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三分管人七分做人
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管人的艺术是带领团队做事的艺术，而做人的艺术则是修炼自身，提高自己影响力和领导力的重要前提。所以，要成为一个成功的领导者，唯有两者兼而有之。对于下属来讲，领导者的做人之道、管人之法，也是他们最为瞩目的两大焦点。
管理的本质就是以人为本。领导者要想做好管理，在管人之前就要先学会做人，一切要先从自我的修炼与提高开始。康熙说：“江山之固，在德不在险。”要想得天下，要想巩固天下，就要以德服人。领导者的人格魅力得到提升，自然会引发下属的认可与追随，许多管理卜的问题也就迎刃而解。
管理之难莫过于管人，管人之难莫过于管心。所以，身为领导者的第一要务就是：要吃透人际关系学，这样才能成为一个名副其实的领导。
成杰，巨海教育集团总裁，亚洲顶级实战名师，华人演说领导力权威，华人执行力第一导师，上海安徽商会副会长，上海统帅装饰高级顾问。他，是一位实战派的管理咨询专家!历时八年的时间他亲自拜访了上百位顶尖成功企业家，并先后在120多个城市巡回演讲。培训辅导过1260多家企业，演讲超过7680场，听众百万人次之多。他，是一位极具使命感的企业家!他立志用毕生的间与精力捐建101所巨海希望小学。他，是一位百万畅销书的魔法师!他出版了二十本超级畅销书，累计发行量超过120万册。他，是中国企业内训第一品牌课程的缔造者！他创办的课程《如何从优秀到卓越》现已培训辅导过890多家企业。品牌课程：《总裁三项修炼》、《总裁演说大师班》、《帝王领导力》。品牌内训：《如何从优秀到卓越》、《打造商界特种部队》。
做人的艺术，是每一个善于领导他人的人都必须要修炼的，因为其中包含着其全面的素质口能力。
――茵科尔
某种程度上讲，做企业就是在做人。
――柳传志
道德常常能填补智慧的缺陷，而智慧永远填补不了道德的缺陷。
经营企业就是要经营人，经营人首先要尊重人。
――张瑞敏
序言第一章
地低成海，人低成王――低调是做人的大智慧控制好自己的情绪高调做事，低调做人做人要谦虚谨慎学会倾听是有效沟通的关键赞扬是有效的激励方式迂回前进，曲折说服有话拿到桌面上说在背后赞美他人效果更佳退一步海阔天空兼虚谨慎，锋芒内敛有本事不自夸学会克制自己的情绪坦诚地检讨自己勇敢面对错误任何人都不喜欢被否定保持平和的心态说话要照顾到他人的面子……第二章
没有规矩无以成方圆――做人应讲原则第三章
智者顺时而谋――聪明人伺机而动第四章
心思缜密，人情练达――与上司进行有效沟通第五章
善结人缘，广积人脉――人脉圈是成事的关键第六章
以身作则，以德服人――打造金牌团队
斗转星移，我们不能控制；股市走向，我们不能控制。唯一能控制的
只有我们自己，只有控制了自己，把握好自己的情绪，才能掌握好自己的命
运。无数的事实证明了这点。
作为企业家导师的我，时常会告戒企业家：“一个人把握自己的内心，
胜过于把握这个世界。”《三国演义》中的刘备，因为被东吴夺取了荆州，
杀害了他的结拜兄弟关羽，一怒之下发动了对东吴的战争，战将百员，御驾
亲征。东吴面临十分严峻的形势。孙权起用陆逊为大都督，抵御刘备。陆逊
以柔克刚，后发制人，火烧蜀军营盘700里，刘备70余万人马被杀得大败而
归，如果刘备能控制好自己的情绪，结果可能就不会这样了。这就说明调节
情绪，不仅对我们的事业，而且对我们的人生都是非常重要的。
《孙子兵法》上说，“主不可以怒而兴师，将不可以愠而致战”。这只
是一个方面，人的喜、怒、哀、乐的情绪交替变幻，都有一定的限度。现代
人生活紧张忙碌，每天都要面对纷繁复杂的人和事。面对这些不同的人和事
件，必须不急不火，保持一颗“平常心”。
我们要在内心深处为自己保留一处安静而独立的空间。既不要为外界
的各种刺激和得失所干扰，又要进行适当的情绪调节，不要让自己的情绪
波动过大。
一个随意让情绪“喷”出来而不能自控的人，一定是与成大事无缘
