Karl Kieburtz博士是一名专门研究运动障碍的神经病学家，也是50多项运动障碍临床研究的主要研究者，同时是15个FDA数据监测委员会的成员。Karl Kieburtz将领导Blackfynn的帕金森病进展标志计划（PPMI），帮助该公司建立世界领先的神经退行性疾病临床数据库。

Blackfynn成立于2015年，是一家数据驱动的生命科学公司，致力于改变神经系统疾病的诊断和治疗方式。该公司将患者数据、临床数据、生物样本、病理学信息等相关数据汇集一起进行综合分析，通过数据集成和研究，为治愈神经系统疾病寻找以数据驱动的科学疗法。

全世界约有10亿人受到癫痫、帕金森病（PD）、阿尔茨海默氏症（AD）和其他神经退行性疾病的影响，这些疾病目前还缺少完全治愈的科学疗法。Blackfynn有一项Fox Insight研究，由此次合作伙伴迈克尔J．福克斯基金会赞助。这项研究招募了三万多名帕金森病（PD）患者，通过与正常人的相关数据对比分析，以了解疾病的进展和造成PD的潜在风险因素。这个项目自去年十月Blackfynn与迈克尔J．福克斯基金会首次合作时展开，由Blackfynn主导PPMI。

罗切斯特大学也是PPMI的核心成员，Blackfynn与罗切斯特大学的Charles Venuto博士一起开发神经退行性疾病的模型，并从丰富的临床数据中寻找生物标志物。大多研发神经系统疾病的获选药物都以失败告终，经过一次次试验，人们发现寻找疾病机制中的生物标志物，并确定疾病亚型和进展风险都是临床药物开发中至关重要的部分。目前，在罗切斯特大学已经进行了百余次临床试验，已锁定十余种治疗神经疾病和运动障碍的药物。

“目前还没有统一的神经退行性疾病数据库。” Blackfynn总裁Amanda Christini博士说，“神经退行性疾病中某些疾病的表型之间存在重叠，可以将其共同机制确定为药物目标。Blackfynn正在与合作伙伴共同建立一个专注于神经退行性疾病的数据库，加速生物标志物的发现进程。”

Karl Kieburtz博士补充道：“通过利用专有的数据平台，Blackfynn可以从复杂数据中获取新见解，从而为神经疾病带来新的治疗方法。”

Michael J． Fox Foundation成立于2000年，是一家总部位于纽约的信托基金。该基金致力于寻找到更好的治愈帕金森病的疗法，并资助研究帕金森病的公司进行临床开发和商业运作。

一、动物模型和评价方法

（一）自发性或自然发生的模型

Wobbler大鼠是研究较多的一类自然发病ALS模型鼠，该模型出生3~4周后逐渐出现前肢无力，可长到成年，在1年左右死亡，其病变是常染色体突变隐性遗传导致脊髓神经元退行性改变，与ALS疾病的神经元受损和临床表现相似（Boillee等，2003）。已有证据表明Wobbler鼠的氧化应激增强，而抗氧化治疗可以延缓神经元变性并且改善肌肉组织营养。同人类ALS一样，Wobble鼠r也表现出星形胶质细胞的增多和神经元内一氧合酶及GAP-43的增多。因此，Wobbler大鼠模型因其神经元变性的特点，在神经元变性的发病机制尤其在抗氧化机制研究上有很大价值（Dave等，2003）。此外还有3种ALS小鼠模型和1种犬模型，但研究较少。

铝对神经元细胞具有慢性毒性作用，因此可用铝中毒复制ALS动物模型：反复多次将氯化铝注射在兔的枕大池中，可产生慢性神经毒性作用，可见腰脊的前角运动神经元胞体和树突水肿明显，神经微丝沉积，内质网断裂，出现大量的游离核糖体和类脂质物质，并有广泛的包涵体（Kihira等，1995）。BMAA也可产生神经毒作用，动物实验表现出ALS、帕金森样症状和行为异常，病理显示前角运动神经元的染色体溶解（Duncan，1991）。

已有研究发现ALS患者血清和脑脊液中的免疫球蛋白存在异常区域，一些学者研究免疫性运动神经元疾病模型，发现与ALS患者相似的行为学和病理学变化（Smith等，1993）。

