专利名称：：通过靶向肿瘤坏死洇子受体的前配体装配域(plad)来缓解炎性关节炎的制作方法
：本发明提供了TNF受体(TNFR)超家族成员的胞夕卜区保守结构J^介导受体寡聚物的特异性非配體依赖性装配方面的新功能
：TNFR超家族成员通常含有胞外区的1至6个富含半胱氨酸的结构域(CRD)、单个的跨膜结构域和大小可变的胞质内结构域。该受体家族的成员通常可结合到由结构、功能和序列相似性所定义的TNF细胞因子家族的配体上这些受体以其活性配体结合态(ligandedstate)形成三聚体，且一些成员含有被称为死亡结构域的胞质结构域根据本发明，这些受体的胞外区可通过新的自締合或同型締合功能来进一步表征所述功能由含有至少1个富含半胱氨酸的结构域的前配体受体装配域(PLAD)所介导。更糾地说TNFR超家絲员，包括TRAIL受体1、CD40、60kDa的TNFR和80kDa的TNFR,表现出了这种同型締匼功能包括Fas、LTPR、C謂、CD30、CD27、HVEM、RANK、0X40和DR4在内的其它的TNFR超家族成员含有该PLAD。所述PLAD是配体结合和受体功能所必需的因此，TNFR超家族成员似乎是通过鈈同的预形成的复M而不是通过配体诱导的单个受体亚基的交:^传递信号的因此，PLAD可被药物制剂把向以阻断这些预形成的复合体的形成并因此阻断受体功能已经确定许多^L生物都进化出了对抗针对它们的免疫应答的有效策略(79)。更具体地说一些病毒和细菌会表达用于调节或直接阻断免疫效应分子作用的细胞蛋白同源物，包括细胞因子和趋化因子(80)已经鉴定了一些较大DM病毒的TNF受体样受体(vTNFR)的病毒同源物，所述较大DM疒毒包括一些痘病毒和人巨细胞病毒PLAD介导的vTNFR自締合或与TNF家族受体的异源締合是否存在或其^f可作用尚未得到阐明。两种主要的关节炎为类風湿性关节炎(RA)和I^l毒性关节炎(SA)RA是一种伴随有慢性关节炎症和进行性骨破坏的常见的人自身免疫性疾病(祸。尽管尚未完全了解M的病因和发病機制但是疾病逸艮中涉及细胞因子例如TNF-a、IL-1、IL-6和NF-kB配体的受体激活物(RANKL)(M-<W。核因子-kB(NF-kB)是这些细胞因子的关键性调节物(TNF-a在RA的发病机制中起重M用，M抗劑例如,西普(也称为Enbrel)、TNFRII免疫球蛋白Fc融合蛋白和英夫利昔单抗(也称为Remicade)、抗TNF-ct单克隆抗体可以改善RA的临床过程(铺SA是一种由细菌感染诱发的快速进荇性和高度破坏性的关节疾病，其中TNF-oc也起到了重要作用(^)由TNF-a(59)、脂多糖(LPS)、CpG-DM(J。、"和M^、(幼诱发的实验性关节炎小鼠模型已被用来测试新的治疗方法这些试剂能诱发滑膜炎、血管翳形成、骨和软骨磁:坏以4人RA和SA中观察到的其它特征。根据本发明体外和体内数据表明TNFRPLAD蛋白能够有效地抑制TNF-a以及它在实验性炎性关节炎中的作用后果。
发明内容本发明提供了一种包括TNF受体样受体的前S己体装配域(PLAD)的分离的^J^^列的多狀本发明还提供了一种包括前配体装配域(PLAD)的分离的M,列的多肽，其中所述PLAD选自TNF-R的PLAD、p60的PLAD、p80的PLAD、Fas(CD95/APO-1)的PLAD、TRAIL受体的PLAD、LTPR的PLAD、CD40的PLAD、CD30的PLAD、CD27的PLAD、H丽的PLAD、0X40的PLAD、DR4的PLAD、NGFR的PLAD、Troy的PLAD、EDAR的PLAD、XEDAR的PLAD、DcR3的PLAD、AITR的PLAD、4-1BB的PLAD、DR3的PLAD、RANK的PLAD、TACI的PLAD、BCMA的PLAD、DR6的PLAD、OPG的PLAD、DRS的PLAD、DcRl的PLAD和DcR2的PLADTNF-R、p60TNFR、p80TNFR、Fas、TRAIL受体、LTPR、CD40、CD30、CD27、HVEM、0X40、DR4、NGFR、Troy、EDAR、XEDAR、DcR3、AITR、4一1BB、DR3、RANK、TACI、BCMA、DR6、0PG、DRS、DcRl和DcR2全是TNF受體超家族(在本文中也称为TNF受体样受体家刻的成员。本发明还提供了TNF受体超家族其它成员的PLAD以^U页域技术人员能够如何对它进行鉴定的方法夲发明的多肽可^J1来抑制PLAD的自締合以及TNF受体超家族成员的寡聚化。这些多肽也可^UI来抑制配体与TNF受体超家;^员的结合本发明还提供了一种包括TNF受体寡l^应抑制剂的组合物。本发明进一步提供了缺少PLAD的TNF受体超家;^A员图1A示出了缺少配体时的TNFR寡聚物。用DTSSP(7)交联经TNFa处理过或未经TNFa处理过的H9T细胞淋巴瘤如图所示，在非还原(泳道1-4、9-12)性或还原(泳道5-8、13-16)性条件下对全细胞溶胞产物进行电泳，并针对p60或p80TNFR进行印迹括号标明了三聚体(T)和单體(M)的位置。圆圏标明了与抗-p80抗体交XSJI的非特异性蛋白所述结果^4了三次独立的实验。图1B说明了特异性的p60TNFR自締合用p60ACD-GFP-HA(泳道l-3)或pEGFP-Nl(泳道4-6)，并且用pcDM3(泳道1、4)或p60ACD-HA(泳道2、5)或HVEMACD-HA(泳道3、6)转染293T细胞如图所示，用抗-GFP抗体进行免疫沉淀(GFPIP在上面的2个图中)并用抗-HA抗体(HAWB)或抗-GFP抗体(GFPWB)进行印迹上图和中图分别示出了沉淀的p60ACD-GFP-HA(或GFP)和p60ACD-HA。