大神你现在就帮我算下 正五角形的 高和外接圆半径还有边长 3 者关系是固定比例吗？ 是的话，是多少呢？_百度知道
大神你现在就帮我算下 正五角形的 高和外接圆半径还有边长 3 者关系是固定比例吗？ 是的话，是多少呢？
。 知道这个比例我画图就简单多了高比外接圆半径比边长=1比多少比多少。。你找到答案了我在装修区有个110分的悬赏就给你了哦大神你现在就帮我算下 正五角形的 高和外接圆半径还有边长 3 者关系是固定比例吗？ 是的话，是多少呢
顶点到对边长高帮我直接写出答案好了正五边形外接圆半径？：：正五边形边长=1：
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（cos54°/0:边R：（1+sin54°）≈1.176:高=1：1：1.5）
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OK这才叫用心答题。不像下面的
没头没尾的 大家学习 学习
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比值是固定的。边长比外接圆半径=0.58
哦我 忘了比的意思 就是边长除以外接圆半径=0.58吗？OK
大哥继续帮我 找哈高和边长的比例您帮我直接写出来就 OK 外接圆半径：高：边长=1：？：？
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出门在外也不愁怎么把小蛋白标记到一抗上(一抗,蛋白,酶标记)
12:56:55&&&来源：&&&评论：&&
[怎么把小蛋白标记到一抗上(一抗,蛋白,酶标记)] 由于实验的需要，打算把小蛋白标记到一抗上，请问大家怎么标记呢？和HRP酶标记一抗一样么？ 关键词:[一抗 蛋白 酶标记]…
由于实验的需要，打算把小蛋白标记到一抗上，请问大家怎么标记呢？和HRP酶标记一抗一样么？
回复原理差不多的,就是那几个方法,什么EDC,戊二醛等等方法.回复什么是EDC，戊二醛法啊，可否介绍详细些？谢谢！回复抗体的酶标记法基本原理
本法是应用偶联剂使酶与抗体结合。即通过应用单、双或多功能基试剂，分别与大分子的抗体所存在的功能性基团发生反应，生成酶－抗体偶联复合物。不同的酶-抗体复合物制备方法中，最广泛应用的是第一步加入戊二醛的方法，本法与其它偶联方法相比，具有操作简单、反应条件温和，及实用面广等长处。 试剂及l亲和纯化的多克隆抗体或生物化学纯的单克隆抗体（5mg/ml PBS液或0.1 mol/L磷酸缓冲液 pH6.8）l用以标记的酶（EIA级，有商品供应）：辣根过氧化物酶( HRP,纯度为A430/A275 > 3)，黑曲霉葡萄糖氧化酶，小牛肠碱性磷酸酶（AKP），或大肠干菌β－D－半乳糖苷酶均可选用，但以HRP最为常用。l2５％戊二醛液（电镜级）l０.1 mol/L 磷酸钾缓冲液（pH6.8）lPBS ( 见附录 )l2 mol/L 甘氨酸液l蒸溜甘油l透析袋 （分子量）l电磁搅拌器和搅拌棒操作步骤一．抗体与过氧化物酶偶联1．将5mg抗体与10mg酶在总体积1ml的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）混合；2．在4℃对0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）透析过夜；3．用0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）稀释戊二醛至1%；4．向透析混合液中加入50μl 稀释过的戊二醛，在室温下轻1轻搅拌三小时；5．加入2 mol/L甘氨酸液使最终浓度达到0.1 mol/L，混合液室温放置2小时，以封闭残存的醛基6．混合液在4℃对PBS透析过夜；7．10000 × g 4℃离心30分；8．将上清移入另一管中，按体积1：1加入甘油，使终浓度达50%；9．置-20℃保存。二．抗体与AKP偶联1．将5mg抗体与10mg酶在总体积2ml的0.1 mol/L磷酸钾缓冲液（pH6.8）混合；2．其它操作同HRP标记法。三．抗体与葡萄糖氧化酶偶联按HRP偶联法操作，仅加入的1%戊二醛改为150 μl。四．抗体与β－D－半乳糖苷酶偶联按HRP偶联法操作，但见偶联反应总体积改为2ml，１%戊二醛用量改为的100μl。反应质量测定可用抗原包被的微量板通过直接酶免疫试验测定偶联度。（具体方法见-----实验要点及说明１．如果参与偶联的氨基位于抗体和抗原的结合位点，则在偶联反应中，被标记抗体的亲和性能会不同程度的受到破坏；２．主要影响偶联成功率的原因是在反应混合液中有游离氨基存在，游离氨基容易和戊二醛反应，因而干扰蛋白质的交连。因此，必须用绝对不含有机物的水配置缓冲液，并且反应混合液要在偶联前对该缓冲液充分透析，是反应成功的要点。３．反应不能应用Tris-甘氨酸缓冲液。回复