的，因为缺乏自制和忍耐的性格，让自己的生活极为可怕。成功学鼻祖拿破
仑?希尔从一个十分普通的事件中发现了这个道理，这个发现也使他获得了
一生当中最重要的一次教训。
一天，拿破仑?希尔和办公室大楼的管理员发生了一场误会。这场误会
导致了他们两人之间彼此憎恨，甚至演变成激烈的敌对状态。这位管理员为
了显示他对拿破仑?希尔一个人在办公室工作的不满，就把大楼的电灯全部
关掉。这种情形一连发生了几次，有一天，拿破仑?希尔到书房里准备一篇
预备在第二天晚上发表的演讲稿，当他刚刚在书桌前坐好时，电灯熄灭了。
拿破仑?希尔立刻跳起来，奔向大楼地下室，他知道可以在那儿找到这
位管理员。当拿破仑?希尔到那儿时，发现管理员正在忙着把煤炭一铲一铲
地送进锅炉内，同时一面吹着口哨，仿佛什么事情都未发生似的。
拿破仑?希尔立刻对他破口大骂，一连5分钟之久，他都以比管理员正
在照顾的那个锅炉内的火更热辣辣的词句对他痛骂。最后，拿破仑?希尔实
在想不出什么骂人的词了，只好放慢了速度。这时候，管理员直起身体，
转过头来，脸上露出开朗的微笑，并以一种充满镇静与自制的声调说道：
“呀，你今天早上有点儿激动吧，不是吗？”
他的话就像一把锐利的短剑，一下子刺进拿破仑?希尔的身体。想想
看，拿破仑?希尔那时候会是什么感觉。站在拿破仑?希尔面前的是一位文
盲，他既不会写也不会读，但他却在这场战斗中打败了自己，更何况这场战
斗的场地，以及武器，都是自己所挑选的。
拿破仑?希尔的良心受到了谴责。他知道，他不仅被打败了，而且更
糟糕的是，他是主动的，又是错误的一方，这一切只会增加他的羞辱。拿破
仑?希尔又一次来到地下室，把那位管理员叫到门边，管理员以平静、温和
的声音问道：“你这一次想要干什么？”
拿破仑?希尔告诉他：“我是回来为我的行为道歉的――如果你愿意接
受的话。”管理员脸上又露出那种微笑，他说：“凭着上帝的爱心，你用不
着向我道歉。除了这四堵墙，以及你和我之外，并没有人听见你刚才所说的
话。我不会把它说出去的，我知道你也不会说出去的，因此，我们不如把此
事忘了吧。”
拿破仑?希尔向他走过去，抓住他的手，使劲地握着。拿破仑?希尔不
仅是用手和他握手，更是用心和他握手，在走回办公室的途中，拿破仑?希
尔感到心情十分愉快，因为他终于鼓起勇气，化解了自己做错了的事。
此后，拿破仑?希尔下定了决心，以后绝不再失去自制。因为一失去
自制以后，另一个人――不管是一名目不识丁的管理员，还是有教养的绅
士――都能轻易地将自己打败。
在下定这个决心之后，希尔身上立刻发生了显著的变化，他的笔开始发
挥出更大的力量，他所说的话更具分量。他结交了更多的朋友，敌人也相对
减少了很多。这件事成为拿破仑?希尔一生当中最重要的一个转折点。拿破
仑?希尔说：“这件事教导我，一个人除非先控制了自己，否则他将无法控
制别人。它也使我明白了这两句话的真正意义：‘上帝要毁灭一个人，必先
使他疯狂。’”
情绪的控制，对于一位管理者来说更是一项非常重要的品质修炼。它不
仅仅影响到管理者自身的身心健康，更会左右团队的气氛，并最终影响到公
司的利益。所以，当你生气的时候，记得照照镜子，那有可能是世界上最难
看的脸了，要记得笑一笑，好让别人喜欢你，不要保持怒发冲冠的样子；狂
喜的时候，别得意忘形、乐极生悲，要知道物极必反的道理；当你为自己悲
哀难过的时候，看看比你还悲惨的人，或许他们能激起你善良的同情，在帮
助他们的过程中忘却自己的痛苦；当你遭遇人生难以避免的苦难时，那就坦
然地面对它，最坏不过如此了，正视它，或许好运就在前面等你呢。
在过去八年的时间里，我先后在120多个城市巡回演讲，培训辅
导过890家企业，其中包括18家上市公司，期间还出版了26本畅销
书，并与上百位顶尖的企业家进行过面对面的沟通交流。在从事企
业管理咨询和演讲培训的经历中，我最后总结出一条心得：“小老板做
事，大老板做人；小老板管事，大老板管人”。
管理的本质到底是什么？是以人为本――管理的对象是人，确切
地说是人心。成功者之所以成功，在于做人的成功：失败者之所以失
败，在于做人的失败。正如《世说新语?笺疏》中所言：“小胜靠智，
