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Aqggaa《医学微生物学》复习思考题
A​q​g​g​a​a​《​医​学​微​生​物​学​》​复​习​思​考​题
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列举医学上有重要意义的细菌合成产物及其特性。
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色素(可用于细菌的鉴别),可引起发热反应),具有耐高温特性、维生素(除供作自身的生长因子外,经高压蒸气灭菌(121℃:热原质(本质为脂多糖,供人体利用)等,也能分泌至菌体外、毒素及侵袭性酶(构成细菌的毒力因子),20min)也不能被破坏、细菌素(可用于细菌分型和流行病学调查)、抗生素(具有拮抗细菌的作用)医学上有重要意义的细菌合成产物主要有
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出门在外也不愁三株聚谷氨酸产生菌的鉴定、产物特性及发酵优化--《华东师范大学》2012年硕士论文
三株聚谷氨酸产生菌的鉴定、产物特性及发酵优化
【摘要】：γ-聚谷氨酸(Poly(Y-glutamic acid)是由微生物合成的一种细胞外水溶性高分子氨基酸聚合物,由L-谷氨酸或D-谷氨酸的α-氨基和γ-羧基形成肽键缩合而成,是一种对人体和环境无毒害的可完全降解的生物相溶性新型天然高分子,用途广泛,在农业、化工、医药等领域都有良好的应用前景。
目前,国内有关γ-PGA的研究大多处于实验室阶段,还没有实现大规模工业化生产。微生物发酵法生产γ-PGA的主要难题在于,菌株合成γ-PGA的代谢途径复杂,调节方式多样,提高菌株的发酵产率难度较大,从而使生产成本较高。故筛选高产菌种、降低生产成本是实现γ-PGA工业化生产的关键。
本实验室前期筛选得到三株产γ-PGA的发酵菌株CC、DL和TW,本研究拟对三株菌进行分类鉴定,初步了解三株菌的遗传背景,并对三株菌的产物特性进行研究,为三株菌作为工业上发酵菌株的可行性提供实验依据。选择其中一株高产菌株DL,通过液体发酵和固态发酵两种方式对其进行发酵优化以进一步提高γ-PGA产量。同时,利用基因重组原理,尝试敲除菌株TW携带的降解酶基因,进而构建一株拥有良好特性的工业发酵菌。
研究内容和结果概述如下：
1.三株产聚谷氨酸菌CC、DL和TW的鉴定
经形态学观察结合分子生物学方法：16S rRNA基因测序、核糖体分型技术及野生质粒序列同源性比对,将三株γ-聚谷氨酸的生产菌鉴定为枯草芽孢杆菌CC、DL和TW。产聚谷氨酸相关基因capBCAE及降解酶基因ywtD的序列测定与比对结果表明,三株菌与枯草芽孢杆菌的capBCAE基因同源性达到99.98%,三株菌均存在降解酶基因ywtD,同源性达到100%。
2.三株产聚谷氨酸菌C、DL和TW的产物性质研究
三株产聚谷氨酸菌的发酵周期、γ-PGA产量、分子量及结构均存在一定差异,菌株CC、DL和TW的发酵周期分别为48h、72h和60h,γ-PGA产量分别为25.81g/L、31.51g/L和25.80g/L,分子量分别为820kDa、700kDa和920kDa,菌株CC发酵周期最短,菌株DL的γ-PGA产量最高,菌株TW的γ-PGA分子量最大。三株产聚谷氨酸菌生产的γ-PGA均为D-L-混合型,但比例不同,来源于菌株CC的γ-PGA含有较高比例的L-谷氨酸。三者生产的γ-PGA均有较高絮凝活性,其中来源于菌株DL的γ-PGA絮凝活性可达到75.90%。
3. Plackett-Burman设计与最陡爬坡实验优化菌株DL产γ-PGA发酵培养基
通过Plackett-Burman设计优化菌株DL的发酵培养基,筛选出具有显著效应的3个影响因素,依次为谷氨酸钠、MgSO4·7H2O和NaCl。然后用最陡爬坡实验逼近最大产γ-PGA区域,所得最佳培养基组成为：麦芽糖6.25%,酵母粉1.25%,谷氨酸钠9%,NaCl3%,KH2PO40.625%,MgSO4·7H2O0.15%。优化后的γ-PGA产量可达81.56g/L,较优化前提高了158.8%。
4.菌株DL产γ-PGA固态培养发酵优化
考察了菌株DL以黄豆和豆粕粉为原料进行固态发酵的γ-PGA产量,实验结果表明,谷氨酸钠、葡萄糖以及辅料对γ-PGA的产率有明显影响,豆粕粉培养基中加入5%的谷氨酸钠时,γ-PGA的产率最高达到148.6g/kg,效果优于黄豆培养基。
5.菌株TW的基因改造初探