下图示出了细胞溶胞产物中的p60ACD-HA和HVEMACD-HA蛋白结果^RA了五次实验。图1C说明了特异性的p80自締^^和前配体装配域(PLAD)的定义用图上方所示的质粒转染293T细胞。用仅识别全长p80的C末端特异性抗-p80抗体(p80IP)进行免疫沉淀(上图和中图)溶胞产物中截短的p80或p60蛋白的表錄下图中示出。用抗-HA抗体(上图和丅图)和C末端特异性抗-p80抗体(中即进行蛋白质印迹空心圆圈^4糖基化和非糖基化形式的P80。实心圆圏表示Ig重链图1D说明了PLAD足以满足受体自締合。鼡p80ACD-GFP-HA(泳道l-5)和每条泳道上方所示的质粒一^^转染293T细胞用抗-GFP抗体进行免疫沉淀并且用抗-HA抗体进行蛋白质印迹。共沉淀的DCD蛋白以及它们在总细lfc^胞产粅中的表达分别在中图和下图中示出上图示出了沉淀的p60ACD-GFP-HA蛋白。图1E说明了PLAD是TNFoc结合所必需的直方图示出了在用所示构建体转染过的293T细胞中轉染后受体的表达(通过抗-HA染色)以及它们与TNFa的结合(25)。x-轴表示荧光强度y-轴表示细胞数量。所示数量为与用载体转染的对照相比的阳'^^的百分数图2A说明了置换PLAD中的残基可防止自締合。用所示质粒转染293T细胞用抗"GFP抗,照图1中的方法进行免疫沉淀。用抗-HA抗体进行蛋白质印迹上图和中圖分别出示了沉淀的p60ACD-GFP-HA(空心圆圏)和p60ACD-HA突变蛋白(括号)。下图示出了细胞溶胞产物中p60△CD-HA突变体(括号)和HVEMACD-HA(实心圆圏)的表达图2B说明了通过荧光共振能量轉移(FRET)所证明的p60和p80TNFR的同型自締合。用所示的CFP(上图)和YFP(下图)质丰iJit转染的293T细胞的流式细胞分析的直方图虚线表示单独用CFP转染的对照，实线表示不使用TNFa的FRET而粗线表示使用TNFa的FRETx-轴和y-轴分别表示FRET荧光强度和细胞数量。在CFP阳性群中分析FRET,在所述CFPP曰性群中所有细胞也都是YFP阳性的FRET被定义为由CFP所噭发的YFP的荧it^射。该结果代表了四次独立的实验图3A示出了TNFR超家族典型成员的CRD1(p60的CRD1(SEQIDNO:22)、p80的CRD1(SEQIDNO:23)、LTPR的CRD1(SEQIDNO:24)、CD40的CRD1(SEQIDNO:25)、HVEM的CRD1(SEQIDNO:26)和CD30的CRD1(SEQIDNO:27))的序列比对。该图示出了高度保守的半^t^酸位置所述位置用于二^克键并且界定了能赋予TNFR超家M员资格的富含半皿酸的结构域。图3B说明了TNFR超家族其它成员中的受体自締合用DR4ACD-GFP-HA(泳道1-4)戓CD4△CD-GFP-HA(泳道5、6)与p80△CD-HA(泳道1、6)、p60△CD-HA(泳道2)、HVEM△CD-HA(泳道3)、DR4△CD-HA(泳道4)或CD40△CD-HA(泳道5)—^转染293T细胞。分别用抗-GFP和抗-HA抗体进行免疫沉淀和蛋白质印迹上图示出了免疫複合体中的沉淀蛋白，下图示出了细胞溶胞产物中的DCD蛋白表达实心圆圏表示GFP融M白，箭头表示免疫复合体中的DCD蛋白图3C示出了通过FRET证明的DR4囷CD40的特异性受体締合的流式细胞分析。按图2B中的方法使用所示的CFP(上部)和YFP(下部)质丰iJft进行转染虚线表示单独用CFP时的本底FRET，粗线表示同时存在CFP融合蛋白和YFP融^^蛋白时的FRET对于每个组来说，x-轴为FRET强度y-轴为细胞JL量。图3D示出了两种基于预締合三聚体复M的TNFR信号传导模型对于预装配链重排模型(左)，椭圆形^4CRDC^M远端向膜近端的方向将CRD编号为l-4)斑点方才錄示月M结构域。该受体是从垂直于质膜的角度观察的罗马数字代表三聚体复匼体中的链。对于该三聚体簇模型(右)灰色符号表示细胞表面上预装配的TNFR三聚体，带圆團的三角代束三聚的TNFot数字1-3代表预装配三聚体复合體中的受体的三条随。该受体是按向下俯视质膜的角度》见察的图4A示出了在没有配体结合的情况下，病原性Fas突变会导致显性干涉野生型(WT)、Pt2(del52-96)和Pt6(A241D)Fas分子的表面表达和结^#征。左侧栏示出了通过针对每个受体蛋白N-末端存在的AU-1表位标签染色时转染到293T细胞后24小时的表面表达。中间栏礻出了用10pg/ml抗-Fas拮抗抗体AP0-1(Kamiya)染色的同样的细胞右侧栏示出了设计用于通过修饰的亮氨酸拉链来三聚化并且用抗-亮氨酸拉链mAb(FasL染料)通过染色来显影嘚FasL的结合。抗体结合用藻红蛋白缀合的抗-小鼠抗体来显影括号(bracket)表示与未转染的对照相比时，对染色呈强阳性的细胞的百分数在每幅图Φ，粗线和细线分别代耒转染的和未转染的细胞制品的信号所有的直方图都代表了以4个十进制刻度间隔(4decade)对数焚光刻度(X轴)相对细胞计数(Y轴)莋图的10，000次事件在使用Flowjo软件(Treestarsoftware)的FACScalibur流式细胞/f义上收集lt据。图4B示出了与WTFas共转染的突变体Fas分子导致的显性抑制将10|ig所示的表达载体或单独的PCI载体電穿孔到不^t。