大胜靠德”。
作为管理者来讲，如果你想取得大的成功，仅仅把事情做好是远
远不够的，还需要你会做人，做一个高尚的人，做一个有魅力的人，
做一个有影响力的人。华人首富李嘉诚先生说：“事业的成功其实就是
做人的成功，而做人的关键在于――对人好”。这也恰恰是我们巨海
的用人准则。
管人的艺术是带领团队做人做事的艺术，而做人的艺术则是修
炼自身，提升自己影响力和领导力的重要前提。领导力决定一切！所
以，要成为一个卓越的领导者，如何做人就不是一个可有可无的小问
题，而是关系到其自身是否能有效地开展工作的大问题。有些领导并
不重视做人之道，误以为自己总是高人一等，可以用命令代替一切，
结果是可想而知的。下属无法信任那些品格有明显瑕疵的领导，更不
会长久追随这样的领导。没有下属和你一起打拼，就算你有全世界最
伟大的理想和最完美的计划，也是孤掌难鸣。
团结人，才能做大事。善于做人的领导，以赢得人心为第一；善
于管人的领导，以全听指挥为第一。两者兼而有之，方可成为最高明
的领导。归根结底，领导的第一项任务就是：要与人打交道，就要吃
透人际关系学，这样才能成为一个名副其实的领导。对于下属来讲，
领导的做人之道、管人之术，也是他们最为瞩目的两大焦点。毛泽东
说过，“领导嘛，就两件事，一是用好了人，二是出好了主意”。其中
包含的无非就是管人和做人两件事。可见，成为卓越领导者也就是这
两者的集合。
总而言之，管理是一项具有挑战性的工作，它应用的范畴十分
的广泛，大到国家，小到一个家庭，各个领域都不能忽视它的存在。
它不仅是领导者的个人素质的体现，更能将团体中每个成员的素质淋
漓尽致地表现出来，每个人都在这个团体中起着不可估量的作用，如
果你渴望成为人上人，如果你想让自己的管理渐渐步入正轨，想让自
己苦心经营的企业每天都有所进步，想让你公司的员工每天都精力充
沛的全身心地投入到工作中去，这就取决于你的管理，决定于你的领
导。所谓“管人先做人”，一个领导者要想做好管理，必须要先从自
我的修炼与提高开始，这样才能“内圣而外王，修己方可安人”，带
出一流的团队！
做人的艺术，是每一个善于领导他人的人都必须要修炼的，因为其中包含着其全面的素质口能力。
――茵科尔
某种程度上讲，做企业就是在做人。
――柳传志
道德常常能填补智慧的缺陷，而智慧永远填补不了道德的缺陷。
经营企业就是要经营人，经营人首先要尊重人。
――张瑞敏
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基因表达之RT-PCR之我见 [转自“丁香园论坛”]
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在论坛上看到不停地有人在问RT-PCR的问题，实际上在以前的帖子中各位香主和eeflying（我为什么总是提他们？因为还是很佩服的哦，生怕自己说错了，被他们指出来哦）都谈到了很多，鄙人也充大头答了一些问题，但是还是有各种问题，由于的基因表达还有点实战经验（但也技止此而），所以想些点东西给大家参考，计划把包括RNA酶保护分析，northernblot，原位杂交，半定量RT-PCR和定量RT-PCR都写了，但是实在时间不够，我从来不写综述的，写这么多还是头一次，声明一下，全部文字均为原创（当然如有雷同，那就是纯属巧合了），各位如要引用，请来信告知，最好著注明来自丁香园，实际上国外现在引用网站内容以成为常见的事情了，nature和science都有引用网站的，以后大家的文章的引用的是丁香圆，该有多爽。本文不谈具体protocol，是因为各种书籍和kit说明书上都有，主要说一些原则，而且大部分是失败和成功的经验，还有我们小组的讨论结果，以及各种书里七零八落看的内容，泣血力作，希望对大家有用。
基因表达的定义：每当说到基因表达，我自己都觉得不知所云，是指RNA，还是蛋白？是指mRNA还是包括风头正旺的非编码RNA？mRNA还有不翻译的RNA呢。应该说转录水平指的是RNA水平，而蛋白应该叫翻译水平？我们这里就特指编码蛋白的mRNA的量的检测吧！
