检验科技术特色之血液病实验室

解放军总医院第一医学中心检验科血液病实验室负责第一医学中心全院的骨髓细胞学检验、骨髓组织病理学诊断以及血液病疑难病的会诊工作。近年来，随着我院的快速发展，患者的数量、病种大幅增加，骨髓细胞学及病理学检验样品量也在不断的增加，年骨髓常规标本量可达7000余份。我室开展包括过氧化酶染色、糖原染色、骨髓内、外铁染色、氯醋酸AS-D萘酚酯酶染色、中性非特异性酯酶染色、酸性非特异性酯酶、中性粒细胞碱性磷酸酶染色等多种化学染色，以协助疾病的诊断。此外我室每年还为其他医学中心及外院会诊疑难病例300余份。

细胞形态是临床检验工作的基础，科室及医院领导对此十分重视，近年来，血液病实验室硬件设施不断更新换代，原有的BH-2，CX2系列型号的显微镜，已经被BX43甚至BX53全部替换掉，实验室面貌焕然一新，临床工作也得到很大促进。科室也十分重视相关人才的培养，引进了共览显微镜、利用多媒体手段进行教学，除了为本科室培养了形态学人才，还为全国各地的基层医院形态学检验输送许多优秀人才。三十多年来在我科进修学习骨髓细胞形态的学员逾400人，遍布全国各地，多数成为所在医院的骨髓检验骨干力量。

骨髓细胞形态学检验是一种比较传统、价格比较低廉的检查手段，但是相较流式、基因等这些先进血液病诊断手段，骨髓细胞形态学具有经济、直观、快速的特点，尤其对急性白血病的初步诊断，基本在1小时内可以得到初步结果，为快速临床治疗提供依据。

我科多年来一直开展塑料包埋半薄切片方法的骨髓病理活检，这也是我科的技术特色之一。塑料包埋骨髓活检较传统石蜡包埋切片细胞着色更清晰，形态更容易识别。骨髓涂片联合骨髓活检，明显提高了骨髓检查水平及阳性检出率。今年科室将引进石蜡包埋、染色等相关技术及设备，进行骨髓组织免疫组化染色，这将会弥补塑料包埋不能做免疫组化的缺憾，对淋巴瘤及其他实体瘤的诊断，具有非常重大的意义。贫血是临床常见的一种临床表现，检验科利用基因诊断、二代测序、红细胞寿命测定等众多新技术，协助贫血相关疾病的精确诊断、体化治疗。

另外，科室还引进了远程会诊系统，协助基层医院解决问题的同时，也可以更好的对外交流学习。随着科技的发展，AI技术已经成为大势所趋。细胞形态学作为一种极度耗费人力、又意义重大的检验项目，可以利用AI技术进一步解放劳动力。科室正跟AI技术开发团队合作，共同研究、开发细胞形态学AI识别技术，这一技术的应用，将会大大提高实验室工作效率。

多年来，科室在各部门领导的关怀带领下获得高速发展，实验室各项布局稳步推进，也会在未来的发展道路上迸发出新的光彩。

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1、骨髓检查及细胞化学染色检验骨髓检查及细胞化学染色检验 湖南省第二人民医院 邹国英 骨髓检查及细胞化学染色检验骨髓检查及细胞化学染色检验 掌握：掌握： 常用细胞化学染色（过氧化物酶染色、过碘酸常用细胞化学染色（过氧化物酶染色、过碘酸 - -雪夫染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色、氯雪夫染色、中性粒细胞碱性磷酸酶染色、氯 乙酸乙酸AS-D萘酚酯酶染色、中性非特异性酯酶萘酚酯酶染色、中性非特异性酯酶 染色、碱性染色、碱性-丁酸萘酚酯酶染色、酸性磷酸酶丁酸萘酚酯酶染色、酸性磷酸酶 染色、酯酶双染色、骨髓铁染色）的原理、方染色、酯酶双染色、骨髓铁染色）的原理、方 法