标抗体法酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。（一）酶的种类及特点从理论上讲，用细胞化学方法能显示的酶，均可用于标记抗体，进行icc染色，但实际上在icc中所能用的酶并不多。现将常用的几种酶列于表4-1，供选用时参考。表4-1 免疫细胞化学常用的酶名 称 分 子 量 内 源 性 商 品 horseeradish peroxidase(e.c.1,11,1,7) 40～45kd + 有 alkaline phosphatase (e.c.3,1,3,1) 80～120kd ++ 有 acid phosphatase (e.c.3,1,3,2) 100kd +++ 有 glucose oxidase 160～190kd － 有 sternberger(1986)指出，用于标记的酶应具备以下几点①酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察；②所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位；③较易获得的酶分子，最好有商品出售；④中性ph时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存1～2年活性不应改变，且酶的催化活性（turnover）越高越好；⑤酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性；⑥被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。其中，①②两点甚为重要，因为并非容易显示的酶均能形成不可溶性的复合物。一般认为，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase , hrp）较佳，是最常用的一种酶。hrp广泛分布于植物界，以植物辣根（西洋山嵛菜）的叶内含量最丰富而得名。它是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合组成的一种糖蛋白，糖占16%～18（8条糖链分布在hrp分子表面），分子量40kd，最适ph5～ 5.5，最适温度40～45℃； ph4～11，50℃以下均较稳定，易溶于水和58%以下的饱和硫酸铵溶液。酶的活性中心含铁卟啉，称辅基，最大吸收光谱为403nm，而其余非活性的酶蛋白部分吸收光谱为275nm，hrp的纯度是用二者的光密度比值（od 403/275）衡量，reinheit zahl (rz)表示。一般认为，标记酶的rz值为3.0左右，不应小于2.8，rz值越小，酶的纯度越差，例如rz值为0.6的酶，含非活性的酶蛋白量高达75%。对于纯度低、质量差的酶，需纯化后使用。除hrp外，碱性磷酸酶（alkaline phasphotase, alp）和葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, god）也较常用。alp分子量约为hrp的2～3倍，最适ph9.0～9.5左右，比较稳定，内源性alp也较易消除，大部分均可被左旋咪唑（levamisole, 分子量240.8kd）抑制，但肠粘膜表面的内源性alp活性不受影响。目前所用的alp大多系由牛的肠粘膜提取制得，所以肠粘膜等呈强阳性反应。alp最初是由bulman等用于标记抗体的。选用不同的底物，可形成不同颜色的终产物，例如以萘酚（as-mx）和快蓝（fast blue, fb）为底物，生成蓝色沉淀。用快红（fast red, fr）代替fb，形成红色不溶沉淀。与hrp/4-氯-1-萘酚（cn）或dab形成的沉淀形成鲜明对比，但fb、fr等沉淀物溶于有机溶剂，不能进行脱水、透明等处理。据报告，利用新品红（new fuch－sine ）显色，形成的红色沉淀产物不溶于有机溶剂，不褪色，轻度核复染后，可制成半永久性保存标本。god所催化的底物为葡萄糖，电子供体为对硝基四唑蓝（p-nitroblue tetrazolium）,终产物为不溶性的蓝色沉淀，比较稳定。从理论上讲god较alp、hrp为佳，因为哺乳动物(mammalian)组织内不存在内源性god，但其分子量较大，具有较多的氨基，在标记时易形成广泛的聚合，影响酶的活性，故god主要用于icc双重染色和两种酶的放大技术。（二）本科标抗体的制备（boosma, dm, 1983）酶标抗体与荧光色素标记抗体不同，它需借助桥-偶联剂的作用，将酶连结在抗体分子上。偶联剂是一种双功能，具备3个基本特征：①偶联剂与抗体和酶之间的连结，必须是不可逆的，即借共价键连结；②偶联剂不应影响酶和抗体的活性；③不能因偶联剂的加入，使酶与组织成分了生非特异结合。在hrp标记抗体中，常用的偶联剂有戊二醛、过碘酸钠及 maleimide等，现简介如下。1．戊二 醛标记法　　戊二醛为制备各种酶标抗体最常用的偶联剂。市售戊二醛往往含有戊二酸、丙烯释及戊二醛自身聚合本等杂质，故需纯化后使用。戊二醛的纯度用含杂质的二醛的单体戊二醛的od比值表示，它们的最大吸收光波长分别为235nm 和280nm，二者的od比值（235/280）小于3时，制备酶标抗体的效果较好，大于3时，需经蒸馏或sephadex g-10柱层析或活性碳吸附等处理，除去杂质后应用。