先前所述(M的人Fas的BW细胞中用5pgpEGFP-Nl(Clontech)标记转染了GFP的细胞。24小时后加入所示量的抗-FasmAbAP0-1和1/20体积的可溶性蛋白A(Sigma)以使凋亡诱导最大化。通过用鋶式细胞术计算GFP-阳性的活细胞并计算细胞消亡来量化凋亡U力图4C说明了Fas分子的自締合。将编码HA-标记的Fas的表达栽体与野生型(WT)Fas和EC突变体Pt2Fas(del52-96)共转染所述HA-标记的Fas的C-末端死亡结构域4皮绿色荧光蛋白(HAFas1-210:GFP)所代替。对照细胞用WTFas和TNF受体家族成员疱渗病4^A介质(HVEM或HveA)的HA-标记的胞质截短型共转染所g质截短型融合了GFP(HAHVEMACD:GFP)。按实施例中所述裂解细胞溶胞产物，用抗-GFP进行免疫沉淀并且进行电泳用抗FasC—末端的多克隆^j6l清(C20，SantaCruzbiotechnology)(抗—FasCT)探测沉淀蛋白的印迹以顯示与GFP标记的蛋白共沉淀的全长Fas分子也可以用抗-HA-HRP(RocheMolecularBiochemicals)和抗-FasC20通过蛋白质印迹(WB)检测细胞溶胞产物以测定这些蛋白的总量。空心圆圏表示免疫沉淀粅种的IgG重链实心圆圏表示WTFas，箭头表示截短的Pt2Fas蛋白一些用抗-FasC20印迹的泳道中的上方条带表示糖基化的Fas。图5A示出了缺乏PLAD或配体结合的Fas突变体嘚表达和功能利用N-末端Fas突变体的APO-1和FasL的结合。如图1A中所示(除了用抗-HA代替抗-AU1)用C-末端截短的HA标记的TNFR2(TNFR2)对所示的HA标记的Fas突变体、R86SFas突变体和对照转染物进4亍染色以显示细胞表面每种突变体的总表达。图5B示出了Fas胞外结构域的相互作用依赖于该蛋白N-末端区域中的结构域在泳道l-4中，用不含死亡结构域的AU-l标记的Fas1-210和所示的HA-标记的Fas突变体或对照TNF2蛋白(HATNFR2ACD)共转染293T细胞溶胞产物用抗-AUl免疫沉淀并且用抗-HA探测以显示共沉淀的蛋白。已经证奣使用了抗FasN-末端的抗体(WB抗-FasN)的对照印迹可祐月来测定溶胞产物中AU-1Fas1-210蛋白的量该结果代表了三次独立的转染。泳道5-7示出了用与图1C中所用的同样嘚步骤利用HAFasl-210:GFP进行的WTFas和FasR86S突变体的共沉淀。空心圆圏表示免疫沉淀抗体的Ig重链实心圆圈示出免疫沉淀的Fas的位置。图5C说明了缺少自締合结构域的Fas分子无法诱导凋亡用10ng用于所示Fas分子的表达载体转染BW5147鼠胸腺瘤细胞。用500jag/ml可溶性APO-1i秀导凋亡并按图IB中的方法进行定量图5D示出了无配体结匼的R86SFas突变体对凋亡的诱导和抑制作用。用10ing的每种Fas表达载体和5|ug的GFP质粒转染BW细胞按图2C中的方法进行凋亡诱导和定量，除了用APO-1来诱导用空心条表示的样品中的凋亡并且向用实心条表示的样品中加入5%v/v的FasL上清图6A示出了Fas分子间的荧光共振能量转移。点图示出了所示共转染子中CFP、YFP和FRET信號之间的关系构建CFP和YFP融合蛋白并转染到293T细胞中，在FACSvantage细^/f义上进行分析数字为具有FRET信号的CFP或YFP阳性细胞的百分数(右上象限)。图6B为全长和N-末端缺失的Fas受体之间FRET信号的比较IRET信号的直方图是在对CFP荧光设门的细胞中产生的。所有的转染子的YFP荧5是相当的粗线为共转染细胞的信号，细線为每一对中单独转染CFP构建体的信号图6C示出了通过在单个细胞上进行YFP的显微光漂白确定的所示CFP和YFP对的FRET效率(4-7个细胞区域的5次读奶。该数字玳表了每个质|树的平均E"/和标准误。图7A说明了内源Fas受体链的预締合将lxlO'个H9淋巴瘤细胞用交联剂DTSSP处理(Pierce,4'C下用10mM处理30分钟，然后用10mMpH8的Tris-Cl终止15分钟)和/或茬所示##下用1/ig的拮抗抗体AP0-1或FasL刺激15分钟对于抗-Fas免疫印迹，在电泳之前用N-聚糖H"F(RocheMolecularBiochemicals)处理细胞i^胞产物并用抗-FasC末端mAbBIO(SantaCruzBiotechnology)和抗-小鼠IgGl-HRP(SouthernBiotechnology)探领'J。图7B,在用所示试剂处悝后将细胞自、免疫沉淀并按照先前所述(7i)进行FADD和半胱天冬l8印迹。用箭头标出了两种半胱天冬H"8酶原同种型(p54/52)和pll半胱天冬酶亚基蛋白酶解后半胱天冬酶-8的切割产物(p43/41)的位置图7C示出了PARP的切割。在37C下将(A)和(B)中所用的细胞等^#另外培养4小时并且用抗-PARPmAb(ResearchDiagnosticsInc)对细胞溶胞产物进行印迹。上方的条带為115kD全长PARP,下方条带为标志物85kD的半胱天冬酶切割片段该结果4议了每种M下至少三次独立的实验。图8A说明了显性干涉依赖于PLAD的N-末端对选定的来洎NIH所研究家族的ALPS患者(Pt)Fas突变进行比对。符号"X"表示点突变的位置如图，示出了通过共沉淀测试的与野生型Fas締合的能力(SA)和共转染研究中Fasi秀导的凋亡的显性抑制作用(DI)示出了患者#1和#20的编码显性负性PLAD的序列，所述PLAD含有由突变编码的多肽从信号肽后的第一个氨基酸开始编号。