2、、结果分析和临床意义。法、结果分析和临床意义。 骨髓检查及细胞化学染色检验骨髓检查及细胞化学染色检验 熟悉：熟悉： 正常血细胞对化学染色的反应。正常血细胞对化学染色的反应。 骨髓检查及细胞化学染色检验骨髓检查及细胞化学染色检验 了解：了解： 流式细胞仪的构造、原理、主要技术指标和临床应用。流式细胞仪的构造、原理、主要技术指标和临床应用。 染色体分析在临床血液学中的应用。染色体分析在临床血液学中的应用。 分子生物学检查在血液学中的应用。分子生物学检查在血液学中的应用。 常用常用FISH技术的种类、原理、方法和临床应用。技术的种类、原理、方法和临床应用。 常用造血干常用造血干/祖细胞培养的种类、原

3、理和临床应用。祖细胞培养的种类、原理和临床应用。 非显带染色体和显带染色体相关概念和技术。常见染色体数目非显带染色体和显带染色体相关概念和技术。常见染色体数目 和结构异常的有关概念和表示方法。核酸分子杂交技术原理和和结构异常的有关概念和表示方法。核酸分子杂交技术原理和 方法。聚合酶链反应原理和常用方法。聚合酶链反应原理和常用PCR产物检查方法。以产物检查方法。以PCR为为 基础的相关技术。基因芯片技术。基础的相关技术。基因芯片技术。 细胞凋亡概念，细胞凋亡形态学的基本变化及主要生物化学特细胞凋亡概念，细胞凋亡形态学的基本变化及主要生物化学特 征。细胞凋亡的机制。征。细胞凋亡的机制。 细胞化学染

4、色检验细胞化学染色检验 细胞化学染色细胞化学染色，是一种以，是一种以 细胞形态学细胞形态学为基础，结合为基础，结合 运用运用化学反应的原理化学反应的原理对血对血 细胞内的各种化学物质作细胞内的各种化学物质作 定位定位、定性定性及及半定量半定量分析分析 的方法。的方法。 细胞化学染色检验细胞化学染色检验 血细胞化学染色的基本要求是血细胞化学染色的基本要求是 在在原位原位显示细胞成分和结构，显示细胞成分和结构， 反应产物应是反应产物应是有色沉淀物有色沉淀物，具，具 有一定的有一定的稳定稳定性。性。 血细胞化学染色可显示血细胞化学染色可显示糖原糖原、 脂类脂类、酶酶、蛋白质蛋白质等。等。 细胞化学染

5、色检验细胞化学染色检验 基本步骤基本步骤 固定固定：蒸汽、液体固定：蒸汽、液体固定 有色沉淀反应有色沉淀反应：偶氮偶联：偶氮偶联 法、普鲁士蓝反应、雪夫法、普鲁士蓝反应、雪夫 反应、联苯胺法反应、联苯胺法 复染复染 细胞化学染色检验细胞化学染色检验 临床意义临床意义 辅助判断急性白血病的细胞类型辅助判断急性白血病的细胞类型 辅助血液系统疾病的诊断和鉴别诊断辅助血液系统疾病的诊断和鉴别诊断 观察疾病疗效和判断预后观察疾病疗效和判断预后 探讨某些疾病的发病机制探讨某些疾病的发病机制 一、过氧化物酶染色（一、过氧化物酶染色（POX） 原理：原理： 粒细胞和单核细胞胞浆中含有的髓粒细胞和单核细胞胞浆中

6、含有的髓 过氧化物酶（过氧化物酶（myeloperoxidase， MPO）能将底物过氧化氢分解，产）能将底物过氧化氢分解，产 生新生态氧，它将四甲基联苯胺氧生新生态氧，它将四甲基联苯胺氧 化为联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢化为联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢 氧化，显棕色四甲基苯醌二胺，再氧化，显棕色四甲基苯醌二胺，再 加入亚硝基铁氰化钠与联苯胺蓝结加入亚硝基铁氰化钠与联苯胺蓝结 合，可形成稳定的蓝色颗粒，定位合，可形成稳定的蓝色颗粒，定位 于细胞浆内酶所在的部位。于细胞浆内酶所在的部位。 POX结果判断结果判断 细胞质内有细胞质内有蓝黑色颗粒蓝黑色颗粒者为阳性。者为阳性。 （）（） 无颗粒沉着无颗粒