方法：很多很多，我们常用的也就是RT-PCR和northern（实际上我也只知道他们，丢人啊），但是RNA没保护分析在国外很常用，也有半定量的功能，一次性试剂盒还能以此将一个表达簇一起分析，例如NFkB的转录激活谱中的8个常见基因。至于dot blot和原位杂交之流则实属于吃力不讨好，不知所云，骗人玩玩的啦，dot blot的最大贡献是发展到了反向dot blot的顶峰――曾经无限时髦的基因芯片，而原位杂交的放大效应和它的假阳性使它的定量（半定量，应该)根本算不上定量(至于图象分析一般是给自己“找一个理由先”)，用它定位和用蛋白定位的意义不可同日而语，又难做，只有新发现的基因可以在没有得到蛋白和抗体的情况下进行组织或者细胞定位。
先谈谈RT-PCR吧 (以后再写别的可不是为了骗分，斑竹大可把他们算作一篇），主要时间和打字问题，实际上很多丁香园中已经有了，我就看到的，不过在看之前我很多都是知道的哦(吐)，可不是“剪刀浆糊派”的。我先写提纲，以后每天往里加点内容，可否？关于原位杂交和dot blot大家可以和我论战的，我曾经看到一篇公开发表的文章（还有sci分呢，嘿嘿）把dot blot称为定量检测，是极端错误的（偶很少用这样的字眼）。
1、模板均一性问题：愚见采用从RNA定量的方法似不妥，不要说PCR的本身的敏感度，即便是在反转录就有差异，到了cDNA的分装和用于模板的取样，这些都不能保证准确，当然在反转录阶段我们也经常控制在1或5ug，但这是为了再将来加样的时候保证大致差不多，而且尽可能地利用反转录酶，而且RNA定量本身即使用电泳也不是那么准，更不要说风光光度计，这里说一下，我曾经看到有人说用分光光度计定量，这也不是很准确，分光光度计只是掌握大概，当然用于反转录足够了，但是用于rt－pcr的定量这是不正确的，很不准的，RNA也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较不同标本之间就更不准了。
2、RNA制备：略。什么手套、DEPC、干烤、沉淀等等书里和各个帖子里都有。一般制备总RNA 即可，有时需要制备mRNA，个人认为初学者还是选择Trizol，大量制备采用传统的方法自己配，实际上和trozol一样的，有时效果还好，trizaol也就是混一混，但是优点在于质量保证，使用方便，效率高，根据不同组织用trizol一般可以提到全部RNA的50％（别小看，这已经很高了）以上，有些可以到达80％。mRNA用Qiagen的柱子，别去自己做Oligo(dT)柱，太麻烦。是否用DNAseI根据基因的特点和引物的设计，能够跨内含子的就不需要处理，处理还是很危险的哦。像这样的微量和也用不了多少次的实验，并且如果牵涉到样品是无价之宝的时候，因该选好的进口试剂。废话几句，在另一个论坛上看到一贴谈到RNA的贮存，因为没有登陆在那里也不能说，可能对大家有启发，在这里说一下，实际上主要是温度，至于放在TRIZOL中是不可取的，更不要说在胍里了，只－20是不够的，至少－80，液氮最保险，想想，在低温里，即使加上些RNA酶它也降解不了哇！qiagen出了一种easy产品可用于保存标本，但在常温也只是1天，所以低温才是首要的，抽的时候也是这样。
3、反转录：常规，取样尽量一致，如上所述，不是为了定量，是为了半定量PCR时图形的好看。选择逆转录酶根据实验需要，少量的可用Promega的一种1ug的酶，多的我们用invitrgen的5ug的II，当然有人说Promega和Roche的也不错，用过，的确可以，要不Invitrogen不像当初Gibco时那么牛了，也降价打折了。反转录成功后就不必太小心了，放在那里都可以，想想你还曾经72度灭活呢，是不是？要知道，杂合双链比DNA双链还稳定的。另外把回答的一封信粘上：一般来说要扩增从反转录到PCR全过程的长达2kb以上的片断是相当困难的事（我瞎掰的）,很多长基因是通过随机引物库得到的而不是通过oligo (Td)得到的,不要说反转录,即使是PCR也是很困难的,不信可以从质粒里试试,至于反转录,就更是天方夜谭了,除了酶的效率等,还有RNA的二级结构等因素,当然,霸王硬上弓未尝不可,这就要一些大公司的特殊的名贵的效果也未必好的酶了,Ｒoche和Invitrogen都有的.听天由命吧，不过，即使××，未必成功。