斜体字毋表示由移码突变引入的额外的氨基酸图8B示出了无PLAD时没有显性干涉。Fas^t感性JurkatT、淋巴瘤细胞用10ng所示构建体和2.5mgGFP才艮告质粒转染转染后18小时，連续6个小时加入所示量的Apo-1并通过用膜^:蛋白V-PE(Pharmingen)染色iMt凋亡进行定量百分itAM联蛋白V染色阳性GFP(+)细胞的百分比。这些结果代表了三次独立的转染图9示絀了用于确定p80嵌合受体或截短形式存在情况的免疫沉淀分析。用所示质粒转染293T细胞并收集细胞以便用抗-p80COOH-末端特异性抗体进行免疫共沉淀^使用抗-HA抗体通过蛋白质印迹^^斤法^^斤免疫沉淀物以确定p80嵌合受体或截短的存在情况(上即。下图示出了全细胞溶胞产物中HA-标记蛋白的表达图10礻出了重组细菌PLAD蛋白的表达。(a)PLAD如何帮助受体三聚体装配以及配体结合反应性的模型可溶性PLAD蛋白可以与单个的受体链締合、防止三聚受体裝配并从而阻断配体-诱导的信号传导。(b)纯化的GST、P60PLAD-GST(P60)和P80PLAD-GST(P80)的^_电泳左侧示出了分子量标记，其大小以千道尔顿为单位(c)使用抗P60PLAD(上图)或P80PLAD(下图)的单克隆抗体(MAb)的蛋白质印迹分析。示出了P60PLAD(左图)或P80PLAD(右图)在最初的舰电泳中所使用的以iug蛋白为单位的滴定图ll示出了PLAD蛋白在TNF-ot诱导的细胞死亡中的作用。(a)用培养基、人TNF-oc(hTNF)(2ng)、TNF-oc(2ng)+P60PLAD(P60)(40pg)处理L929细胞后利用流式细胞术评估的细胞死亡。插图示出了相差显微照片右下角给出了被设门的活细胞的百分数。Y轴為^ft丙啶(PI)染色X轴为FSC(前向角散射分布)。死亡细胞^4现出增多的PI染色和减少的FSC(b)小鼠TNF-a(mTNF)(2ng)或hTNF(2ng)以及不同剂量的PLADP60(P60)蛋白诱导的细胞消亡。(c)mTNF(2ng)或hTNF(2ng)以及不同剂量的PLADCD40(CD40)疍白诱导的L929细胞的消亡(d)在存在或不存在P60PLAD(P60)、P80PLAD(P80)和GST的情况下，用TNF-oc或抗-Fas处理12小时后42.3Jurkat细胞的消亡。TNF-oc(3ng)、P60L(低;4.5pg)、P60H(高；15jig)、P80L(低;4.5|ig)、P80H(高;15pg)、GST(15pg)、抗-Fas(10ng)(e)通ii^存在或不存在P60PLAD(IOOjug)、依那西普(25jag)、英夫利昔单抗(20ng)的情况下，用mTNF-oc(4ng)处理的底物转化的光密度(OD)来测量L929细胞中的半胱天冬l8活性图12示出了P60和P80PLAD蛋白对关节炎的作用，所述關节H由在BALB/c小鼠的关节内注射TNF-ot以及在C3H/HeJ小鼠的关节内注射细菌CpGDM来诱发的(a)膝关节HE染色组织切片的^4性显徵照片，示出了PBS;45ngTNF-oc;P60PLAD(IOOing)和45ngTNF-oc;P80PLAD(IOOjig)和45ngTNF-oc;CpGDNA(lnM);CpGDNA(lnM)和P60PLAD(100|ug)箭头表示炎症的集中灶区。标记为C(软骨)、JC(关节腔)、ST(滑膜组织)、B(骨)且该箭头指向滑膜组织的,iia层。(b、c)如图所示单独用TNF-oc(TNF)或者用TNF-a加P60PLAD蛋白(P60)或者用TNF-a加P80PLAD蛋白(P80)处理的实驗组(11=5)的滑膜炎、血管翳、骨和软骨侵蚀的定量组织分析。(d)每个实验组(11=5)的滑膜炎、血管翳、骨和软骨组织侵蚀的定量组织分析这些分析要偅复至少两次。单独的CpGDM(CpG)、CpGDNA加P60PLAD(P60)数值为平均值土标准差(s.d.)，"为与对照组相比处理组的P<0.01关节内接种后3天处死小鼠以便进行组织病理学检查。结果^C4了三次实验图13示出了P60和P80PLAD蛋白对DBA/1J小鼠体内CIA的作用。盲法实验(a-f)(a)用PBS或P60PLAD处理的CIA小鼠的足爪照片。(b)用PBS处理的初次免疫后75天或腹腔内注射P60PLAD蛋白4周(烸周三次每次100iag)的CIA关节的HE染色切片。(c)用PBS(n-13只小鼠)(方刻、P60PLAD蛋白(P60)(n=12只小鼠)(菱形)和P80PLAD蛋白(P80)(n=13只小鼠)(椭圆)处理的CIA小鼠中关节炎的严重度、足爪厚度的测量以忣体重(d)PBS、P60和P80处理组中关节炎的发病率。(e)对按所示方法处理4周的CIA关节切片中滑膜炎、血管翳、骨和软骨侵蚀的评估(f)血清中IL-l和IL-6水平。*=与对照PBS纟M目比P<0.05(g)舰内注射两周PBS(n=10只小鼠)(方W、P60PLAD蛋白(P60)(n=10只小鼠)(菱形)和依那西普(11=10只小鼠)(椭圆)后CIA小鼠体内关节炎的严重度。f-与对照PBS组相比P〈0.05(h)在所建立的CIA中P60PLAD疍白的作用。皿内注射两周PBS(n=9只小鼠)(方W、P60PLAD蛋白(P60每隔一曰400ng)(n=10只小鼠)(菱形)后所建立的CIA小鼠的关节iU^重度。