采用同源重组技术敲除菌株TW的降解酶ywtD基因。PCR扩增出长度分别为456bp和576bp的ywtD基因左右同源两臂,以卡那霉素抗性基因作为筛选标记,通过酶切、连接反应,转化入大肠杆菌DH5a,获得带有ywtD基因同源臂和抗性筛选标记的重组质粒pUC19-kan-ywtD-R-L,为将其转入菌株TW获得ywtd基因敲除的聚谷氨酸高产菌株打下基础。
综上,本实验室筛选和鉴定得到三株高产聚谷氨酸枯草芽孢杆菌CC、DL和TW,三株菌发酵产γ-PGA的性质各有不同,为工业上不同要求的聚谷氨酸应用提供了新的高产发酵菌株,值得深入开发研究。其中菌株DL经液体发酵优化和固态发酵优化后产量达到国内较高水平,具有潜在的工业应用价值。
【关键词】：
【学位授予单位】：华东师范大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2012【分类号】：TQ922.1【目录】：
摘要6-8ABSTRACT8-17第一章 γ-PGA产生菌及其产物合成与特性(综述)17-42 引言17 1. γ-PGA的生物合成基础17-20
1.1 合成γ-PGA的菌株17-19
1.2 γ-PGA的生物合成途径19
1.3 合成γ-PGA的有关基因19-20
1.3.1 cap基因19
1.3.2 pgs基因19-20 2. γ-PGA的生产20-30
2.1 γ-PGA的微生物发酵生产20-26
2.1.1 培养基组分的影响21-24
2.1.2 搅拌及通气量的影响24-25
2.1.3 γ-PGA生物合成路径的改进25-26
2.2 代谢工程微生物的γ-PGA生产26-28
2.3 γ-PGA的固态基质发酵28-29
2.4 γ-PGA发酵的动力学建模29
2.5 γ-PGA的回收和纯化29-30
2.5.1 液态基质发酵的产物回收29-30
2.5.2 固态基质发酵的γ-PGA_回收30 3 γ-PGA的性质30-33
3.1 γ-PGA流变学研究31
3.2 γ-PGA的分子量31-33
3.2.1 碱环境中的水解32
3.2.2 超声波降解32
3.2.3 加热过程中的自发水解32-33
3.2.4 微生物降解和酶的生物降解33 4 γ-PGA的应用33-40
4.1 药物领域的应用33-35
4.1.1 药物载体33-34
4.1.2 生物黏合剂34-35
4.1.3 组织工程35
4.2 化妆品领域的应用35-36
4.3 在食品工业领域的应用36
4.4 废水回收中的应用36-37
4.4.1 重金属离子的吸收36-37
4.4.2 生物絮凝剂37
4.5 农业上的应用37
4.6 其它潜在的应用37-40
4.6.1 低温保护剂37-38
4.6.2 生物可降解的塑料制品38
4.6.3 对比剂38
4.6.4 疫苗佐剂38-39
4.6.5 基因传递载体39
4.6.6 固定作用39-40
4.6.7 微囊载体40 5 本课题的研究目的与意义40-42第二章 三株产聚谷氨酸菌CC、DL和TW的鉴定42-64 前言42-43 1 材料43-44
1.1 菌种43
1.2 培养基43
1.3 试剂43-44
1.4 仪器44 2 方法44-48
2.1 形态学方法鉴定聚谷氨酸产生菌CC、DL、TW44-46
2.1.1 菌种保藏44-45
2.1.2 菌落形态观察45
2.1.3 菌体染色45
2.1.4 透射电镜观察45-46
2.1.5 扫描电镜观察46
2.2 分子生物学方法鉴定聚谷氨酸产生菌CC、DL、TW46-48
2.2.1 基因组提取及电泳检测46
2.2.2 16S rRNA的扩增和序列分析46
2.2.3 RiboPrinter系统全自动基因指纹鉴定46-47
2.2.4 质粒提取和序列分析47
2.2.5 产γ-PGA相关基因的鉴定与序列分析47-48 3 结果与分析48-60
3.1 形态学鉴定结果48-56
3.1.1 菌落形态48-49
3.1.2 菌体显微观察49-52
3.1.3 菌体透射电镜观察52-53
3.1.4 菌体扫描电镜观察53-56
3.2 分子水平的分类鉴定结果56-60
3.2.1 16S rDNA序列的测定及系统发育树构建56-57
3.2.2 核糖体分型鉴定结果57-58
3.2.3 质粒提取与序列分析58-59
3.2.4 capBCAE基因序列测定与比对59
3.2.5 ywtD基因序列测定与比对59-60 4 讨论60-64第三章 三株产聚谷氨酸菌的产物性质研究64-86 前言64-65 1 材料65-66
1.1 菌种65
1.2 培养基65-66
1.3 试剂66
1.4 仪器66 2 方法66-69
2.1 菌种活化66-67
2.2 菌种保藏67
2.3 发酵产物结构分析67
2.3.1 γ-PGA的分离纯化67