4、半定量RT-PCR：重点，为什么是第4条? 首先说明一下，半定量PCR，我是指基于凝胶成像分析的，定量PCR指实时PCR。
&&实验设计：根据不同的实验，对于不同的基因要有不同的策略，还有不同的组织，选择不同的基因的转录本，选择不同的看家基因，都各自不同，对于文献不可照抄。
&&引物：除了常规引物设计原则，这在各种书籍上都有的，在园里各位主任像yong啊eeflying啊什么的也说了很多了，eeflying的有图的那一贴偶是看不懂得，什么时候解释解释。此处不谈。我看过最好的是郑仲承写的一篇综述，丁香圆贴过，经典啊，这一辈子是赶不上了，自己真是井底之蛙，还在狂叫不止。对于RT－PCR重要的是引物的位置，有两种方法，一种是上下游引物设计在跨内含子的两个外显子的3’端和下一个外显子的5’端，这样不会在基因组上扩出来。第二种是我最喜欢的，设计在两个离得远的外显子上，这样从基因组和cDNA上得到得不一样，可以一引两用，^_^。以上原则对单外显子基因不使用，这是最好选择DNAaseI处理。另外，我们有一个好习惯（嘿嘿，偶已经打了一把伞），就是把退火温度设计成一样的，这样每次做的时候不用“三查七对”，从冰箱里拿出就坐。另外3'最后一个碱基是很重要的。
昨天看到有人问5‘端得问题，本来以为这是大家都知道的，也在这里顺便说说，表达水平检测和开放读框没有关系，PCR的位置不需要在读框里，相反3’非翻译区反而同源性最低。而且如果用的是oligo( dT)，用3端更保险再说一句，（真烦啊，是不是），我从不用软件，全靠两只眼睛看，每每用一个上午，想想还有基因组呢，只看得两眼昏花。设计好以后，最好在查一下有没有同源序列，尤其是一个家族的基因。
[ 本帖最后由 王六六 于
09:02 编辑 ]
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关于mRNA和蛋白的一致性，yong在一篇论战的帖子里都谈了，狗尾续貂一下，mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响，当然还有蛋白的剪切和分解速度等等，但是表达水平一般来说可以大致估计一种基因的翻译产物的，有时。但二者不能混委一谈。
基因组问题：如上所述，可以不用处理基因组的。但是如果是单外显子呢？曾经有以为朋友问我，她的样品中总是有基因组的污染，用RNA去p总能P出来。她先用trizol过两遍，再用qiagen的猪过两遍（我只看到美元和一江春水向东流），吓，还能P出来。这是很多人碰到的问题，问题的关键是（已经没有什么存货了，知无不言了，归来却空空的囊）..........TAQ（除了具有DNA指导的）还有RNA指导的DNA聚合酶功能，所以是可以直接从RNA中P出来的！那就冒险让RNA高温一下吧，只是DNAase处理时一定小心，买大公司的，保险一些，至少也应该是takara的，买液体做好的，不要自己配，比起标本来，这时候银子已经退居其次了。
&&长度：这和eeflying意见相左啊，大家别信我的。我们认为500之内比较好，不受中间可能出现的各种序列和二级结构的影响。至于eeflying说的跑的在前会弥散则可以用2％的胶就行了。我一般是250(真形象)左右。目的基因和内参照之间的大小比例可以根据爱好和胶的浓度、分辨率调整的。如果是250，则相差100bp很好，如果4、500则差个200bp也可以。
内参照：看家本事来了（狂吐先～，嗯，好点了），（这是回答maria的帖子）一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的，实际上，半定量RT－PCR本身就是不可信的，大部分，我想，不过我做的是可信的（不让人活了，痉挛了），因为我反复摸，每次作，重复做，跟自己对照，用不同的酶，不同的体系，作出同样的结果，指的是基因表达结果，不是条带什么的。