*=与对照PBS《W目比P<0.05图14示出了关节炎关节中TNFR的表达、PLAD蛋白对TNF-oc结合的抑制以及NF-kB的活化。(a)用PBS或P60PLAD处理75天后处死的患有CIA的DBA/1J小鼠的关节炎关节中TNFRl和TNFR2的免疫组织化学褐色表示表达TNFR的细胞。(b)在用50ng生粅素化的人TNF-a(Bt-TNF-a)和不同剂量的P60PLAD蛋白预处理染色后进行流式细胞术。曲线代表了单独的Bt-TNF-a、Bt-TNF-ct加3ygP60PLAD、Bt-TNF-a加15jigP60PLAD、Bt--a加30pgP60PLAD、人TNF-a或阴性对照。(c)用所示的依那西普(l|ig)、P60(1ing)戓P80(1|ag)PLAD蛋白(测试蛋白)免疫沉淀(IP)的50ng人TNF-a的皿电泳使用抗TNF-oc抗体进行的蛋白质印迹。(d)在存在(+)或不存在(-)P60PLAD蛋白的情况下使用NF-kB(左箭头)或0CT1(右箭头)的放射性标記寡核苷酸探针，对从经TNF-ot处理的A3Jurkat细胞制得的核提取物进行的电泳迁移率变动检测^在或不存在P60(100jig)或(100jig)PLAD蛋白的情况下，在体外用mTNF-oc(2ng)处3g^TNFRl(e)或TNFR2(f)敲除(-/-)小鼠脾髒分离的单核细胞之后对这些细胞中的NF-KBp65核易位进行的定量分析。*=与对照组相比P<0.05;**=与对照组相比P<0.01在每个遗传背景中P60和P80处理组之间的差异都昰显著性差异(P<0.01)。图15示出了P60PLAD蛋白可抑制破骨细胞生成以及RANK和RANK配体(RANKL)的表达(a)胶原初次免疫并用PBS或P6GPLAD蛋白处理75天后处死的DBA/1J小鼠的关节炎关节中降钓素受体的免疫组织化学的代表性显孩t照片。浅色阴影箭头标明了阳性染色(在原始彩色切片中为褐色)(b)PLAD蛋白在体外的TNF-ct诱导的破骨细胞生成中嘚作用。用M-CSF和小鼠TNF-ot(10iug)、小鼠TNF-ot(10pg)力口32jagP60PLAD或PBS培养的骨髓巨噬细胞(B應)中TRAP-阳性破骨细胞的显微照片浅色阴影箭头标明了耐酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)阳性》皮骨细4包。对用所示不同剂量的P60PLAD蛋白处理7^B謹培养物的每个孔中的TRAP-阳性细胞的定量，用显孩i镜测定(c)用胶原初次免疫然后用PBS、P60PLAD蛋白处理75天后處死的DBA/1J小鼠的关节炎关节中，RANK和RANKL染色的免疫组织化学的显孩i照片深色(在原始彩色切片中为褐色)染色部分表示阳性染色细胞。图16示出了标准的单字母代码形式的人PLAD-GST融M白的g,列(a)所示^EL体和下划线(M酸g230-282)为P60PLAD肽序列(SEQIDNO:59)。(b)所示粗^体和下划线CtJ^酸戎基230-274)为P80PLAD肽序列(SEQIDNO:60)这两部分中以纯文本形式给出的是GST疍白序列。图17示出了P60PLAD蛋白对L929细胞中TNF-oc诱导的细胞死亡的作用用下列试剂处理了19个小时的细胞的相差显微照片(a)单独的培养基；(b)人TNF-a(2ng);(c)P60PLAD(3yg)+hTNF-oc(2ng);(d)P60PLAD(30jag)十hTNF-a(2ng);(e)英夫利昔單抗(1mg)+hTNF-ot(2ng);(f)依那西普(1jug)+hTNF-a(2ng);(g)P80PLAD(30/ag)+hTNF-a(2ng)。400倍放大;(h)在存在或不存在P60PLAD(50|ig)、依那西普(1jig)和英夫利昔单抗(1Jig)的情况下由hTNF(2ng)诱导的L929细胞的消亡。图18示出了GST蛋白和P80PLAD蛋白对炎性关节炎的莋用(a)单独用TNF-a(45ng)(TNF)或TNF-a(45ng)加GST蛋白(GST，100|ag)处理的BALB/c小鼠实验组(11=5)中滑膜炎、血管翳以及骨和软骨组织的定量组织分析；(b)在C3H/HeJ小鼠中单独4吏用CpGDNA(lnM)(CpG)或CpGDNA(lnM)加P80PLAD蛋白(P80,100pg)数值为平均值士标准差。在关节内接种后3天将小鼠处死以便进行组织病理学检查结果^4了三次实验。(c)H&E染色切片的显微照片示出了进行了为期4周的P80PLAD疍白(100jig)的J^M内注射的初次免疫后75天的CIA关节的炎症和破坏。200倍放大(d)用P80PLAD蛋白处理4周的DBA/1J小鼠的CIA中滑膜炎、血管翳以及骨和软骨侵蚀的定量组织分析。与对照组相比P〉0.05图19示出了免疫组织化学的显微照片。(a)6个月时处死的TNF-oc转基因小鼠关节炎关节中的TNFR1和TNFR2TNFR1图中的箭头标出了表明受体表达的罙色染色部分(在原始彩色切片中为褐色)。TNFR2图中的箭头标明了软骨深部的软骨细胞的高TNFR2表达(b)6个月大时处死的TNF-oc转基因小鼠的关节炎关节中的鉯;SJ寸照C57BL/6小鼠的使泉关节中的降4丐素受体。(c)6个月大时处死的TNF-cc转基因小鼠的关节炎关节中以;Sjt常对照C57BL/6小鼠的健康关节中的RANK和RANKL染色深色(在原始彩銫切片中为褐色)染色表示阳性组织化学反应。300倍;改大图20示出了P60PLAD蛋白的免疫原性和半衰期。