其制备方法分一步法和两步法；基本原理相同，是使戊二醛的两个醛基之一与酶蛋白的赖氨酸结合，另一醛基与免疫球蛋白上的氨基结合，将酶连结于抗体上。（1）一步法：将酶、抗体、戊二醛按一定比例混合，经透析除去标记物中剩余的戊二醛，制得酶标抗体。优点是简单省时，缺点是反应程度不易被控制，因为酶蛋白分子和抗体蛋白分子同戊二醛间的反应速率不同，抗体蛋白的氨基数远较hrp为多，与戊二醛反应快，因此在戊二醛的作用下，抗体蛋白易通过分子内和分子间的彼此交联，形成较大的聚合体，而与酶蛋白分子间的交联相应减少，影响酶的标记。据nakane等推算，加入的hrp仅20%与抗体连结，标记率较低（约1%～5%）很难获得理想的酶标抗体。（2）二步法：首先用过量的戊二醛与hrp反应（hrp：戊二醛为 1：105），以保证酶分子仅与戊二醛的一个醛基结合，另一个醛基游离；然后用层析法除去多余的戊二醛，制成活性hrp（hrp-戊二醛复合物），再加入过量的抗体，使活化hrp上剩余的醛基与抗体蛋白分子上的氨基结合，制成酶标抗体。过量的抗体可以保证酶与抗体间均匀连结，避免酶本身聚合。根据所用的hrp与抗体（igg）比例不同，酶标记率各异 ，平均为5%～25%。标记步骤如下：①10～15mg hrp(rz=3.0),溶解于0.2ml 1.25%戊二醛中（0.1mol/l磷酸缓冲液配制），18h室温。②透析或 sephadex g-25柱层析（0.15mol/l nacl平衡），去除过量的戊二醛，收集活化hrp。③浓缩活化hrp至10mg/ml左右，加入抗体5mg(1.0ml 0.15mol/l nacl 溶解)。④碳酸盐缓冲液（ph9.5）调整ph至9.0～9.5,使抗体与活化hrp结合，4℃ 24h。⑤加入0.1ml赖氨酸缓冲液，阻断未反应的醛基，4 ℃，2h。⑥用半饱和硫酸铵沉淀5次，对pbs透析24h，4℃，换3次pbs，除去硫酸铵（10000rpm/min, 30min）。⑦或用凝胶色谱法（sephadex g-200/sephacryl s-200） 等分离标记抗体。注意：该方法要求hrp的rz值在3.0左右，游离氨基较少，与戊二醛反应后，制成的酶标抗体大部分为单体；而rz值小于2.8的hrp，含有较多的游离氨基，与戊二醛反应后，易形成多聚体，使方法的敏感性下降。2．过碘酸盐氧化法　　严格地讲，过碘酸钠（sudium periodate）不是一种真正的偶联剂，其本身并非作为桥连结在抗体和酶之间，而是借助于过碘酸钠的氧化作用，将酶连结在抗体上。该方法仅适于含糖较丰富的酶（如hrp）的标记。我们知道，hrp分子的糖本身与酶活性无关，利用过碘酸钠氧化这部分糖分子内的-ch基，使之生成-cho基，再与抗体蛋白的游离氨基反应，生成shiff’s碱。此shiff’碱在ph降低时呈可逆性解离，所以经氢硼化钠（nabh4）还原，形成稳定的酶标抗体复合物（图4-1）。为防止生成的-cho基与酶蛋白氨基自身交联，预先可用二硝基氟苯（dintro-fluorobenzene）处理hrp，阻断分子内的ε-、α-氨基。图4-1　过碘酸盐氧化原理过碘酸盐氧化法，酶的rz值≥3时较佳；rz<3时，糖含量较少 ，游离氨基较多，氧化时酶易发生本身聚合，影响酶标抗体的产量，据报告，适当地控制过碘酸盐溶液及反应条件，几乎所加入的hrp和抗体均形成酶标抗体，其标记率为70%左右。具体步骤为：（1）4mg hrp(rz=3.0)溶于1.0ml双蒸水中。（2）加0.2ml新鲜配制的0.1mol/lnaio4，轻轻摇动混合20min,肉眼可见液体内棕黄变成深绿色。（3）对0.1mol/l醋酸盐缓冲液（ph4.4）透析，20h，4℃。（4）调整hrp液体的ph至9.5(一般加入20μl0.2mol/l碳酸盐缓冲液ph9.5),立即加入抗体(igg)8.0mg/fab 3.0mg (0.01mol/l碳酸盐缓冲液溶解),轻轻混匀后,置室温2h。ph≤8.5时,抗体的nh2基被氧化生成nh3+,后者不能与cho基反应,所以,保持ph9.0～9.5非常重要。（5）加入0.1ml新鲜配制的0.4%nabh4 溶液，置1～4℃ 2h，以稳定酶标抗体复合物。（6）经透析等去除未反应的nabh4 ，避免还原过度 。然后经盐析或柱层析等方法分离酶标抗体（方法同戊二醛法）。如此制得的酶标抗体，加入终浓度1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin, bsa）分装后于-80℃可保存数年；亦可加入6%等量甘油，混匀置-20℃/4℃保存1年左右。上述两种标记法是icc研究中最常用的酶标抗体制备方法。3．maleinmide法　　 上述酶标抗体（igg）的分子量较大，对抗体的穿透性有一定影响，而在制备过程中，需经两次纯化，即多聚体与单体及单体与非标记抗体的分离。已知单体（1个hrp分子标记1个igg分子）的分子量为190～200kd，非标记抗体为146～150kd，用凝胶过滤法很难将二者分开。