不管多少样品，内参不作，等于说比较珠穆朗玛峰和泰山的高度一样，没有海拔，泰山从地面的高度和珠穆朗玛峰从青藏高原的高度没什么差别。PCR一定要同时作，但是电泳可以不一起跑，没有关系，记住，计算的是相对表达程度，再说一遍我的观点：1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，不过我的可以（苦胆吐出).3、半定量RT-PCR应该在两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度一致，目的扩增区域的GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和Taq酶。
解释一下：1、同一管中不是不可以，因为它有条件现同的优点，只要目的基因的扩增量和选择的不同循环数的内参照基因的最终扩增产量大致相同就很好，很拗口吧。但是一管中的竞争抑制实在是大问题，即使对照组一致了，咱做的是差异，总有不一致的，而且PCR的放大效应会把芝麻P成西瓜的哦。在不同管中重要的模板的平均分配，这不用多说了把。2、相对和准确的问题，PCR的相对定量是因为引入了内参照，所以没有绝对定量一说，至于半定量和定量的区别不是相对和绝对的区别，而是准确和不准确的区别。一般经常搞错的定量半定量和绝对量相对量的概念,定量半定量是指检测准确度,而绝对量相对量是指基因在组织中的表达丰度,例如Northen虽然不是很准(Northern不是很好的金标准),主要是上样量的原因,不管使用28s18s定还是用SB GAPDH或者β-actin都是,但是Northern得出的是绝对组织丰度,而实时荧光定量RT-PCR虽然准确(定量)但是得出的是相对表达丰度,不管使用β-actin还是用18srRNA.至于常规的通过跑电泳的所谓”定量”RT-PCR那就远了去了。
另外，似乎有人认为要做的好，就要把条件摸得哈好的，一旦很好，就不更改，PCR条件，徨论Taq酶，窃以为实不足取，为何？我说的“摸”是指循环数和模板，如果连taq也要固定下来，其不是别人重复不了了（了用的太多了）？因为检测的是相对量（反复强调），所以理论上在PCR过程和成像过程（后文）只要在线性期，结果应该是差不多的,为什么不说一样是应为即使在线性期也是有差异的，大家看看文后的我们做的定量PCR的图就知道了，在每个点的切线的斜率是不同的。
关于选择什么作为内参照的问题，实际上没有定论，个人认为，18s优于actin，不要跟我说GAPDH，著
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综合上面两点，说说下面一点：一般摸出来的结果是什么呢？个人认为，再使用1ugRNA反转录后用2－4ul为模板和使用5ug反转录用1－2ul为模板的情况下，一般目的基因很少超过30循环，著名的β－actin很少超过25循环，如果你看到有人用actin和sb GAPDH超过28－30循环的话，结果是不可信的，实际上即使超过25循环也是值得商榷的，肯定再RNA或者cDNA的步骤有问题，此时因该增加模板量，而不是增加循环数，即使目的基因要用30以上也要考虑一下。对于想脾脏这样的组织，actin甚至可能要低于20循环，实际上在后文谈到的凝胶成像仪的检测范围之内，应该循环数越少越好。还是那句话，并不是在指数期就可以的。
提示：另外，不是很亮（跑电泳时）并不代表没有到平台期，再看看我们的做的定量PCR的图就明白了，有些基因的平台期是达不到很高的（这不是因为荧光标记得影响），要看你摸的时候不同循环的扩增产物的量之间的关系，在相邻之间的差异基本复合线性增长才是线性期。
一步法还是二步法:我一直不建议采用一步法，因为逆转录酶很贵，就坐一次PCR，多可惜啊！还有RNA。而且反转录了之后可以做10－20次，还可以摸条件找原因。不要以为一步法是盒子，实际上是一样的，操作没有什么不同，还没办法摸条件，早该淘汰了（特指RT-PCR过程中）。对于少量的标本用1ug的反转录酶既可以了，或者用于预实验都是很好的，但是P的时候要多加一点，之所以这些话总是不确定是因为还和你正在做的基因的风度有关。
