选择最大的吸收波长,确保灵敏度高。 （3）在实际操作中，比色皿在使用中应注意保持干净，更不能触摸比色皿的光面，以防摩擦影响通光。 六、思考题 1. 紫外分光光度法测定蛋白质的方法有何缺点及优点？受哪些因素的影响和限制？ 答：优点：方法操作简便、迅速、不需要复杂和昂贵的设备，不消耗样品，测定后仍能回收使用，低浓度的盐和大多数缓冲溶液不干扰测定。 缺点：准确度和灵敏度差一点。干扰物质多：对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会产生较大干扰 2. 若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？ 答：因为核酸在260nm处的光吸收比280nm更强，但蛋白质却恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的含量。常用下列经验公式计算： 蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260
(A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值) 还可以通过下述经验公式直接计算出溶液中的蛋白质的含量： 蛋白质浓度（mg/mL）=F* A280*D*1/d 七、实验总结 本次实验进行得很顺利，绘制标准曲线时各个点都落在直线上，实验达到了预期的目的。
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3秒自动关闭窗口紫外分光光度法测定苯甲酸钠作标准曲线时10.00ml吸取值总是偏小怎么办
紫外分光光度法测定苯甲酸钠作标准曲线时10.00ml吸取值总是偏小怎么办
紫外-可见分光光度计是元析仪器引用新型技术,其功能强大,采用单色器技术,波长范围190-1100nm,是各种涉及水和废水分析领域的通用仪器,应用范围包括市政和工业废水,饮用水,加工过程用水,地表水,冷却水和锅炉补给水等.分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后,发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱.由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构,其吸收光能量的情况也就不会相同,因此,每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线,可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量,这就是分光光度定性和定量分析的基础.分光光度分析就是根据物质的吸收光谱研究物质的成分、结构和物质间相互作用的有效手段.它是带状光谱,反映了分子中某些基团的信息.可以用标准光图谱再结合其它手段进行定性分析.根据Lambert-Beer定律说明光的吸收与吸收层厚度成正比,比耳定律说明光的吸收与溶液浓度成正比；如果同时考虑吸收层厚度和溶液浓度对光吸收率的影响,即得朗伯-比耳定律.即A=εbc,(A为吸光度,ε为摩尔吸光系数,b为液池厚度,c为溶液浓度)就可以对溶液进行定量分析.将分析样品和标准样品以相同浓度配制在同一溶剂中,在同一条件下分别测定紫外可见吸收光谱.若两者是同一物质,则两者的光谱图应完全一致.如果没有标样,也可以和现成的标准谱图对照进行比较.这种方法要求仪器准确,精密度高,且测定条件要相同.实验证明,不同的极性溶剂产生氢键的强度也不同,这可以利用紫外光谱来判断化合物在不同溶剂中氢键强度,以确定选择哪一种溶剂.
与《紫外分光光度法测定苯甲酸钠作标准曲线时10.00ml吸取值总是偏小怎么办》相关的作业问题
因为过硫酸钾将水样中的氨氮、亚硝酸盐氮及大部分有机氮化合物氧化为硝酸盐.硝酸根离子在220nm波长处有吸收,而溶解的有机物在此波长也有吸收,干扰测定.而硝酸根离子在275nm处没有吸收.所以在275nm处也测定吸光度,用来校正硝酸盐氮值.
甲醇和水的分子中有氧上面的孤对电子跃迁,它们的吸收在接近远紫外区,200nm是它们的末端吸收,甲醇的最大吸收波长是183nm.黄酮的最大吸收一般在260nm和320nm作用.用甲醇做溶剂,最大吸收波长和黄酮差的比较远,可以排除溶剂对待测化合物紫外吸收的干扰.这样说能明白吗? 再问： 真是太谢谢你了，我还有一点不明白的地
紫外可以测得的浓度范围是其线性范围决定的,由于不同物质的灵敏度不同,线性范围也不同,应根据具体的测得物质分析可以测得的浓度范围.