7、沉着；（；（a） （） 颗粒细小颗粒细小 ，分布稀疏，分布稀疏； （b） （+ +） 颗粒较粗，局灶分布颗粒较粗，局灶分布； （c） （+） 颗粒粗大，分布较密，颗粒粗大，分布较密， 占胞质占胞质 1/22/3 1/22/3 ；（；（d） （+） 颗粒粗大，呈团块分布颗粒粗大，呈团块分布； （e） （+） 全部胞质均部满颗粒，全部胞质均部满颗粒， 可覆盖胞核可覆盖胞核（f） 。 各种细胞过氧化物酶染色各种细胞过氧化物酶染色 嗜碱 粒细 胞 嗜 酸 性 粒 细 胞 原幼 粒细 胞 骨髓片POX染色 临临 床床 意意 义义 POX染色是辅助诊断急性白血病细胞类型的染色是辅助诊断急性白血病细胞类型的

8、首选、最重要首选、最重要的细胞化学染色。的细胞化学染色。 （1 1）粒系粒系：POX主要分布在主要分布在粒细胞粒细胞和和单核细胞单核细胞内，随着粒细胞内，随着粒细胞成熟成熟的程度而逐的程度而逐 渐增强，中性分叶核粒细胞为渐增强，中性分叶核粒细胞为强强阳性阳性。 嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞阳性程度阳性程度最强最强，其阳性颗粒比中性粒细胞粗大，有折光。，其阳性颗粒比中性粒细胞粗大，有折光。 嗜碱性粒细胞嗜碱性粒细胞为为阴性阴性。 （2 2）单核细胞单核细胞： 原始单原始单核细胞为核细胞为阴性阴性反应，反应， 幼稚单幼稚单核细胞和核细胞和成熟单成熟单核细胞呈核细胞呈弱阳性弱阳性反应，颗粒细小，弥散分布

9、。反应，颗粒细小，弥散分布。 临临 床床 意意 义义 （3 3）其他细胞淋巴其他细胞淋巴细胞、细胞、浆浆细胞、细胞、幼红幼红细胞、细胞、组织组织细细 胞、胞、巨核巨核细胞均呈细胞均呈阴性阴性反应。反应。 （4 4）血小板过氧化物酶血小板过氧化物酶主要定位于主要定位于幼稚型幼稚型巨核细胞的核膜上，可作为原巨核细胞的一种巨核细胞的核膜上，可作为原巨核细胞的一种 标志物，有助于标志物，有助于FAB M7的识别。的识别。 临临 床床 意意 义义 骨髓片POX染色 APL：呈强阳性反应 AML-M4：部分呈阳性反应， 部分成弱阳性反应 AML-M5：呈弱阳性 ALL：呈阴性，10个铁颗粒。个铁颗粒。 正

10、常范围：正常范围：12% 44% ，平均，平均21.4%， 多见多见型，少见型，少见型，无型，无、型型。 细胞内铁细胞内铁 结果判断结果判断 （3）环形铁粒幼红细胞环形铁粒幼红细胞： 指含铁颗粒指含铁颗粒6个个，其中，其中1/2以上以上铁颗粒铁颗粒围绕核周排列成完整环形或不完整围绕核周排列成完整环形或不完整 环形环形。 正常或非铁粒幼细贫血正常或非铁粒幼细贫血无无环形铁粒幼细胞，环形铁粒幼细胞，铁粒幼细贫血铁粒幼细贫血中环形铁粒幼中环形铁粒幼 细胞细胞6% 环形铁粒幼细胞环形铁粒幼细胞 临床意义临床意义 1缺铁性贫血缺铁性贫血时，时， 骨髓细胞外铁明显减少，为骨髓细胞外铁明显减少，为“一一”“

11、士士”，细胞内铁平均，细胞内铁平均5.9%，仅，仅 为为I 型。经有效铁剂治疗后，外铁增多。因此骨髓铁染色是诊断型。经有效铁剂治疗后，外铁增多。因此骨髓铁染色是诊断缺铁性缺铁性 贫血贫血及指导及指导铁剂治疗铁剂治疗的重要方法。的重要方法。 2铁粒幼细胞性贫血铁粒幼细胞性贫血时，时， 外铁外铁“2”一一“3”，内铁平均，内铁平均70%，其铁粒粗大，以，其铁粒粗大，以 型型 为为 主，出现较多环形铁粒幼细胞。因此，本实验是诊断主，出现较多环形铁粒幼细胞。因此，本实验是诊断铁粒幼细胞贫铁粒幼细胞贫 血血的有效方法。的有效方法。MDS也可出现环形铁粒幼细胞。也可出现环形铁粒幼细胞。 3. . 非缺铁性

