有关天根细菌基因组DNA提取试剂盒中第二步革兰氏阳性放线菌菌的问题

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2015-01-23 14:11 标签： 革兰氏阳性短杆菌
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细菌基因组DNA提取试剂盒溶液型
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联系人：戴辉&&公司：北京艾比根生物 技术有限公司
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关键词：细菌,基因组,提取
您好，我在易生物网站 看到贵公司的产品信息，请问…
产品名称：细菌基因组DNA提取试剂盒溶液型
产品关键词：细菌,基因组,提取
目录号：AB107
v适用范围：
适用于快速提取各种细菌基因组DNA
v试剂盒组成、储存、稳定性：
本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果
1.环境温度低时细胞核裂解液中某些去污剂成份会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，轻轻旋摇，即可恢复澄清。
2.蛋白沉淀液可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，如果不能完全溶解，也不影响使用效果，直接取用上层溶液即可。
3.避免试剂长时间暴露于空气中pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
1.用户需自备异丙醇、70％乙醇、0.5M EDTA和Lysozyme（溶菌酶）(用于革兰氏阳性菌)、lysostaphin(用于某些难裂解的革兰氏阳性菌)、水浴箱。
2.开始实验前将需要的水浴先预热好备用。
v操作步骤：（实验前请先阅读注意事项）
1.收集1毫升过夜培养细菌加入1.5毫升离心管。
2.9,000rpm离心30秒，使细胞沉淀下来，弃上清，涡旋或轻弹打散细胞沉淀。对革兰氏阳性菌，接步骤3。对革兰氏阴性菌，直接接步骤6。
3.加入480&l 50mM EDTA完全重悬细胞。
4.加入120&l溶菌酶 (20mg/ml in 10 mM Tris-HCl，pH 8.0)，混匀。
对于大部分的革兰氏阳性菌如Bacillus subtilis，Micrococcus luteus，Arthrobacter luteus，Nocardia otitidiscaviarum，Rhodococcus rhodochrous和Brevibacterium albidium，使用溶菌酶就可以有效裂解。但是对于某些种类的Staphylococcus，则应该加入60&l溶菌酶(20mg/ml)和60&l lysostaphin (20mg/ml)确保有效裂解。
5.37℃温育30-60分钟。12,000rpm离心2分钟，弃上清，涡旋或轻弹打散细胞沉淀。
6.加入600&l细胞核裂解液至打散的细胞，轻柔吹打裂解细胞。
7.80℃温育5分钟裂解细胞，然后冷却至室温。
8.加入1.8&l RNase A（10mg/ml）至裂解物中至终浓度30&g/ml。颠倒混匀后37℃温育15-60分钟去除残留RNA。然后室温冷却至少5分钟使回复到室温。
9.在回复到室温的裂解物内加入200&l蛋白沉淀液后，在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀25秒。混匀后可能见到一些小的蛋白团块。冰浴5分钟。
由于样品体积重量小，用涡旋振荡器振荡混匀产生的剪切力并不会剪切打断基因组DNA。如果用手振荡混匀，则不可以用手上下剧烈振荡混匀，只能适当力度振荡混匀，否则会剪断基因组DNA；但是力度也不能小，要保证充分混匀，将粘稠的裂解物打散开，否则DNA无法和蛋白质沉淀分离开，离心的时候会和蛋白质一起沉淀下来，造成DNA丢失或者降低产量。此外混匀不充分也可能造成蛋白沉淀不充分， 最后的产物污染有较大量的蛋白质。因此建议用涡旋振荡器。
10.13,000rpm离心5分钟。这时候应该可以见到管底白色的蛋白沉淀，也可能见到一些蛋白沉淀漂浮在液体表面。
11.小心吸取上清到一个新的1.5ml离心管中。
吸取上清时小心不要吸到管底的和漂浮在液体表面的蛋白沉淀，如果不小心将蛋白沉淀转入新的离心管中，可再次离心2分钟后取上清。
12.加入等体积的室温异丙醇（约600&l），轻柔颠倒30次混匀或者直到出现棉絮状（丝状）白色DNA沉淀。
注意有时候棉絮状（丝状）DNA颠倒混匀的时候，粘附着在盖子或者管口处，即使颠倒也不跟下来，这样导致操作者看不到沉淀，误认为没有得到DNA。解决办法是略去步骤13，直接12,000rpm离心1分钟，弃上清，然后接步骤15。
13.垂直放置离心管，让白色DNA沉淀自然沉到管底，然后尽可能多的吸弃大部分的上清，注意不要吸到沉淀。
14.加入1ml 70％乙醇后，颠倒漂洗DNA沉淀，12,000rpm离心1分钟，在管底可以见到白色的DNA沉淀块，倒弃上清。
15.加入0.5ml70％乙醇，颠倒几次漂洗DNA沉淀，12,000rpm离心1分钟，倒去上清（注意不要把DNA沉淀倒掉了），倒置后在吸水纸上轻敲几下以控干残留乙醇，还可以用枪头小心吸掉管底沉淀周围和管壁的残留乙醇，空气晾干沉淀几分钟。
注意不要干燥过头，否则DNA极其难溶；也不能残留太多乙醇，否则乙醇可能抑制下游如酶切反应。
16.加入100&lDNA溶解液重新水化溶解DNA沉淀，轻弹管壁混匀，可以放置在65℃温育30-60分钟（不要超过一小时），中间不时的轻弹管壁帮助重新水化DNA。也可以在室温或者4℃放置过夜来重新水化DNA，中间不时颠倒轻弹帮助溶解。
17.DNA可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在－20℃。
产品信息：细菌基因组DNA提取试剂盒溶液型(细菌,基因组,提取)品牌|性能参数|价格|报价|使用说明
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