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化学试剂配制方法.doc
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【求助】50bp-400bp的目的片段，胶浓度多少合适？凝胶电泳一般用多少电压，跑多长时间啊？
【求助】50bp-400bp的目的片段，胶浓度多少合适？凝胶电泳一般用多少电压，跑多长时间啊？
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这个帖子发布于5年零259天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我的目的片段一个是100多bp，一个是300多bp，Mark选的是50bp单位的，今天早上跑胶的时候电压选110v，胶浓度1.5%，跑了30分钟，但是结果不好，连Mark都没有跑开，请问像这种大小的目的片段，一般来说胶浓度多少合适？凝胶电泳一般用多少电压，跑多长时间啊？谢谢
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理论上你的胶浓度1.5%可以的，电压我通常100v就可以了，你的电压用了110v而且还是30min肯定跑没了，条带不长不必用110v，也不用那么长时间的
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1.5%的胶应该也可以，不过片段不大，建议用2%的胶，电压问题倒不大，不过要看好溴酚蓝的位置。
心血管内科
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跑胶基本是随意，我跑1.1kb的片断，用过1.0-3.0%的都没问题，只要别太离谱就行，电压也随意，也是只要别太离谱，还有就是不要跑过了。
心血管内科
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对了，胶的浓度高跑出来的图要比浓度低的好看。
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这样，用2%的胶，电压100v，时间30min。
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琼脂糖凝胶电泳知识：琼脂糖凝胶浓度（%）&&线状DNA分子分离范围（kb）0.3&&5--600.6&&1--200.9&&0.5--71.2&&0.4--61.5&&0.2--32.0&&0.1--2试剂及配制：50×TAE缓冲液:2 mol/L Tris-乙酸, 0.05 mol/L EDTA(pH 8.0)。 配制1000 ml 50×TAE缓冲液方法：Tris 242 g， 冰乙酸 57.1 ml，0.5 mol/L EDTA 100 ml，加入600 ml去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1 L后.调pH 8.0，高温高压灭菌,4℃保存.1×TAE缓冲液的配制:量取20 ml的50×TAE缓冲液,再加入980 ml的去离子水.5×TBE缓冲液（Tris-硼酸）: 配制1000 ml 5×TBE缓冲液方法：Tris 54 g，27.5g硼酸，20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)。加去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1 L后.调pH 8.0，高温高压灭菌,4℃保存.溴化乙啶贮存液:10 mg/ml 溴化乙啶。配制100 ml溴化乙啶贮存液方法：称取1 g溴化乙啶,置于100 ml烧杯中,加入80 ml去离子水后搅拌溶解.将溶液定容至100 ml后,转移到棕色瓶中.室温保存.。6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油（或40%蔗糖）。配制10 ml 6×上样缓冲液方法：溴酚蓝 25 mg二甲苯青FF 25 mg，甘油 3 ml，用6×TAE缓冲液定溶至10 ml,分装成1 ml/管.-20℃保存.琼脂糖凝胶电泳操作步骤：1). 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2). 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3). 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4). 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. 5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min.6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存.常见问题及注意事项：1.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶.2.琼脂糖凝胶易于破碎,操作时要轻缓.3.电泳时应注意电源线路,预防触电.4.溴化乙淀具有致癌作用,配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套.并在专门的实验室内使用.5.紫外线对人体有损伤作用,开灯时间不宜太长,注意防护.6.DNA带形状模糊NA加样过多;电压太高;凝胶中有气泡.7.质粒DNA的存在形式有3种,①共价闭环DNA(cccDNA),常以超螺旋形式存在;②开环DNA(ocDNA),此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂,因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子;③线状DNA,因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带,它们的泳动速度为:cccDNA & 线状DNA & ocDNA. 添加来自TIANGEN的资料:1,琼脂糖:不同厂家＼不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同,影响DNA的迁移及其荧光背景的强度,应有选择的使用.2,凝胶的制备:凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致,溶化的凝胶应该及时倒入板中,避免倒入之前凝固结块,倒入板中的凝胶应该避免出现气泡,以免影响电泳结果.3,电泳缓冲液:为保持电泳所需的离子强度和PH,应经常更新电泳缓冲液.4,样品加入量:一般情况下,0.5CM宽的梳子可加0.5微克的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片断的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清楚;反之,则应该适当减少加样量,但是上样量过多会造成加样孔超载,从而导致拖尾或扩散,对于较大的DNA此现象更明显.5,DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品中应该使用同样的缓冲条件以消除这种影响.6,DNA迁移率取决于琼脂糖的浓度,迁移分子的形状及其大小.采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度.小片断DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,以提高分辨率.
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