12、贫血非缺铁性贫血 如巨幼细胞贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等骨髓铁正常或不同程度如巨幼细胞贫血、溶血性贫血、再生障碍性贫血等骨髓铁正常或不同程度 的增加。但再生障碍性贫血不会出现环形铁粒幼细胞，可作为与的增加。但再生障碍性贫血不会出现环形铁粒幼细胞，可作为与MDS鉴别鉴别 的参考。的参考。 4. . 继发性贫血的部分患者细胞内铁可减少，但细胞外铁不减少。继发性贫血的部分患者细胞内铁可减少，但细胞外铁不减少。 五、过碘酸五、过碘酸-雪夫染色（雪夫染色（PAS） 原理：原理： 过碘酸过碘酸-雪夫（雪夫（Periodic acid-schiff，PAS）染色）染色 又称糖原染色。胞浆内又称糖原染色

13、。胞浆内 存在的糖原或多糖类物存在的糖原或多糖类物 质（如粘多糖、粘蛋白、质（如粘多糖、粘蛋白、 糖蛋白、糖酯等）中的糖蛋白、糖酯等）中的 乙 二 醇 基 （乙 二 醇 基 （ C H O H - C H O H ） 经 过 碘 酸） 经 过 碘 酸 （Periodic acid）氧化，）氧化， 转变为二醛基（转变为二醛基（CHO- CHO），与雪夫（），与雪夫（Schiff） 试剂中的无色品红结合，试剂中的无色品红结合， 形成紫红色化合物而沉形成紫红色化合物而沉 积于胞浆中糖原类物质积于胞浆中糖原类物质 所存在的部位。该反应所存在的部位。该反应 称为过碘酸称为过碘酸-雪夫（雪夫（PAS） 阳

14、性反应。阳性反应。 PAS结果判断结果判断 细胞质内有出现细胞质内有出现红色颗粒、块状红色颗粒、块状 或呈弥漫状红色或呈弥漫状红色者为阳性。者为阳性。 （）胞质无色，无颗粒。（）胞质无色，无颗粒。 （+）胞质淡红色或有少量红）胞质淡红色或有少量红 色颗粒，通常色颗粒，通常10个颗粒。个颗粒。 （+）胞质红色或有）胞质红色或有10个以上个以上 红色颗粒。红色颗粒。 （+）胞质呈暗红色或有粗）胞质呈暗红色或有粗 大红色颗粒，可出现红色大红色颗粒，可出现红色 块状。块状。 （+）胞质呈紫红色或有粗）胞质呈紫红色或有粗 大红色块状。大红色块状。 临床意义临床意义 （1）M6与巨幼贫的鉴别与巨幼贫的鉴别

15、 M6的幼红细胞的幼红细胞PAS可呈可呈强阳性强阳性，积分明，积分明 显增高，显增高，巨贫巨贫、再障、溶贫时、再障、溶贫时PAS反应为反应为阴阴 性性。 （2）急性白血病的类型鉴别）急性白血病的类型鉴别 ALL，PAS呈大块状阳性，也可是阴性，呈大块状阳性，也可是阴性， AML为为阴性阴性，急性单核细胞白血病时，急性单核细胞白血病时原单原单 核细胞及核细胞及幼单幼单核细胞核细胞PAS阳性阳性，积分增高，积分增高， 阳性颗粒小而多，呈弥散分布。阳性颗粒小而多，呈弥散分布。 PAS染色 AML-M6 幼红细胞呈阳性反 应 MA 幼红细胞呈阴性反 应 ALL-L1 L1 PAS(+) AML-M5