所以,sternberger等进行了抗体片段fab的标记。用植物性蛋白酶---木瓜酶（papain）水解抗体蛋白，可获得一个无抗体活性稳定的fc段结晶和两个相同的抗原结合片段（fab），此fab段为单价，分子量50kd,hrp标记后，单体分子量为90kd,较容易将单体和非标记的fab段分离。在此基础上，imagawa(1982)又进行了改良，引入了n-羟基丁二酰酯（maleinmide），标记抗体的特定部位--- maleinmide法。该方法的主要原理是：（1）借助双功能maleinmide活化hrp，使其具有与—hs 基反应的能力；（2）利用胃蛋白酶水解igg，igg重链在近羧基端被切断，这样在绞链区（hinge region）至少可以保留一个s-s键，从而得到一个具有双价抗体活性的f（ab＇）2段。该s-s键与抗体活性无关。可以通过加入硫基乙醇（2（β）-mercapto ethanol, hsch2ch2oh）使其断裂，被还原成—hs基 。如此双价抗体活性的f（ab＇）2片段即变为带有—hs 基的单价fab’片段，后者再与活化的hrp结合，便制成了酶标抗体fab＇。由于空间遮蔽的关系，绞链区即使存在两个—hs基，也只能有一个能与酶结合，另一个—hs基不能与酶反应，即酶与抗体fab’段结合比例为1：1，因此酶标抗体fab’段绝大多数是单体，很少形成多聚体。在标记过程中，应用过量的活化hrp，还能避免非标记抗体fab＇段的存在。fab＇段的分子量与fab段相似（50kd左右），所以酶标后fab＇亦较容易与未标记的fab＇分离。此标记方法多用于酶免疫分析研究，其步骤为：①6mg hrp溶于1.0ml pbs(ph7.0)中。②4mg maleinmide 溶于0.5ml n, n二甲基酰胺（n,n-dimethylformamide）中。③将上述两种液体充分混合，持续搅拌1h,30℃。④离心取上清，经0.1mol/l pb(ph6.0)平衡的sephadex g-25柱层析，收集含有蛋白部分的洗脱液，浓缩，制得活化hrp。⑤每1.8mg活化hrp，加入已被还原的fab＇2mg,4℃ 20h持续搅拌。⑥ sephadex g-200/sephacryl s-200分离酶标抗体fab＇片段，保存同前。（三）酶标抗体的纯化上述各种方法制备酶标抗体时，除产生酶标抗体外 ，还有未标记的抗体蛋白、游离酶、酶二聚体及偶联剂等。这些均可使酶标抗体的敏感性下降，故酶标抗体须经纯化后应用。现简介几种常用的纯化方法。1．多聚体的分离　　实验中，不同的试剂形成的多聚体的数量各异，即使同样的实验药物和程序，在不同的时间制备的酶标抗体中，多聚体的数量亦不相同。多聚体较单体含酶量多，与组织的非特异吸附增强，使方法的敏感性下降，故用前必须除去多聚体。以凝胶过滤法分离多聚体的效果较好。2．非标记抗体的分离 　　非标记抗体与标记抗体具有相同的免疫学特征，能竞争与组织特异抗原结合，而且亲和力较标记抗体强，优先与组织抗原结合。一般认为每个抗体连结1～2个酶分子，并不影响抗体的两个（fab）抗原结合点 ，但因存在空间遮蔽现象，一个fab段与组织特异性抗原结合。非标记抗体则不存在这种现象，两个fab段均与抗原结合，因而亲合力较强。所以 酶标抗体在应用前须用琼脂糖亲合层析等方法去除非标记抗体。3．亲合层析 　利用蛋白a（protein a）/琼脂糖-刀豆素a/琼脂糖亲合层析柱能制得较纯的酶标抗体。因为蛋白a与抗体（标记和未标记）间有较强的亲合力，不与hrp结合。而刀豆素a与hrp（标记和游离）间的亲合力非常强，不与抗体结合。据此二者并用，能获得较纯的hrp酶标抗体 。该方法省时，分离能力强（约为凝胶层析的600倍）。但有一定的局限性，因为蛋白a并非与所有种属的免疫球蛋白亲合力均较强，例：不能与羊的免疫球蛋白结合，所以难以用于纯化羊的酶标抗体。而刀豆素a与hrp的亲合力极强，甚至呈不可逆性结合，可使部分酶标抗体的活性丧失。（四）染色原理及步骤1．基本原理　　酶标抗体与荧光色素标记抗体的染色相同，亦分直接法和间接法。直接法是将酶直接标记在每一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。间接法所用的第一抗体是对组织细胞内某种抗原的特异性抗体（80%～90%的抗血清系由家兔制得，而绝大数单克隆抗体系由小鼠制备）；第二抗体则为第一抗体（家兔/小鼠的igg）的抗体。所以，只要不同的第一抗体均来自同一种属，同一标记的第二抗体就能用来显示其不同特异性抗原的存在，这样可避免了直接法中标记每一种第一抗体的麻烦，并且提高了方法的敏感度。目前的icc染色中，以间接法为常用，在此着重介绍间接法的染色程序。2．染色程序（1）切片准备：见第一章 。①石蜡切片经二甲苯或hemo-de脱蜡，下行酒精至水。②固定/无固定新鲜组织冰冻切片，室温干燥2h以上。（2）未固定的新鲜组织切片，丙酮固定20～30min(fretrieval )，简而言之，即用蛋白酶处理，去除固定剂交联造成的空间遮蔽（室温），风干15～30min.;已固定的组织冰冻切片及石蜡切片，根据需要可进行组织抗原的激活。