&&关于凝胶成像分析：这是常人所未想的问题（晕倒一片），一般来说基于CCD的成像系统也有这个问题，这就是CDD本身的工作原理和软件的质量，有的CCD是重复扫描的，有的软件是只有256灰阶的，所以要注意上样量不要太多，当然也不要太少（以防看不到），否则会超出扫描CCD和软件的分析范围，这和PCR到线性期就没有什么不同了。另外很多软件有手动调节，这样的软件使用时要保持每次框起来的范围的大小的一致性，不要造成太多的人为误差，号召大家不要任意修改数据。此外，紫外灯管的质量、光的强度、均一性和CCD距离、焦距、分辨率都要注意。如果有钱买冷CCD当然最好了，不过其实一般用不着。实在不行的，拍了照再扫描再用photoshop分析也未尝不可，但是那可是很不准的，中间不周太多，而且如果是热敏打印机很容易亮度饱和的，不一定会有灰阶。
&&PCR反应：略（我倒，该说的倒不说了，早被各位高手说完了）。常规PCR什么的，实际上Mg2+什么的没有那么重要的，退火温度什么也没有什么的。哦，对了别忘了两对引物的退火温度相同哦，即使在两管中也要这样，因为在一台PCR仪上，如果在一管中，还要考虑4条引物之间不互补。
复孔的问题：今天你复了么？我想大部分人没有想到吧（菜叶鸡蛋狂飞），其实用这个办法很容易解决一些判断问题，作三个复孔很好，这在定量PCR常用对吧?但是如上文所属，如果模板足够多，这步可以省去去的。我就不用就很好（嘿，别用鞋啊）。
定量PCR：（差不多了，看看反应先）其关键在于准确和起始模板可以微量，但也只是相对定量，特指RT-PCR，这里不讨论根据标准曲线检测基因啊病毒啊什么的绝对值。为什么是准确的相对定量，我再废话一会again，是指你不知道你的模板来源是多少，所以才用GP内参，话说回来，及时你知道多少个细胞，还有细胞生死的问题对不？这就是为什么说northern是不很准确（没有定量PCR准确）的绝对定量，是因为northern的模板多，综合分光光度计和28s/18s更复合实际情况些（好像不能自圆其说，似乎也是相对定量），尤其是在不同组织分布的研究中更有效。
1、&&原理：那位高手补充？或者大家可以看看园里几个广告贴，是PE的吧，虽然着于痕迹，但是写的还是可以的，反正就这样的原理，毕竟，PE是定量PCR的鼻祖，而且型号也一直在推陈出新。只是写广告不要太着于痕迹。如上文所说，文献和说明书中能查到的东西俺就少说了，多说些心得。bio－rad和roche的也是很强的，各有优势，大家还是比一比，价格、功能、性能、服务，尤其是技术支持，有些公司的技术支持强可以帮我们很多忙的。还有最近基因公司也有一种新的不错的。
2、&&Taqman：常见原则，方法简单，原理易懂，结果可靠。同管不同管和上面一样的，只是还多了问你的仪器有没有双波长检测滤镜，而且双波长有时在一管中也哟影响。
3、&&仪器选择：我也不知该不该写。 泻泻吧。PMT和CCD各有千秋，不要听信一家之言。能兼容96孔板和普通PCR管的最好，96控板便宜而且一致性较好，至于边缘效应实际上没有那么明显得，只要做个对照就明白了。最好能兼容各种方法、试剂和耗材的，以防后“费”无穷。速度不重要，但是其中一架公司的变性时间短也是不容小觑的优势，对整个实验速度还有TAQ酶的影响小，当然没有也没大关系，毕竟taq现在都很好。（真难写）
4、&&结果分析：要注意不同的探针的标记效率，分开设域值线还是放在一起要根据实际情况，即目的基因和参照基因的CT值的差距，CT（还是T，很想CS嘛）的倍数也可以改的。
总结一句，（我最在行的）半定量RT-PCR一般来说基本上是（怎么显示不出）g p。
[ 本帖最后由 王六六 于
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以下均为丁香园网友的回复：