转基因鼠可以作为研究家族性ALS的较理想模型，有两种基因型的动物模型：SOD-1基因型和NF基因型。

SOD-1基因被敲除的鼠不能表现相关症状，但是表达人超氧化物歧化酶1（hSOD-1）突变体的转基因鼠可以表现为ALS样临床症状直至死亡。已有超过110种的SOD1基因突变类型被发现，大多是点突变也有产生截短形式的SOD1和氨基酸的插入与丢失。最常用的ALS转基因模型是将表达人SOD1在第93个丙氨酸残基位点被甘氨酸替代的突变体基因转入小鼠后培育而成的转基因小鼠系。这类小鼠模型通常都在出生后3个月开始表现出ALS样的症状，接着在1~2个月死亡，而hSOD-1G93A基因低表达的转基因鼠发病时间会延缓，生存周期一般在8个月（Grieb，2004）。近年来已经建立这个基因的大鼠模型，是较理想ALS研究模型（Julien和Kriz，2006）。

神经元胞体及近端轴突的NF异常堆积可导致富含NF的粗大运动神经元退变（曾常春等，2004）。NF-L转基因小鼠肌肉呈神经原性萎缩，脊髓的运动神经元减少，神经元内充满了异常神经微丝，与ALS改变相似。过度表达NF-L的转基因鼠，表现为进行性步态异常、后肢异常屈曲，病理上大运动神经元和后神经节神经元的胞体和近端轴突中含有大量神经微丝聚集、线粒体功能异常（Robertson等，2002）。在过多表达hNF-H基因的小鼠中，检测到神经纤维的阈值减低，膜静息电位及传导速度均明显减低，动作电位的振幅偏小，动作电位的延续时间反而延长，与ALS疾病时神经表现具有一致性（Kriz等，2000）。

ALS患者特征性表现之一就是异常磷酸化的NF蓄积，因此过度表达神经微丝的动物模型亦常作为ALS的发病机制来研究（Kong和Xu，2000）。

虽然ALS动物模型多种多样，但没有一种动物模型能够完全模拟人类的运动神经元疾病特点。在ALS发病机制没有完全清楚的前提下，根据自身实验特点合理选择所需的ALS模型才能达到研究目的。

在许多药物在转基因动物实验中进行发病前早期干预治疗，而在人类ALS疾病仍然未找到相同时期的特异性标记；因此当动物模型开始表现出发病症状后给药并能多次重复得到的结果将会更可靠（Goodall和Morrison，2006）。

（）作用于谷氨酸系统，通过阻断突触后NMDA谷氨酸受体激活G蛋白依赖的抑制谷氨酸释放过程，抑制谷氨酸的释放。在SOD1突变小鼠的运动神经元培养中发现它阻断持续性钠离子通道（Urbani和Belluzzi，2000），消除运动神经元上过剩的Na⁺流。也激活多种类型的钾离子通道和抑制慢代谢型的电压依赖钾通道。这些效应导致在神经细胞更多的K^＋流而抑制谷氨酸的释放。它还可以使和第二信使相关的鸟嘌呤核苷酸环化酶失活而起起到神经保护作用（Kanai等，2006）。

抗惊厥类药Gabapentin也是一种抗兴奋毒性药，它同一样能够抑制谷氨酸释放而延缓神经元的变性坏死；它可能使更多谷氨酸代谢成γ型氨基丁酸，减少谷氨酸聚积（Gurney等，1996）。

还有许多关于抗谷氨酸类药物的研究，但结果不尽人意，比如抑制谷氨酸释放的Lamotrigine、谷氨酸受体抑制剂dextromethorphan、增强谷氨酸的氧化作用的支链氨基酸、还有Ca²⁺通道抑制剂等（Dib，2003）。

头孢曲松（头孢三嗉）能够通过诱导星型胶质细胞突触前膜上谷氨酸转运体的表达，增强星型胶质细胞对谷氨酸的转运摄取，在ALS转基因小鼠模型上证实头孢曲松能够保存动物模型握力、延缓体重减轻、延长生存期（Rothstein等，2005）。