16、M5 PAS(+) AML-M6 AML-M6 PAS(+) AML-M7 M7 PAS(+) （3）巨核细胞和）巨核细胞和Sternberg细胞鉴别细胞鉴别 巨核巨核细胞细胞PAS强阳性强阳性，Sternberg细胞为阴细胞为阴 性或弱阳性。性或弱阳性。 （4）戈谢氏细胞强阳性戈谢氏细胞强阳性，尼曼尼曼-皮克皮克细胞细胞阴阴 性或弱阳性性或弱阳性。 （5）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴细胞的糖）淋巴肉瘤、霍奇金病等，淋巴细胞的糖 原积分增高；一般的病毒感染，糖原积分原积分增高；一般的病毒感染，糖原积分 在正常范围内。在正常范围内。 六、六、氯乙酸氯乙酸AS-D萘酚酯酶染色（萘酚酯酶染色（NAS-

17、DCE） 原理：原理： 细胞内的氯乙酸ASD萘酚酯酶（naphythol AS-D chloroacetate esterase,NAS-DCE）水解基 质液中的氯乙酸ASD萘酚，产生ASD萘酚， 进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有 色沉淀，定位于细胞质内酶所存在的部位。本 试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的有 色沉淀为红色。NASDCE几乎仅出现在粒细 胞，其特异性高，因此又称为“粒细胞酯酶”、 “特异性酯酶”。 结果判断结果判断 阳性结果为胞质内出阳性结果为胞质内出 现现红色红色沉淀沉淀 （）胞质无色。（）胞质无色。 （）胞质呈淡红色。（）胞质呈淡红色。 （）鲜红色沉淀（）鲜红

18、色沉淀 布满胞质。布满胞质。 （）深红色沉（）深红色沉 淀充满胞质。淀充满胞质。 临床意义临床意义 1急性粒细胞白血病和急性早幼粒细急性粒细胞白血病和急性早幼粒细 胞白血病原粒细胞胞白血病原粒细胞NASDCE染色多染色多 呈（）呈（）（）。白血病性早幼粒（）。白血病性早幼粒 细胞呈（）细胞呈（）（）。（）。 2急性单核细胞白血病原、幼单核急性单核细胞白血病原、幼单核 细胞多呈阴性反应。细胞多呈阴性反应。 3急性淋巴细胞白血病急性淋巴细胞白血病 原、幼淋巴细原、幼淋巴细 胞呈阴性反应。胞呈阴性反应。 七、七、中性非特异性酯酶染色中性非特异性酯酶染色 原理：原理： 中性非特异性酯酶包括醋酸AS-D

形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所 在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢蓝B， 形成的有色沉淀为棕黑色或灰黑色，-NAE存 在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，故它是 一种中性非特异性酯酶。 结果判断结果判断 阳性结果为胞

20、质内出现阳性结果为胞质内出现 蓝色蓝色或棕黑色颗粒或棕黑色颗粒沉淀沉淀 （）无颗粒沉淀，为（）无颗粒沉淀，为0分。分。 （）颗粒少量、稀疏，）颗粒少量、稀疏， 为为0.5分。分。 （）胞质内（）胞质内1/2区域出现区域出现 颗粒沉淀，为颗粒沉淀，为1分。分。 （）胞质内（）胞质内3/4区域出区域出 现颗粒沉淀，为现颗粒沉淀，为2分。分。 （）胞质内布满颗（）胞质内布满颗 粒沉淀，为粒沉淀，为3分。分。 （）胞质内充满（）胞质内充满 浓密的颗粒沉淀，为浓密的颗粒沉淀，为4 分。分。 临床意义临床意义 NASDAE染色属于中性非特异性酯酶染色，染色属于中性非特异性酯酶染色， 在鉴别白血病类型时需同

21、时做在鉴别白血病类型时需同时做NaF抑制试验。抑制试验。 1急性粒细胞白血病原粒细胞急性粒细胞白血病原粒细胞NAS DAE染色可呈阳性反应，且不被氟化钠抑制。染色可呈阳性反应，且不被氟化钠抑制。 2急性早幼粒细胞白血病白血病性早幼急性早幼粒细胞白血病白血病性早幼 粒细胞粒细胞NASDAE染色为阳性或强阳性反应，染色为阳性或强阳性反应， 亦不被氟化钠所抑制。亦不被氟化钠所抑制。 3急性单核细胞白血病原、幼单核细胞急性单核细胞白血病原、幼单核细胞 NASDAE染色多呈阳性或强阳性反应，但染色多呈阳性或强阳性反应，但 能被氟化钠抑制能被氟化钠抑制 骨髓骨髓NAS-DAE染色及氟化钠抑制反应染色及氟化