(a)基于从用胶原初次免疫然后用PBS、P60或P80PLAD蛋白处理后75忝处死的DBA/1小鼠血清中纯化的PLAD蛋白与标准曲线相比的抗-PLADP60抗体水平。GST+是指加入GST以便从血清中去除GST抗体(b)P60PLAD蛋白的半衰期。(c)P80PLAD蛋白的半衰期图21示絀了PLAD蛋白可抑制TNF-oc诱导的IkBcc降解。蛋白质印迹示出了在存在或不存在P60(10、50、100pg)或P80(10、50、100yg)的情况下在体外用mTNF-a(2ng)处3g^TNFR1或TNFR2敲除(-/-)小鼠脾脏分离出的单核细胞5分钟(b)、15分钟(a)或者在存在或不存在GST(lO、50、100pg)的情况下，用mTNF-a(2ng)处理这些细胞l小时(c)后这些细胞中的IkBoc降图22示出了用不同量的斜I5西普和P60PLAD蛋白来免疫沉淀(IP)的50ng人TNF-ot的凝胶电泳。(a)所示的依那西普(10pg)或P60PLAD蛋白(100g)(测试蛋白)(b)所示的^^西普(0.1、1、10yg)或P60PLAD蛋白(O.1、1、lOjag)(测试蛋白)。箭头标明了TNF蛋白在^MJi的位置用抗TNF-oc抗体(Ab)进行蛋白质印迹。图23示出了TNFR1晶体结构(PDBID:1NCF)中二聚化的PLAD部分深灰部分和浅灰部分表示PLAD二聚体的单个肽链。圆圈中标出了每个肽中His-34的镜像(mirror)咪哇环这些^i且氨酸在鏈间袋中互相固定。图24示出了与,西普^/^的P80PLAD蛋白的免疫沉淀(IP)和蛋白质印迹(WB)图25示出了P60-PLAD蛋白可抑制CIA中的MMP表达。注:左图中深色(在原始彩色切片中为褐色)染色部分表示MMP表达图26示出了P60-PLAD蛋白可抑制CIA中的iNOS表达。注左图中深色(在原始彩色切片中为褐色)染色部分表示iNOS表达具体实施方式参照下攵中关于本发明优选实施方案和其中所含实施例的详细描述，并参照附图和关于它们的在上文和下文中的描述可以更容易地理解本发明。根据上下文说明书和权利要求中所用的"一，可以表示一个(种)或多个(种)。因此例如，提及"一种核酸"时是指使用了至少一种核酸多肽本发明提供了一种包括前配体装配域(PLAD)的分离的氨基酸序列的多肽。本发明还提供了一种由前配体装配域的M酸序列组成的多肽本发明的PLAD鈳以是TNF-R的PLAD、p60的PLAD、p80的PLAD、Fas(CD95/APO-l)的PLAD、TRAIL的PLAD、LTPR的PLAD、CD40的PLAD、CD30的PLAD、CD27的PLAD、HVEM的PLAD、0X40的PLAD、DR4的PLAD或TNFR超家族成员的任何其它PLAD结构域。由于PLAD结构域在TNFR超家族成员中是高度保守的垨基序来鉴定任何TNF受体的PLAD结构域。TNF受体样受体中这些区域的鉴定是.通#文4^供的示例性PLAD序列以^J阵它们与该家族其它成员公开序列进行比较来以瑺规手段完成的(例如参见图3)。此外本领域技术人员也应该能够通过进行功能测定(例如实施例中所提供的功能测幻来鉴定PLAD。在一个实施方案中所述功能性PLAD不是Fas/CD59的PLAD(83)。在另一个实施方案中所述功能性PLAD不是Fas/CD59受(^末端的49个氨基酸(83)。本文所提供的PLAD可以仅包括成熟的TNF受体样受体N-末端嘚38个氨基酸成熟的TNF受体样受体是不含信号序列的TNF受体样受体。序列表中公开了PLAD的实例该序列表包括含有其信号序列的頂F受>^#受体实例的M酸序列。参照表1中列出的这些TNF受^#受体的GenBank射己号可以找到各个受体的信号序列残基因此，所给的序列中公开了成熟TNF受体样受体及其对应PLAD的序列表3提供了关于本文所公开的TNF受体样受体和受体配体的附加信息。它还提供了关于分离的PLAD以及含有本文所公开的分离的PLAD的多肽的用途嘚信息所述PLAD可^JI来研究干扰TNFR超家族受体介导的信号传导途径的意义。例如如果经由TNFR超家族受体的信号传导是已知的或被证明与疾病途径楿关，则通过本发明的多肽抑制受体的前g己体装配可以治疗获预防该疾病例如，可净皮治疗的疾病包括癌症、心脏病和炎性疾病PLAD的修飾也会改变配体/受体相互作用的亲和力，这可被用于体夕卜研究例如测量配体和受体的结合、受体信号等。荧光标记的PLAD蛋白也可净皮用莋通过流式细胞术或荧光显孩沐来确定细胞表面上特异性TNFR相对表达时的试剂4^发明还4^供了^、有分离的PLAD的38至125个氨基酸的多肽。例如所述肽鈳以是含有分离的PLAD的50至125个氨基酸的多肽。在一个进一步的实例中所述多肽可以包括子序列R广TNF受僻^羊受体PLAD-R2,其中R!和R2是任选的，当存在时它们鈳以是H、絲、NH2、絲酸或肽当存在时，&和/或R2可以是^f可M酸当Ri和/或R2;Ui时，该肽的长^l:可变的例如，Ri和/或R2的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个絲酸只要含有分离的TNF样PLAD的整个肽不超过125个M酸g，而且其长度可以是38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124或125个絲酸R1和R2也可以是TNF受伟样受体的序列，所*列一^位于天然存在的TNF受>(^#受体中TNF受体样受体PLAD的侧面其中所述含有TNF樣受体PLAD的多肽并不是TNF受体样受体的整个胞外结构域。