E和硒联合，能延迟动物模型发病时间（Gurney等，1996）；Carboxyfullerenes可以同时延缓模型发病时间和生存期限（Dugan等，1997）；乙酰半胱氨酸不能延缓发病模型鼠时间，但可改善运动神经元功能和延长生存时间；丙酮酸盐抗氧化性治疗ALS模型鼠，能延长其生存时间（Park等，2007）；以及一氧化氮合酶抑制剂（Chou等，1996），司来吉兰（Selegiline）、DHA－脱氢表雄甾酮、OPC1477等也已用于ALS抗氧化治疗研究。

（三）针对线粒体功能和能量代谢药

线粒体损伤被认为是ALS重要的致病机理之一，形态学研究已经证明在散发型ALS患者的神经组织和非神经组织中均存在线粒体异常（Masui等，1985），如线粒体溶胀和线粒体空泡化。因此针对保护和稳定线粒体功能的药物成为治疗ALS研究点之一。已有研究证实单独应用肌酸即能延长ALS疾病进程（Klivenyi等，1999），而联合其它药物治疗ALS小鼠，则可以达到治疗累加效果（Zhang等2003）。

在ALS模型中，NMDA和非NMDA受体被持续激活，Ca²⁺大量进入细胞内，引起一系列变化导致神经元坏死和凋亡，部分神经营养因子可以拮抗兴奋性谷氨酸毒性，稳定细胞内Ca²⁺水平（Strong等，2008），包括脑源性神经营养因子（BDNF）、神经胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、睫状神经营养因子（CNTF）、血管内皮生长因子（VEGF）（Zheng等，2007）、扎利罗登（Xaliproden，SR57746A）（Meininger等，2004）、paliroden（SR57667B）和Colivelin等。

（五）胶质细胞调节因子

星形胶质细胞功能异常对ALS的致病作用越来越受关注。将突变SOD-1基因转染到星形胶质细胞，并与正常脊髓原代培养运动神经元或者胚胎小鼠干细胞来源的运动神经元共同培养，可以特异性杀死这些运动神经元，这一死亡过程是由可溶性毒性因子通过Bax依赖性机制触发。这提示星形胶质细胞在ALS患者发病过程中，对脊髓运动神经元特异性变性、死亡发挥着独特作用（Nagai等，2007）。动物实验证实COX-2拮抗剂可显著抑制ALS模型鼠脊髓前列腺素E2合成，并且延长其病程（Drachman等，2002），COX-2拮抗剂如塞来考昔（Celecoxib）正在做临床前研究（Shefner等，2007）。

细胞凋亡路径激活是ALS中运动神经元变性重要原因。很多种凋亡抑制剂被用于ALS研究（Kieran等，2007），试图阻断ALS中被激活的多条凋亡途径，如caspase-1途径、caspase-3途径、MAPK途径、p53相关凋亡途径等。米诺环素（Minocycline）（Kriz等，2002）、雷沙吉兰（Rasagiline）（Waibel等，2004）、热休克白诱导因子Armioclomol等都也已在动物实验证实有较好效果。

（一）神经营养因子或抗凋亡基因治疗

一些神经营养因子已经用于ALS转基因模型治疗，且已证实对神经元存活和功能具有积极作用，如IGF-1、VEGF、CNTF（Kaspar等，2003；Pun等，2006）。但是利用传统给药途径将这些蛋白送入体内基本无效（Suzuki和Svendsen，2008）。也有实验（Gill等，2003）利用导管将神经营养因子植入脑或脊髓，但是这种方法较为复杂，还有可能会对神经组织产生再次损伤。将编码生长因子的病毒注射入ALS模型鼠肌肉内，尽管递呈IGF-1和GDNF获得较好结果（图9-1），但毕竟在疾病发展中受损神经元已经和肌肉分离（图9-2），还有学者（Guillot等，2004）通过病毒将生长因子直接呈递到脊髓的运动神经元，这样在肌肉合成生长因子就不需通过逆向转运到达神经元，同时可提高脊髓对生长因子的摄取潜力从而可以有更多生长因子转运至运动皮层。但GDNF研究发现尽管在变性神经元周围富集很高的GDNF，而发病时间和病程并未延长，甚至效果不如在肌肉表达GDNF（Lepore等，2007）。

