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western 怎么做？转膜条件是什么样的？谢谢1
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我在做紧密连接的蛋白 20kd。一般我跑电泳一个小时就转膜的，内参是用的GAPDH 37kd。60mA转20min,maker都转到了PVDF膜上。但是ECL显色的时候，只能做出内参，目的蛋白没有。我还做过转膜30min、40min、45min的，每次都能做出内参，目的蛋白没有；目的蛋白和内参是一起转膜的。我找不出原因，望各位前辈指教，谢谢！
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你的电流好像小了,我们一般是200mA，45分钟
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小分子量的就是要小的电流&&我用的是半干转的& &电流大了 就容易转过了& & 疯了& &我用尽了我能想的办法&&就是做不出目的蛋白& &内参每次都能做出来&&
一般一抗的保质期是多久啊？我刚刚看了下那个抗体是2007年12月生产的
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1.通常情况下，目标蛋白含量低于内参含量，请确认蛋白上样量是否足够？染色看看。
2.确认目标条带没有跑出凝胶。
3.确认一抗质量。通常情况原液冷冻保存2年肯定没问题。是否有反复冻融情况？是否有稀释后保存？做western样品处理问题如果我要把单抗转到NC膜上进行一抗二抗反应,那应该怎么处理,上电泳前一煮不就失活了吗,请说明一下理由比如我要测一个单抗，把它转膜上，然后加抗原，再加二抗，这样可行吗，那转膜上_百度作业帮
做western样品处理问题如果我要把单抗转到NC膜上进行一抗二抗反应,那应该怎么处理,上电泳前一煮不就失活了吗,请说明一下理由比如我要测一个单抗，把它转膜上，然后加抗原，再加二抗，这样可行吗，那转膜上
如果我要把单抗转到NC膜上进行一抗二抗反应,那应该怎么处理,上电泳前一煮不就失活了吗,请说明一下理由比如我要测一个单抗，把它转膜上，然后加抗原，再加二抗，这样可行吗，那转膜上的单抗怎么处理，如果是细胞表面分泌的蛋白呢，
转膜并不是把单抗转上去,而是把总蛋白给转到膜上,便于后面一抗二抗反应.电泳前煮蛋白样品是让蛋白变性,由空间折叠构象变成线性的结构,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后,能按照分子量大小依次排开.抗原抗体反应并不需要有活性的蛋白.你的单抗仍然是蛋白,其实仍然是蛋白印迹,是需要变性的.试问假如按照你的思路,抗原根本是多余的了,你直接用二抗结合一抗不就行了吗?然后二抗上带有酶,再进行显色反应.
为什么要把单抗转膜？不太明白你的问题。
您可能关注的推广回答者：Western Blot中怪问题：MARKER转到膜上了，但膜上无蛋白？
21:44:43&&&来源：&&&评论：&&
[Western Blot中怪问题：MARKER转到膜上了，但膜上无蛋白？] 最近在做WB，目的蛋白分子量80KD ，用5%浓缩胶，10%的分离胶，用70V在浓缩胶中跑30min左右，120V在分离胶中跑70min左右，电泳中MARKER跑的很漂亮，条带也很清晰。用Bio-rad的电转仪，全湿转，恒流105mA,3-3.5小时后，预染MARKER明显转到0.45uM的PVDF 关键词:[转膜 条带 二抗 目的蛋白 电泳 一抗 丽春红 荧光]…
最近在做WB，目的蛋白分子量80KD ，用5%浓缩胶，10%的分离胶，用70V在浓缩胶中跑30min左右，120V在分离胶中跑70min左右，电泳中MARKER跑的很漂亮，条带也很清晰。用Bio-rad的电转仪，全湿转，恒流105mA,3-3.5小时后，预染MARKER明显转到0.45uM的PVDF膜上，条带清楚。胶考染无蛋白，也无MARKER残留，但可见较弱的电泳通道，但膜用立春红染色不见任何蛋白，孵抗体后也不见荧光，（二抗和发光剂都没问题）。
在相同条件下用样品做电泳后胶的考马染色，在MARKER标记的70--100KD处有蛋白带。
转膜液没有配错，且是新配的。做了2次都是同样的结果，不知道自己是哪里出了问题，郁闷中，望各位指教！
谢谢啦！回复
1、用Bio-rad的电转仪，全湿转，恒流105mA,3-3.5小时
时间稍有点长，三个小时就可以。
2、胶考染无蛋白，也无MARKER残留，但可见较弱的电泳通道
再次证实转膜有点过，一般考染多少会有点残留。
3、但膜用立春红染色不见任何蛋白
1）转过到滤纸
2）丽春红是不是好用，另外不是染不出就没有蛋白，我们有时候也染不出但是后续照样可以出条带。
在排除了二抗的问题（一般不是二抗的问题）后最大的可能就是一抗，建议不同稀释比在孵育看看。
哈哈，我的问题和你正好相反。我的样品转的还行，就是看不到marker！郁闷ing。
据我的经验，看看你的夹子是不是很紧，也可能转过了。
会不会是蛋白不存在，或者提取的问题或者裂解的问题？
是否膜与胶间有气泡产生,造成蛋白没有转到膜上.