本发明进一步提供了任何大小的多肽包括TNF受体样受体的前配体装配域(PLAD)的分离的氨基酸序列，其中所述多肽为Rl-TNF受体样受体PLAD-R2,其中Rl或R2包括不位于天然存在的TNF受体样受体中TNF受体样受体PLAD侧面的tt酸序列Rl或R2(但并非两者同时)可以是TNF受体樣受体的全部或部分序列，所述序列通常位于天然存在的TNF受*受体中TNF样PLAD的侧面例如，PLAD可以来自TNF受体样受体且R1或R2可以是不存在于所述TNF受体样受体中或任何其它TNF受体样受体中的M酸序列所述多肽的TNF样PLAD来自于所述TNF受体样受体。Rl或R2可以是任何的氨基酸序列只要R1-TNF样PLAD-R2不^然存在的全长TNF受體样受体。在另一个实例中PLAD可以来自TNF受体样受体且Rl或R2或两者，如果存在的话可以是来自另一个TNF受^#受体的^列。因此本领域技术人员可鉯将一个TNF受^#受体的PLAD与来自一个不同的TNF受体冲羊受体的Rl或R2序列结*来以获得这种多肽。由于已知的TNF受4^羊受体的序列是可公开获得的所以本发奣的多肽的Rl和R2的结构4艮多，但也是已知的并被本文所考虑或者，Rl或R2可以是不与任何TNF受^f羊受体序列相关的^列在一个实施方案中，所述含囿分离的PLAD的多肽不是美国专利5633，145(Feldmanetal.)中所v^开的成熟(不含信号序列)TNF1受体的124个虔基酸的序列^^有上述子序列的多肽的实例包括R厂成熟p60的第1-38、1-39、1-40、1—41、1-42、1—43、1-44、1-45、1—46、1-47、1-48、1-49、1—50、1—51、1-52、1-53或1-54位M酸-R2(例如SEQIDNO:1);R广成熟p80的第10-48、10-49、10-50、10-51、10-52、10-53或10-54位#^酸-112(SEQIDNO:2);R「成熟Fas的第1-38、1-39、1-40、1-41、1-42或1-43位絲酸-112(SEQIDNO:3);R厂成熟Fas的第1—38、1—39、1-40、1—41、1-42、1-43、1-44、1-45、1-46、1-47、1-48、1-49、1-50、1-51、1-52、1-53、1-54、1-55、1-56、1-57、1-58、1-59、1-60、1-61、1-62、1-63、1-64、1-65或1-66位絲酸-R2(SEQIDNO:4);R广成熟LtpR的第13-50位絲酸-R2(SEQIDNO:5);R厂成熟CD40的第6-39位絲酸-R2(SEQIDNO:6);R厂成熟CD30的第11-49、11-50或11-51位絲酸-&(SEQIDNO:7);R厂成熟CD27的第7-42位氨基酸-R2(SEQIDNO:8)，R广成熟HVEM的第6-37位絲酸-FUSEQIDNO:9);R广成熟0X40的第3-36位絲酸-R2(SEQIDNO:10)以及R厂成熟DR4的第109-138位M酸-FUSEQIDNO:11)成熟p60(TNFR1)多a始于祐耒示为SEQIDNO:12的全长p60编码序列的第30位。因此本发明提供了一种含有成熟p60蛋白的第l-M位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的30-83位絲酌、一种含有成熟p60蛋白的第1-53位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-82位M酌、一种含有成熟p60蛋白的1-52位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-81位M酌、一种含有成熟p60蛋白的第1-51位M酸的多肽(SEQIDN0:12的第30-80位M酌、一种含有成熟p60蛋白的第l-50位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-79位婁l船、一种含有成熟p60蛋白的第l-49位氨基酸嘚多肽(SEQIDNO:12的第30-78位#^酌、一种含有成熟p60蛋白的第l-48位M酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-77位J^酌、一种含有成熟p60蛋白的第1-47位#^酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-76位絲紛、一种含有成熟p60蛋白的第1-46位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-75位絲酌、一种含有成熟p60蛋白的第1-45位M酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-74位M酌、一种含有成熟p60蛋白的第l-44位氨基酸的多肽(SEQIDN0:12的第30-73位M酌、一种含有成熟p60疍白的第1-43位M酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-72位tt酌、一种含有成熟p60蛋白的第l-42位絲酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-71位M酌、一种含有成熟p60蛋白的第1-41位M酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-70位M酌、一种含有成熟p60蛋白的第1-40位氨基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-69位M紛、一种含有成熟p60蛋白的第1-39位萄基酸的多肽(SEQIDNO:12的第30-68位M酌以及其它含有成熟p60蛋白的保持了PLAD活性的第l-54位氨基酸爿段的多肽。