ALS重要特征之一就是运动神经元凋亡，对一种广泛应用的运动元神经元疾病的模型—进行性运动神经元病（progressive motor neuron disease，PMN），转入表达抗凋亡的Bcl-2或GDNF基因可预防运动元神经元的凋亡，但对动物的生存期没有影响（Azzouz等，2000）。将抗凋亡基因bcl-2转入ALS模型鼠结果有一定改善。近年来应用重组基因或蛋白技术研究治疗ALS模型的研究总结见表9-1。

（二）RNA抑制基因表达治疗

RNA干扰技术（RNAi）是通过破坏细胞源性的mRNA来阻止相应基因表达，保护细胞免受病毒和其它遗传因子影响（Wang等，2008）。在ALS发病机制中，突变SOD1蛋白是产生神经毒性的来源，因此抑制突变SOD1蛋白表达可能会成为ALS的治疗方式之一。Ralph等（Ralph等，2005）和Raoul等（Raoul等，2005）利用设计的一种慢病毒载体携带特异性抑制突变SOD1的RNAi，并将其注入ALS模型鼠肌肉或脊髓内，检测证实动物体内突变SOD1表达显著减少，脑干和脊髓中运动神经元的存活率明显提高。对动物运动功能检测发现模型鼠的运动能力显著改善，几乎所有ALS鼠发病时间均明显延缓约1倍以上，且生存时间最长可长达正常寿命的80%。

成年大鼠移植胚胎干细胞，移植细胞轴突可延伸至肌肉，并形成神经肌肉接头，发挥生理学作用，并部分恢复身体机能。

将人类NCPS细胞植入SOD1突变转基因大鼠模型中，发现NCPS可以在神经变性的环境中存活，并能有效抑制病变处神经元数量减少，改善机体运动机能，并延长生存周期。分子生物学实验证实，NCPS不能跨越移植区域，但可在移植区域调节拟胆碱标记物，并可分泌GDNF，起到保护濒死运动神经元的作用。

将骨髓细胞腹腔注射入SOD1突变转基因ALS模型小鼠中，能延长ALS鼠生存期、推迟发病时间2~3周。随后进一步证实，骨髓基质细胞移植能改善ALS鼠运动机能，将移植途径由腹腔注射改为静脉注射可更有效延长ALS鼠生存期。将人骨髓基质细胞（hBMSCs）移植入发病前模型小鼠中，移植10周后移植组行为学较对照组有明显改善。

将hUCB移植入发病前转基因ALS模型小鼠中可使可有效延长发病时间达22天，生存期延长21天。SOD1G93A基因突变的ALS小鼠的细胞最佳移植剂量为25×10⁶，较之其他剂量，此剂量的细胞可使移植细胞周围的营养因子生长达到最佳状态，ALS小鼠的生存期延长20%~25%，延缓疾病的发生达15%。

将人的嗅前体细胞（嗅干细胞）移植入发病前的SOD1G93A基因突变ALS模型小鼠的脊髓中。观察其行为学变化发现，植入嗅前体细胞的小鼠在转棒以及斜板实验中表现明显优于未移植组小鼠，运动机能有所好转，体重正常。而非移植组小鼠平均体重则减轻40%。从总体效果来看，移植组小鼠延缓发病时间达117天，平均寿命延长至170天。进一步组织学研究表明，移植细胞在小鼠体内可分化为神经元、神经元样细胞、中间神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞以及少突胶质细胞。分化的细胞可产生轴突，且轴突可进入外周神经，但并未在神经肌肉接头处发现分化细胞轴突。

cells，hNT）移植入SOD1^G93A基因突变ALS模型小鼠的L4~5脊髓前角中，发现移植组小鼠运动行为综合征发作时间延迟，整体运动功能状况有所改善，但并未延长小鼠生存期。发病后的模型小鼠椎管内单点注射hNT神经元虽可以延缓疾病进展但并不能延长其生存期，而对发病前小鼠进行细胞移植则可延长其生存期。在移植区域发现新生神经元，新生数目与植入细胞数目不成依赖关系。移植入模型小鼠体内的细胞纤维可向外周生长，其生长的最大限度为0.15~0.3mm，多数延伸至灰质，移植入的细胞未出现神经炎性。实验证实，塞尔托利氏细胞（sertoli cell）对ALS模型小鼠有明显神经保护作用。