做个阳性对照试试吧。。。
同时跑两块胶,一个转膜，一个直接染色，确定一下是哪个环节有问题。从描述中看，MARKER转的很好，胶上也没残留，会不会是蛋白样品浓度不够或其他原因呢？
一点建议：
1、建议Bio-rad的电转仪，半干转18分钟。
2、根据以上条件分析，很可能转过，小窍门：如果还用你的条件，建议转膜用2-3张膜，这样，即使转过了，第二张，第三张膜可能还会有你的条带。
建议使用western blot marker进行试验，可检验转膜效率和后续的wb操作所有的步骤是否存在的各种原因。
1.如转膜效率较低或失败，western blot marker不能显色或条带不明显
2.如一抗失效（或无抗原）、二抗没有问题、整个wb操作无问题责，western blot marker显色清晰，但无目的条带。
3.如western blot marker显色不清晰或无条带，责二抗或显色液出现问题
/rapid_western_kit.html （国内最好的western blot marker）
我的经验是不能用预染Marker的条带来判断转膜效果！！！
我做过预染marker的转膜，在100v（200-300mA）条件下，只转了5-10min就可以看见所有“Marker”的条带（20k-100k）被转到PVDF膜上，而且非常漂亮，此时胶上已经没有Marker了。对于100k的大分子量蛋白而言，转膜速度不可能这么快的。同样条件下继续转膜，大概1h后，预染marker还是在PVDF膜上。
所以我认为，预染marker由于已经和染料结合，其转膜的情况和我们的目的蛋白是不一样的，预染Marker更容易转到膜上，而且不容易穿透PVDF膜。
不能因为看到预染Marker转到膜上就认为目的蛋白也已经转到膜上！最终还是要对胶和膜进行染色验证。
谢谢各位的帮助和指导。
1.我同条件电泳了两块胶，一块胶电泳后考染，结果还可以，应该不是蛋白的问题。
2.实验室没有半干转的转膜装置，还是湿转，3小时，105mA,仍然存在上述问题，立春红染色膜上无蛋白，压片也不见荧光
3.其他人做70KD的转膜条件是105mA，3小时，我的蛋白是80KD 和85KD应该不会转过了吧？
还是找不出失败的原因啊，苦恼中！
如果是这样,建议：
1.同一块胶同时跑你的蛋白（1道，2道，3道）和别人做过没问题的蛋白（4道，5道，6道），同时加一道非预染的MARKER（7道）；
2.同时转膜，1道，2道加你的一抗，你的二抗，显色；
3道检测β-actin；
4道，5道加你的一抗，你的二抗，显色；
6道检测β-actin
3.如果全部没有，说明后续步骤与有问题；
如果6道检测β-actin有，3道检测β-actin没有，你的蛋白有问题；
如果6道检测β-actin有，3道检测β-actin有，4道，5道能检测出你的分子，2道，3道没有，你的蛋白有问题；
如果6道检测β-actin有，3道检测β-actin有，4道，5道也不能检测出你的分子，2道，3道也没有，你的抗体可能有问题（前提是你的抗体浓度用推荐合适浓度仍然不出结果),建议咨询厂家或更换抗体。
如有结果，欢迎反馈。
同时同意楼上战友的意见，丽春红染色和预染MARKER都不能作为蛋白转膜成功的绝对标准，只能相对参考。
电泳：60V 30min
转膜：做三明治时要完全水下操作，做的过程中不断赶气泡。
110V 恒压转膜2小时10分钟（完全冰中转）
保证你80kDa的条带转上去
我的经验是不能用预染Marker的条带来判断转膜效果！！！
我做过预染marker的转膜，在100v（200-300mA）条件下，只转了5-10min就可以看见所有“Marker”的条带（20k-100k）被转到PVDF膜上，而且非常漂亮，此时胶上已经没有Marker了。对于100k的大分子量蛋白而言，转膜速度不可能这么快的。同样条件下继续转膜，大概1h后，预染marker还是在PVDF膜上。
所以我认为，预染marker由于已经和染料结合，其转膜的情况和我们的目的蛋白是不一样的，预染Marker更容易转到膜上，而且不容易穿透PVDF膜。
不能因为看到预染Marker转到膜上就认为目的蛋白也已经转到膜上！最终还是要对胶和膜进行染色验证。