2.3.2 核磁共振分析67
2.3.3 红外色谱分析67
2.4 三株产聚谷氨酸菌的发酵参数测定67
2.4.1 三株产聚谷氨酸菌的生长曲线测定67
2.4.2 三株产聚谷氨酸菌的发酵pH曲线测定67
2.5 γ-PGA产量测定67-68
2.6 γ-PGA分子量测定68
2.6.1 三株γ-PGA产生菌的γ-PGA分子量测定(琼脂糖凝胶电泳法)68
2.6.2 三株γ-PGA产生菌的γ-PGA分子量测定(乌氏粘度计法)68
2.7 γ-PGA比旋光度测定68
2.8 γ-PGA絮凝活性测定68-69 3 结果与分析69-84
3.1 发酵产物结构分析69-73
3.1.1 核磁共振分析69-71
3.1.2 红外色谱分析71-73
3.2 三株产聚谷氨酸菌的发酵参数测定73-75
3.2.1 三株产聚谷氨酸菌的生长曲线测定结果73-74
3.2.2 三株产聚谷氨酸菌的发酵pH曲线测定结果74-75
3.3 三株产聚谷氨酸菌的γ-PGA产量测定结果75
3.4 γ-PGA分子量测定75-78
3.4.1 三株产聚谷氨酸菌的γ-PGA分子量测定(琼脂糖凝胶电泳法)75-76
3.4.2 三株产聚谷氨酸菌的γ-PGA分子量测定(乌氏粘度计法)76-77
3.4.3 三株产聚谷氨酸菌γ-PGA分子量变化77-78
3.5 三株产聚谷氨酸菌的γ-PGA比旋光度测定78-79
3.6 三株产聚谷氨酸菌的γ-PGA絮凝性能研究79-84
3.6.1 三株产聚谷氨酸菌的γ-PGA在水溶液中的絮凝性能79-80
3.6.2 三株产聚谷氨酸菌的γ-PGA在NaCl溶液中的絮凝性能80-81
3.6.3 γ-PGA分子量对絮凝活性的影响81-82
3.6.4 发酵菌株对絮凝活性的影响82-83
3.6.5 NaCl溶液对絮凝活性的影响83-84 4 讨论84-86第四章 Plackett-Burman设计与最陡爬坡实验优化枯草芽孢杆菌DL产γ-聚谷氨酸发酵培养基86-94 前言86 1 材料86-88
1.1 菌种86
1.2 培养基86-87
1.3 试剂87-88
1.4 仪器88 2 方法88-90
2.1 培养方法88
2.1.1 菌种保藏88
2.1.2 菌种活化88
2.1.3 种子培养88
2.1.4 发酵培养88
2.2 γ-PGA产量测定88-89
2.3 优化方法89-90
2.3.1 Plackett-Burman试验设计89
2.3.2 最陡爬坡试验设计89-90 3 结果与分析90-92
3.1 Plackett-Burman试验确定关键影响因素90-91
3.2 最陡爬坡实验91-92 4 结论92-94第五章 枯草芽孢杆菌DL产γ-聚谷氨酸固态培养发酵优化94-103 前言94 1 材料94-96
1.1 菌种94
1.2 培养基94-95
1.3 试剂95
1.4 仪器95-96 2 方法96-97
2.1 γ-PGA的固体发酵(黄豆培养法)96
2.2 γ-PGA的固体发酵(豆粕粉培养法)96
2.3 γ-PGA的分离回收96
2.4 γ-PGA产率测定96-97 3 结果与分析97-100
3.1 黄豆培养法97-98
3.2 豆粕粉培养法98-100
3.2.1 谷氨酸钠添加量对γ-PGA的产率影响98-99
3.2.2 麦芽糖添加量对γ-PGA产率的影响99-100 4 讨论100-103第六章 枯草芽孢杆菌TW的基因改造初探103-115 前言103 1 材料103-105
1.1 菌株与质粒103-104
1.1.1 菌株103-104
1.1.2 质粒104
1.2 培养基104
1.3 酶及试剂盒104
1.4 仪器104-105 2 实验方法105-110
2.1 TW菌株的活化105
2.2 菌株TW基因组DNA的提取105
2.3 筛选基因kan的确定105
2.4 构建pUC19-kan重组质粒105-106
2.5 构建pUC19-kan-ywtD-R重组质粒106-108
2.6 构建pUC19-kan-ywtD-R-L重组质粒108-109
2.7 CaCl_2法转化枯草芽孢杆菌TW109
2.8 电击转化枯草芽孢杆菌TW109-110 3 结果与分析110-113
3.1 菌株TW卡那霉素抗性检测110
3.2 卡那霉素抗性基因制备与连接110-111
3.3 ywtD基因同源右臂制备连接与鉴定111-112
3.4 ywtD基因同源左臂制备连接与鉴定112-113 4 讨论113-115附录115-133参考文献133-147致谢147
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