（3）用蜡笔沿切片周围勾划一道屏障，以避免孵育液流失及孵育过程中切片干燥，同时也能节 省抗体用量，保持切片与抗体的充分接触，风干。石蜡切片（滴少量pbs，以防其干燥）直接进行步骤（6）。（4）切片经pbs或其它缓冲液漂洗3次，每次2min，溶解除去冰冻切片上的oct包埋剂。但应用alp标记抗体时，禁用二甲胂酸钠缓冲液漂洗，因后者可使alp失活。（5）根据需要，用甲醇+0.3% h2o2处理切片15～30min（室温），封闭内源性过氧化酶的活性。应用alp标记抗体时，此步可省略。（6）pbs漂 洗2min（共两次），移至0.05% tween-20/pbs(或0.22～1% triton x-100)中5min（室温）。tween-20为一种表面活性剂，除具有清洁作用外，还可增加组织的通透性，有利于组织细胞内抗原的显示。（7）4% block ace或0.1%～1%bsa湿盒内孵育15～25min（室温），然后；轻轻弃去孵育液（不冲洗）；以阻断组织与抗体的非特异性结合，降低背景染色。（8）根据需要，可用1/5～1/30正常来活兔/羊血清孵育15～20min（室温，以酶标抗体相同种属正常血清为宜，最好是同一动物免疫前的血清）。或者省略此步，而在稀释酶标抗体时， 加入1%～2%的同一种属正常血清。（9）轻轻弃去孵育液， 滴加含0.2% bsa/0.05 nan3/pbs稀释的第一抗体（抗体用量：每张切片一般为50～80μl），湿盒内孵育1～2h（20～25℃）；免疫电镜用标本，4℃过夜。（10）pbs充分冲洗（3次×2min），以去除切片上非特异吸附的抗体。应用不同的第一抗体或同时进行对照标本染色时，需分别冲洗，以防相互污染。（11）经0.05%tween-20/pbs 2min后,滴加含0.2%bsa/1%正常血清/pbs稀释的hrp酶标记的第二抗体,湿盒内孵育45～60 min(20～25℃)。（12）pbs漂洗（3次×2min）,此处不需分别漂洗，因所有切片均系同一酶标抗体孵育。（13）未固定或固定较弱的冰冻切片，此处可轻微固定。首先将切片从pbs移至tbs中3～5min，去除pbs，以防其中的磷酸与后面使用的固定液中的cacl2形成磷酸钙而沉淀后，然后用baker氏固定液固定5min（室温）此时轻微固定，既不影响抗原抗体结合，又较有利于保存第一抗体孵育前的组织抗原，尤其适用于单克隆抗体的icc染色。（14）呈色：hrp标记抗体的呈色液为0.01%～0.1% h2o2 0.01%～0.05% dab 0.05～0.1mol/l tris –hcl(ph7.4)。切片经pbs或tris-hcl液漂洗后，置上述呈色液内10～15min（室温、暗处），亦可镜下控制显色速度。终产物为棕褐色沉淀。用于电镜观察的标本，呈色3～5min即可，防止dab终产物向周围扩散，影响超微结构定位。另外，显色液应于用前新鲜配制，避免dab本身氧化变质。新配制的dab为无色透明液体。若dab液已氧化变为紫红色，应换新药重新配制。（15）将切片置流水中（仅光镜观察）或pbs（电镜标本）内，终止呈色反应。（16）未固定的冰冻切片，可用1%戊二醛-pbs液加强固定5～10min（室温），流水冲洗。（17）细胞核轻度染色，以甲基绿和苏木精为常用。前者细胞核呈绿色，与hrp/alp等终产物对比度尤佳，但不适于微波照射的标本。苏木精是组织学、病理学研究中普遍应用的核染色方法，与hrp、alp的终产物对比度比较好。（18）dab呈色的标本，可以系列酒精脱水、hemo- de透明、dpx封固。其它物质呈色的标本，在有机溶剂中沉淀物易溶解，褪色，所以用水溶性封固剂如明胶甘油等封固，次日，于盖玻片周围涂少许女士用指甲油，可使切片保存时间更长。（19）镜检、观察记录同一般形态学研究。（20）免疫电镜用标本，经oso4后固定，按电镜标本要求处理（参见本书第七章 ）。亦可oso4固定，喷碳（carbon coating）,利用扫描电镜观察抗原的存在部位。3．酶标抗体及发色剂的选择hrp特异底物为h2o2,在分解h2o2过程中,与h2o2形成复合物,无电子供体存在时,反应不再进行,当电子供体存在时,迅速生成水,酶被还原,电子供体被氧化环化,形成苯乙胼聚合体 (图4-2)。在酶反应部位，形成不溶性棕褐色沉淀，与组织对比清晰。图4-2