1.How do you prepare your blank?2.what is the material of your 比色皿?Answer:这半年测总氮感觉挺有收获 基本把问题弄清楚了 所以也来分享一下1、过硫酸钾提纯我觉得这个方法测总氮的主要问题就是过硫酸钾含氮 去年我测试的时候,吸光度甚至达到了4 -_-|
为了保持酶的活性 再问： 不好意思，我还有一个问题想问：硫酸的作用是终止剂吗？那萃取剂应该是什么？
这个是一篇相关的文献,上边有具体的方法 ；你看看人家是怎么测的,/Article/CJFDTotal-RYLG.htm.如果下载不下来 我这可以下载. 再问： 他用的方法是差示法呀，我不会这样的方法怎么办。。。这文章我已经下了，我发现这个文章貌似是和别人一样
那你可以将溶液配的浓一点,再试试呀,一般的紫外分光光度计测量是比较准确的. 再问： ??A????С???????????????????????????????? ??IJ????????????涨????????????????ó?????A??0.008????? ?????????????????? 再答： ??
试样溶液浓度过大,会导致整个浓度-吸光度曲线偏离比尔定律的直线范畴,不易拟合,同时产生较大误差试样的浓度过小,可能会因为各仪器的检测下限不同,导致较大的误差,不能准确定量你需要根据你使用紫外的性能参数（检测上下限,信噪比等）,结合你实际的测量的精度和范围,也可以做一些试探性的浓度-吸光度实验,以便更好的掌握规律早日成功
过大,基本难以测出准确的含量；需要重新测量,一般知道大概含量后在称取合适的量.过小一般问题不是很大,但太小则同样影响准确性.
第一个问题说明：在双波长测定中,背景干扰在220nm（测定波长）处的A（吸光度）值是275nm处A（吸光度）值得2倍.
主要是让蛋白质变性,使之失去生物活性.具体的过程主要是蛋白质分子中的一些化学键比较不稳定.用紫外分光光度法测蛋白质含量：四种紫外吸收法:1.280nm的光吸收法用标准曲线法进行测定.标准蛋白质溶液配制的浓度为1.0 mg/mL.常用的标准蛋白质为牛血清清蛋白(BSA).标准曲线的测定：取6支试管,按下表编号并加入BSA
吸光度的计算公式的原理是朗伯-比尔定律A=lgI0/I=-lgT其中A为吸光率T为透光率I0为入射光强I为透过光强 再问： 公式我知道，情况是用仪器测出了各波长的吸收度比值，怎么用吸收度比值去求吸光度，然后再校正吸光度 再答： 用空白对照的方法，简单的说就是用两个比色皿，一个测样品，一个作为参比溶液。测量时，把参比溶液
定性鉴别：可以根据吸收光谱的形状、吸收峰数目、各吸收峰的波长位置、强度和相应的吸光系数值等,判断两种化合物是否相同或是与标准化合物的吸收光谱比较判断.定量鉴别：通过吸光光谱可找出最大吸收波长,再通过最大吸收波长处 吸光值的测定可定量计算该物质含量.
紫外光谱的含量计算时,吸收值会叠加的,所以,你在实验时,只要做个扣除样品的对照溶液,然后测出俩吸收值,那就可以计算了
可以用紫外分光光度法,氮的最低检出浓度为0.05 0m g/L,测定上限为4mg/L,虽然你的总氮含量在30左右,你做个稀释就可以了,比如10倍.建议测3个平行样.
说明紫外吸收光谱在分析上有哪些应用．（1）紫外光谱可以用于有机化合物的定性分析,通过测定物质的最大吸收波长和吸光系数,或者将未知化合物的紫外吸收光谱
浓度是指铁含量的浓度,单位可以是mg/L,也可以是mol/L,需要跟您配的标准溶液的单位保持一致.标准溶液可以自己用固体配制,也可以从标物中心购买标准溶液回来稀释获得. 再问： 这个浓度需要计算才能得到吗？ 再答： 对，一般就是简单的质量-浓度之间的换算就可以。如果您用的是高浓度的标准溶液稀释获得，那用高浓度溶液的浓度
工作量大了点吧!自己看看参考资料吧!很全
这些长链的C ,H化合物,时间长了,本身也许才开始分解,有时候出水的COD比进水的还要高,石油废水很难弄的