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确实如楼上所说，预染marker因为与染料偶联，转膜速度加快。不能客观反应转膜效率。所以建议使用未做任何偶联的western blot marker(22/40/60/85/120kd)，足以指示蛋白的转膜情况，并能诊断wb操作中的问题。
我的问题与搂主很相似啊，但是加上ECL时全是荧光，是怎么回事啊？
我的问题与搂主很相似啊，但是加上ECL时全是荧光，是怎么回事啊？ 检查
是否二抗用的浓度太高？是否封闭充分？是否ECL失效？
上述前辈们的讨论都很精彩啊，受教了。
不过不知你转完膜后的SDS-PAGE有没有再拿去考染呢？以便确认蛋白样品是否完全转到膜上了。
上述前辈们的讨论都很精彩啊，受教了。
不过不知你转完膜后的SDS-PAGE有没有再拿去考染呢？以便确认蛋白样品是否完全转到膜上了。 干吗全转过去？全转过去还没碰到过，估计不可能。转膜效率50－60％就可以了
我遇到的问题是这样的：
1，转膜后marker清楚，丽春红染色也很好，考染发现转膜的也很可以，内参曝光也不错，但是，看不到我要的目的蛋白（94kD）
2，我想问题是在蛋白的提取上，我做的是大鼠心肌，RIPA和PMSF（9：1）共同裂解细胞，1分钟离心，不知道这样的方法提取对不对？？？？？
请大家给与指教，谢谢！
我遇到的问题是这样的：
1，转膜后marker清楚，丽春红染色也很好，考染发现转膜的也很可以，内参曝光也不错，但是，看不到我要的目的蛋白（94kD）
2，我想问题是在蛋白的提取上，我做的是大鼠心肌膜蛋白，RIPA和PMSF（9：1）共同裂解细胞，1 ... 需要使用膜蛋白提取方法，否则蛋白与细胞碎片一起离心的时候丢掉了。
建议直接将裂解后组织加入sds-laoding buffer加热15min，直接上样试试。需要注意的是最好裂解液中加入一点benzonase以有效的降低粘度（主要消化掉RNA和）
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为什么western转膜效率这么低？？？
为什么western转膜效率这么低？？？
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这个帖子发布于10年零143天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
仪器：bio－rad半干膜面积：20－40cm2电流：230－350mA时间：5－12h蛋白MW：20－70kd转膜完后PAGE考染仍有条带请教：1。为什么效率这么低？怎么办？
2。我用的电流和时间是不是“超标”了？对蛋白有没有影响？
对以后的实验（一抗的结合）有没有影响？
3。如果时间过长，蛋白会穿过PVDF膜吗？
回复：为什么western转膜效率这么低？？？
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不知楼主为什么这么做？从哪里参考的步骤？bio－rad半干转膜仪的电压要求不能超过25v，不知楼主用这么大的电流电压是多大？为什么用这么长的时间呢？半干转用1h足以，即使是70kd的蛋白！你的电流和时间是超标了，不光对蛋白不好，尤其对仪器不好！时间过长，会穿过PVDF膜的！不是效率低，而是蛋白含量高，一般说来转完以后，条带不会完全转到膜上的，这一点也不影响下一步的试验！没有必要全部转到膜上！
回复：为什么western转膜效率这么低？？？
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我做了很久的western了，其实，转移的时间长短和电流大小，主要决定于蛋白的分子量，小的转移时间短，反之延长，page上的所有蛋白不可能都能转移在一张膜上的，因为转移大分子蛋白的时候，小分子的蛋白由于转移时间长的原因，已经部分穿透过膜了，所以转移20-70kd的蛋白后，page上面还有大分子蛋白是很正常的，只要在20-70kd范围内没有蛋白在page上面就可以了。
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