dab反应产物形成过程hrp催化的酶促反应第一步是特异性的—酶催化底物h2o2，其余反应是非特异的，可用各种电子供体介导，所以选用不同的电子供体，可使终产物呈不同颜色，例如：cn（4—chloro—1 – n aphthol）为蓝黑色，tmb（tetramethyl—benzidine ）为深蓝色，aec（3—amino—9 – ethyl--carbazole）为红色。市售试剂盒所配显色液以aec居多，室温下较稳定，但不能进行脱水等处理，且时间长易褪色。dab是广泛应用的电子供体之一 ，较敏感，切片可脱水透明、半永久保存，且终产物具有嗜饿性，经o2o4处理，电子密度增加，适于电镜下确定抗原的存在部位。但是dab被认为可能具有致癌性，所以应尽量减少吸入和接触次数，最好将dab制成10倍贮存液，分装于-20℃保存，应用时稀释、过滤。与dab比较，cn敏感性略差，但因其终产物较局限，很少弥散，光镜观察较为适合。（2）alp，是以as-mx为底物，fb/fr为发色团，生成蓝色/红色不溶性沉淀。alp标记抗体主要用于内源性过氧化酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的icc染色。显色液内加入终浓度为2～4mmol/l 的levamisole, 大多数内源性alp活性可被抑制。通常左旋咪唑（levamisole）以每毫升60～120mmol/l浓度的贮存液-20℃冰箱保存。应用时稀释30倍。为避免反复称取，试剂吸水，as-mx、fr、fb试剂均应小量分装后-20℃冰箱保存，左旋咪唑能抑制内源性碱性磷酸酶活性。例如：以每次所用显色液30ml计算，分装as-mx 5～7mg/支、fr 8mg./支、fb7mg/支，每次使用一支，用前稀释30倍，过滤显色 。fr、fb等在光照射条件下易引起沉淀，故显色反应在暗处进行。（3）god，是以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为β-d-葡萄糖67mg、nbt6.7mg、pms（phenazine methylsulfate）0.167mg, 0.05mol/l pb(ph8.3)10.0ml,37℃孵育1h。生成蓝色不溶性沉淀。该终产物不溶于有机溶剂，切片可脱水透明，长期保存。但god的敏感度较hrp和alp为低，电子供体少，应用较局限，主要用于两种酶的放大技术，能提高方法和敏感性和特异性。即用god和hrp分别标记第二、第三抗体（例第一抗体为小鼠单克隆抗体、第二抗体为god标记的兔抗鼠igg，第三抗体则为hrp标记的羊抗兔igg），icc染色，以葡萄糖-dab作显色剂。基本原理如（图4-3）。在这里hrp是作为第二酶系统，利用葡萄糖氧化时生成的h2o2作底物，催化酶促反应，不受内源性过氧化酶的影响。而且god和hrp所标记的抗体是结合在同一抗原位置，所以能良好地显示组织抗原的存在。其主要染色步骤为：①切片经第一抗的孵育；②漂洗，god标记的第二抗体孵育40～60min（室温）；③漂洗，hrp标记的第三抗体孵育30～45min（室温）；④漂洗，显色、脱水透明观察同前。　图4-3　两步酶催化反应原理二、非标记抗体酶法由于酶标抗体存在一些缺点，例如①酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性；②抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。为此sternberger等在酶标法的基础上，发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法（enzyme bridge method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（peroxidase antiperoxidase method, pap法）。现分述如下。（一）酶桥法1．基本原理
首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节 省第一抗体的用量。2．染色步骤 主要程序如图4-4图4-4　酶桥法主要染色步骤（1）切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法，第一抗体（假设来自种属a）孵育24h（4℃）。第一抗体的稀释度可高些，使抗体的两个fab段均与组织抗原结合，较牢固，漂洗时不易丢失。（2）切片与第二抗体（也称桥抗体，抗种属a igg抗体）孵育1～1.5h（室温）。应用过量的桥抗体能保证一个fab段与第一抗体结合，另一个fab段游离。（3）切片与抗酶抗体（来自种属a）孵育1～1.5h（室温）。因抗酶抗体和第一抗体均系种属a igg，具有相同的抗原性 ，所以 桥抗体游离的fab能与抗酶抗体结合，起到桥的作用，将抗酶抗体连结在与 组织抗原结合的第一抗体上。（4）切片与酶（hrp 70～100μg/ml,pbs溶解）孵育0.5h（室温），酶与抗酶抗体结合。（5）显色等与酶标抗体法相同。酶桥法克服了酶标抗体法的缺点，较好地保护了抗体和酶活性。但仍有其不足：①在酶抗体血清中，含有低亲合力和高亲合力两类抗体，它们作为抗原与桥抗体结合，主要依赖于桥抗体对它的亲合力，而与其本身对酶的亲合力无关，故二者均可被连结在桥抗体上。低亲合力的抗酶抗体与酶结合较弱，漂洗时易解离，使大部分酶（70%左右）丢失，降低了方法的敏感性。②第三步所用的抗酶抗体血清中，亦含有非特异性抗体，其抗原性与抗酶抗体相同，所以能与桥抗体结合，但不能与酶结合，影响组织抗原的显示。为此70年代初，sternberger(1970)又建立了pap法，并加以改良，现为icc研究中常用的方法之一 。（二）pap法1．