你有关内参照的疑问，具我所知， 利用细胞中表达较恒定的B-ACTINMRNA作为内参照标准，其不足之处在于人为PCR过程中，目的基因和内参照基因使用完全不同的引物对，由于扩增效率的差异会影响定量的准确性。较为理想的是以CRNA为内参照，因为他是用同一对引物扩增目的基因和内参照RNA，但此法由于扩增片段长度相等，所以必须分开进行反应，否则无法用凝胶电泳区分扩增产物。以B-ACTIN为内参的定量RT-PCR 和以 CRNA为内参的定量RT-PCR的操作步骤基本相同，只是以 CRNA为内参的定量RT-PCR需有体外反应生成CRNA这一步，并且由于内参照的不同从而导致需要设计不同的引物。
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你有关内参照的疑问，具我所知， 利用细胞中表达较恒定的B-ACTINMRNA作为内参照标准，其不足之处在于人为PCR过程中，目的基因和内参照基因使用完全不同的引物对，由于扩增效率的差异会影响定量的准确性。较为理想的是以CRNA为内参照，因为他是用同一对引物扩增目的基因和内参照RNA，但此法由于扩增片段长度相等，所以必须分开进行反应，否则无法用凝胶电泳区分扩增产物。以B-ACTIN为内参的定量RT-PCR 和以 CRNA为内参的定量RT-PCR的操作步骤基本相同，只是以 CRNA为内参的定量RT-PCR需有体外反应生成CRNA这一步，并且由于内参照的不同从而导致需要设计不同的引物。
[ 本帖最后由 王六六 于
08:59 编辑 ]
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只是一些体会想和大家分享, 之所以没有再写，是因为实在是技止此而，像引物的软件设计的观点，现在看来，原文写的武断了，还是需要软件的，不改原文了，当作反面教材。
很长时间没做了，最近又要作一些，才想起还有更多的问题，写在这里希望对大家有帮助。主要是关于同管和分管的问题，同管的弊端已经说得很详细了，分管固然可以避免竞争问题，但是只有对于定量PCR可以保证完全的准确（在平均分配模板的基础上），对于基于凝胶电泳的半定量方法就有存在上样量的问题，所以还是有这么一个重大的系统误差存在。毕竟实时PCR不是每个单位能作的，所以怎么解决这个问题看来只能通过“精确吸取10ul”（这是某中华杂志中一文的原话）来解决了。
最近一个人教我一个方法很有意思，不敢私藏，放在这里供大家讨论。将目的基因和看家基因在同管扩增，根据实现分管“十八摸”出来的两种基因的循环数，设定特定的循环数后分别取出部分以备电泳，例如在50ul的体系中22、26、30循环各取出10ul，加上最后的20ul（实际上可能不到）一起电泳。这个方法的闪光点在与很像定量PCR，可以成为土法“实时”PCR，实际上，这正是最早的实时定量PCR的雏形，最早的实时PCR即使同时30管，每循环取出一管，只是后来用荧光代替了EB。但是这个方法还是不能减少了同管竞争的影响，虽然可以在早期减少竞争抑制，但是在晚期还是不免受到影响。
所以这些问题还是值得讨论，还是实时荧光定量的好哇。
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行，写的可以啊
引用？我看一般同志就不要引用了，好象没有能引用的地方，意思倒是可以引用的，呵呵
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我用的是柱子TRIZOL，但是前面提取细胞RNA总是提不出来，现在改提脾脏，但是总有杂带，消化DNA实在太麻烦了，怎么能在提取过程中消除或减少DNA呢？
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刚接触RT-PCR，一团迷雾，看后大有收获。
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实际上用普通的TRIZOL，除非特别需要，在一般的实验中可以不消化dna的，依靠引物 设计及可以了。像你这样的情况是不是和和用柱子有关呢？