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度变化的测定。经脉冲磁场处理后，S．aureus胞内钙离子浓度显著上升，且与活菌数的减少高度相关，相关 度达到一o．98915；胞内光点显著增多，光点荧光强度明显增大，说明大量胞外钙离子跨膜进入胞内。因此， 可以判断微生物细胞膜通透性的改变和胞内Caz+浓度的上升是高强度脉冲磁场具有杀菌作用的重要原因。 关键词 Fura-2／AM荧光探针；激光共聚焦显微镜，金黄色葡萄球菌；钙离子；脉冲磁场 中图分类号：0657．3文献标识码：A 激光共聚焦显微镜，测定高强度脉冲磁场处理前后S．aureus 引 言 胞内游离钙浓度的变化，探索高强度脉冲磁场的杀菌机理。 金黄色葡萄球菌(S．aureus)是革兰氏阳性菌，其结构简 1实验部分 单，易培养，具有优良的遗传信息复制和表达能力，是生活 中常见的致病菌，是基因工程常用理想模型。正常细胞内游 1．1材料与试剂 离钙浓度极低，与胞外钙离子浓度相差近3～4个数量级，但 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus 是这极少量的钙参与了细胞存活及凋亡过程，对细胞功能调 节起着极其重要的作用，几乎涉及到细胞的所有生理生化过 公司；瑚讧So(二甲基亚砜)，购自上海国药集团化学试剂有 8．0 程口’2]。如果当细胞内Ca2+浓度持续升高时会导致蛋白质表限公司；PBS(磷酸平衡盐缓冲溶液)，由NaClg·L～， 达异常、激活Ca2十依赖性蛋白激酶，使蛋白质降解、活化核 KCl0．2g·L～，Na2HP03·Hz02．9 0．2 mol· 酸内切酶引起DNA分解，以产生不可逆的细胞损伤[3]。 g·L_1组成，pH7．4，自行配制；CaCl2配成0．2 Fura-2／AM是一种性能优良的双波长Ca2十荧光探针，L．1溶液。 具有用量少、测定时间短、微量组织中也可以测定的优点， 1．2仪器 是较为理想的研究细胞外源性钙离子跨膜行为的分子探 Cary 针[4-6]。Fura-2／AM荧光探针法测定大肠杆菌胞内钙离子浓 激光共聚焦扫描显微镜，德国蔡司公司；高强度脉冲磁场处 度已有文献报道[7。]，为研究大肠杆菌细胞内钙离子浓度测 理设备，江苏大学自行研制；SW-CJ一2FD型净化工作台，苏 州净化设备有限公司；恒温培养摇床，上海福玛试验设备有 定方法及钙离子跨膜行为提供了依据，能否将Fura-2／AM 成功负载于S．aureus并测定其胞内钙离子浓度，目前尚未限公司；灭菌锅，上海三申医疗器械有限公司。 有相关报道。 1．3方法 1．3．1 S．aureus的培养 利用Fura-2／AM荧光探针法建立S．aureus细胞内游离 钙浓度的测定方法。通过建立的Fura-2／AM荧光探针法和 收稿日期：2011—02—08．修订日期：2011—06-06 基金项目：国家(863计划)重点项目(2007AAl

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