pap的制备及特征 　pap复合物是离体制备的hrp抗hrp复合物，它的制备方法较多，现简介其中之一。（1）制备抗hrp血清：健康雄性家兔（2.0kg以上），可先于足跖皮下注射灭活的卡介苗（共10mg），2周后重复1次，刺激机体免疫系统(immune system)功能，1周后于背部脊柱两旁皮内多点注射1.0ml乳剂[（福氏完全佐剂，含hrp3.3mg(rz=3.0) ];间隔2周第2次注射，背部注入含hrp3.3mg的不完全福氏佐剂1.0mg；再间隔2周，第3次注射，2mghrp（溶于2ml生理盐水中），分别于前后小腿皮下和背部肌肉内多点注射，1周后采静脉血，检查效价。再隔1周第4次加强注射（条件同第3次），一周后检查抗体效价 ，琼脂糖扩散法（hrp0.1mg/ml）为1：128以上时，颈动脉取血，制备血清低温保存备用。（2）制备pap复合物：离体条件下，使兔抗hrp抗体与hrp形成可溶性复合物。在制备抗hrp血清时，hrp的纯度要高（rz≥3），而制备pap复合物时，hrp的质量要求不高，甚至可用酶的粗制品。【步骤】①取10.50ml抗hrp血清，加7.60ml含7.6mghrp（1.0mg/ml）的水溶液。②混匀，室温1h后，离心16000g 4℃ 15min。③0.9% nacl(冷盐水)溶解沉淀，离心16000g 4℃ 15min，重复4次。④加15.3ml hrp水溶液（含hrp30.64mg），室温，持续搅拌。⑤用1n hcl及0.1 n hcl调ph至2.3，沉淀物全部溶解变清，立即用1n 及0.1n naoh调ph至7.2。⑥慢慢加等体积的饱和硫酸铵，置0℃ 45min。⑦离心35000g 0℃ 15min，沉淀用50%硫酸铵漂洗两次。⑧用10.50ml水溶解沉淀，对透析液（48.6g nacl, 1.5n naoocch3 30ml, 3n(nh4)2so430ml, 水5.94l）透析，4℃离心，收集上清，加透析液使体积至10.50ml，分装低温保存。【质量鉴定】制备的pap复合物应检测酶和抗体的含量，以鉴定pap复合物的质量。常用检测pap的复合物在280nm（ igg的最大吸收波长）和400nm（hrp的最大吸收波长）的光密度值（od值），按下式计算igg和hrp的含量：　　　　一般hrp/抗hrp的克分子比达1.9时，可分装冷藏于-85℃冰箱，据报告如此冷藏的pap复合物可保留14年之久，活性无改变。但稀释后的pap复合物不稳定，4℃可保存2～3周。最好临用前配制。【pap复合物的特征】pap复合物的形成不同于其它抗原抗体反应，在抗原稍过量时，所有的抗hrp抗体均参与形成可溶性pap复合物，仅残留少许游离的hrp，而大多数抗原抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。pap复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响，无论最初加入的抗原抗体过量与否，最终形成的pap复合物其hrp/抗hrp之比绝大部分为3：2。应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明：pap复合物沉降系数为11.5s,分子量为400～430kd，由此可推算出酶与抗体之比为3：2，即每个pap生命物由3个hrp分子和2个抗hrp抗体组成，呈五角形结构，3个角为hrp，另两个角为抗hrp抗体。采用h2o2-dab染色，电镜下已经观察到pap复合物五角形环状结构，直径平均21nm 。这种结构异常稳定。据报告pap复合物的抗hrp抗体与hrp结合常数为108，在此可溶性复合物中，即使存在少量游离hrp，亦不影响其稳定性。2．pap染色原理及步骤（1）原理：与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在与组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是pap法将酶桥法的步骤3、4合并为1，用pap复合物代替，即第三步用pap复合物孵育切片，故称pap法。pap复合物中的抗hrp抗体和第一抗体为相同种属动物的igg，所以桥抗体能够作为“桥”将pap复合物连结在第一抗体上。（2）染色步骤：主要步骤与酶桥法相似，如图4-5。①切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法；切片与特异性第一抗体孵育同酶桥法。②用过量的桥抗体孵育，作用同酶桥法。图4-5　pap法主要染色步骤③用离体制得的pap复合物（1：30～300稀释）孵育1～1.5h（室温），使其被桥抗体连结在第一抗体上。亦可用alp抗alp复合物代替。④显色观察等同间接法。3．pap法的评价　　 pap法应用比较广泛，特别是近几年，pap、abc等试剂盒商品化，在科研和临床病理诊断等中有着广阔的前景。其主要特征和注意事项如下：（1）抗体活性高：非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性，因为在所有的反应过程中，任何抗体均未被酶连结，避免了标记过程（共价键连结）对抗体活性的损害。（2）灵敏度高：灵敏度是指icc方法所能发现最少数量抗原而言。从理论上讲，pap法应该较间接法敏感2倍以上，因为酶标抗体法中，酶与抗体为1：1标记，而pap复合物含有3个hrp分子。假设一个第一抗体同一个酶标抗体/pap复合物结合，则被连结于抗原部位的酶分子数量不同，所以pap法应较敏感。我们知道组织切片抗原的含量是未知的，所以不能直接在切片上检测方法的敏感度；但可以假设相邻切片抗原浓度相对恒定，采用相邻切片染色，以产生特异性染色所用的第一抗体最低浓度作为方法的敏感度，用信噪比（signal/moise, s/n）表示。据此，sternberger(1979)认为pap法较间接法敏感20～25倍，可进一步稀释第一抗体，以节 省其用量。但实际上pap法与间接法之间的差异并非如此明显。笔者在实验中注意到，pap显示阳性的抗原，相同的稀释倍数的第一抗体在间接法中亦呈阳性反应，而时间阴性时，pap法亦为阴性。其原因尚不清楚，可能与桥抗体和第一抗体结合时，“剩余”（游离）的fab段少，pap复合物被连结的相应减少有关 。另外 ，pap复合物分子量较大（400 kd）,冰冻切片时，对组织穿透性远不如酶标抗体（分子量90～180kda），所以不适于免疫电镜的标本制作。（3）背景染色低：在酶标抗体法中，被标记的非特异性抗体可与组织成分结合，造成背景染色（图4-6）。从理论上讲，在非标记抗体法，连结抗体中，即使存着非特异性抗体，因其不是抗第一抗体种属igg的特异性抗体，故亦不能与抗hrp抗体结合，不能把pap复合物连结在此非特异性抗体 上（图4-7）。当然，pap复合物内也可能存在些非抗hrp的抗体，假如这部分抗体能够与桥抗体及组织成分结合，但因其不是抗hrp的抗体，故不能与hrp结合，无酶活性。因此说桥抗体的引入，使icc的特异性得到了双重放大，s/n增大。但也有人认为，过量的桥抗体及pap复合物等均易与fc受体结合，致使背景染色增强。实验表明：合适的切片准备、恰当地应用封闭性阻断剂、正常以阻断非特异性结合，加之适当地 选择抗体稀释度和抑制内源性酶活性，pap法和间接法二者的背景均相当低。图4-6　间接酶标抗体法　背景染色增高原因图4-7　pap法降低背景的原理（4）假阴性及其处理：应用pap法显示抗原含理较多的组织或冰冻切片组织抗原保持良好的标本时，可导致阴性结果，这种现象称为假阴性。vandesand发现：应用pap法显示大鼠视上核和室旁核内加压素神经细胞分布时，第一抗体（1：200）染色，加压素含有细胞呈强性。如果取材前24～48h，脑室内注射秋水仙素，阻断轴突运输以增加视上核和视旁核加压素含量，同时组织标本经脱水、透明、再水化等处理以增加抗体的通透性，同样稀释度染色，结果却阴性。进一步实验发现：增加抗体的稀释度，开始出现阳性染色，稀释至1：1500时，染色最强，继续增加抗体稀释度，染色强度则下降。bigbee（1977）认为假阴性是第一抗体用量过高与组织抗原结合过多，使相邻两个伉体的fc段间的距离（d）恰好是连结抗体的两个fab段与之结合的长度，于是连结抗体不存在游离fab段，仅剩无活性的fc段，所以不能将pap复合物连结在与组织抗原结合的第一抗体上，结果阴性（图4-8）。因此，借助pap法研究组织抗原分布，特别是新鲜组织冰冻切片组织抗原保存较好时，第一抗体尽量用高稀释度，避免假阴性。石蜡切片很少发生这种现象，所以pap法在石蜡切片的icc观察中更为常用。图4-8　示假阴性：组织切片上结合过多的第一抗体，两抗体间的距离d 恰好适于桥抗体的两个fab段与之结合，无pap复合物结合的位置（5）桥抗体：也称连结抗体，它的两个fab段具有相同的结构、性质及与抗原结合的能力。因此，当第一抗体和pap复合物中抗hrp抗体来自同一种属动物时，桥抗体能同时与上述两种抗体结合，起到桥的作用。为了确保桥抗体的两个fab段之一与第一抗体结合、另一个与抗hrp抗体结合，桥抗体需用高浓度。另外，在非标记抗体酶法中可用葡萄球菌蛋白a（spa）代替桥抗体，进行icc染色。spa不受种属限制，应用范围广。（6）pap复合物：在pap法及酶桥法中，特别强调第一抗体和抗hrp抗体必须来自同一种属，桥抗体才能发挥桥的作用，将其连结在一起；但一些研究表明：第一抗体和抗hrp抗体来自不同种属，连结抗体仍可作为桥，将二者连在一起。例如erlandsen发现豚鼠igg作为第一抗体，可用羊抗兔igg、兔pap复合物显示之一。grzanna（1982）根据这一报告，利用豚鼠抗dbh作第一，羊抗兔igg为桥，12例兔血清制得的pap复合物中，仅3例染色较佳。这种第一抗体和pap复合物来自不同种属获得的阳性结果主要依赖于种属间的交叉反应。多数实验表明：抗体和种属交叉反应是有限的，也是不完全的。故利用桥抗体进行icc染色时，仍以第一抗体和抗酶抗体来自同一种属为宜
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