成熟p80(TNFR2)多A^始于被表示为SEQIDNO:13的全长p80编码序列的第23位因此，本发明提供了一种含有成熟p80蛋白的第10-54位M酸的多肽(SEQIDNO:13的第32-76位M酌、一种含有成熟p80蛋白的第10-53位氨基酸的多肽(SEQIDNO:13的第32-75位M酌、一种含有成熟p80蛋白的第10-52位絲酸的多肽(SEQIDNO:13的第32-74位絲酌、一种含有成熟p80蛋白的第10-51位絲酸的多肽(SEQIDN0:13的第32-73位M酌、┅种含有成熟p80蛋白的第10-50位M酸的多肽(SEQIDNO:13的第32-72位M酌以及其它含有成熟p80蛋白的保持了PLAD活性的第10-54位M酸片段的多肽成熟Fas受体多^始于被表示为SEQIDNO:14的全长Fas编碼序列的第17位。因此本发明提供了一种含有成熟Fas蛋白的第位#^酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-59位絲酌、一种含有成熟Fas蛋白的第1-42位氨基酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-58位#^酌、一種含有成熟Fas蛋白的1-41位氨基酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-57位M紛、一种含有成熟Fas蛋白的第1-40位絲酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-56位M酌、一种含有成熟Fas蛋白的第1-39位g酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-55位M酌鉯及其它含有成熟Fas蛋白的保持了PLAD活性的第1-43位氨基酸片段的多狀。本发明还提供了一种含有成熟Fas蛋白的第l-66位M酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-82位^J^酌、一种含有成熟Fas蛋白的第1-65位M酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-81位絲船、一种含有成熟Fas蛋白的第1-64位^J-酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-80位絲酌、一种含有成熟Fas蛋白的第1-63位氨基酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-79位M酌、一種含有成熟Fas蛋白的第1-62位氨基酸的多肽(SEQIDNO:14的第17-78位M酌以及其它含有成熟Fas蛋白的保持了PLAD活性的第1-66位氨基酸片段的多肽本发明还提供了一种含有^L4示為SEQIDNO:15的全长LTPR蛋白的第43-80位M酸的多肽以及其它含有SEQIDNO:15的保持了PLAD活性的第43-80位M酸片段的多肽。本发明还提供了一种含有^^示为SEQIDNO:16的全长CD40蛋白的26-59位M酸的多肽以忣其它含有SEQIDNO:16的保特了PLAD活性的第26-59位J^酸片段的多肽成熟CD30多Jlk^始于被表示为SEQIDNO:17的全长CD30编码序列的第19位。因此本发明提供了一种含有成熟CD30蛋白的第11-51位氨基酸的多肽(SEQIDNO:17的29-69位M酌、一种含有成熟CD30蛋白的第11-50位M酸的多肽(SEQIDNO:17的29-68位^J^酌、一种含有成熟CD30蛋白的第11-49位氨基酸的多肽(SEQIDNO:17的第29-67位M酌、一种含有成熟CD30蛋白嘚第11-48位M酸的多肽(SEQIDNO:17的第29-66位M酌、一种含有成熟CD30蛋白的11-47位M酸的多肽(SEQIDNO:17的第29-65位M酌以及其它含有成熟CD30蛋白的保持了PLAD活性的第11-51位M酸片段的多肽。本发明还提供了一种含有^il4示为SEQIDNO:18的全长CD27蛋白的第27-62位M酸的多肽以及其它含有SEQIDNO:18的保持了PLAD活性的第27-62位M酸片段的多肽本发明还提供了一种含有被表示为SEQIDNO:19的全長HVEM蛋白的第42-75位氨基酸的多肽以及其它包含含有SEQIDNO:19的保持了PLAD活性的42-75位M酸的多肽片段的多肽。成熟0X40多J!^始于祐耒示为SEQIDNO:20的全长0X40编码序列的第29位因此，本发明提供了一种含有成熟0X40蛋白的第3-36位M酸的多肽(SEQIDNO:20的第31-64位M酌、一种含有成熟0X40蛋白的3-35位絲酸的多肽(SEQIDNO:20的第31-63位絲酌、一种含有成熟0X40蛋白的3-34位氨基酸的多肽(SEQIDNO:20的第31-62位M劇、一种含有成熟0X40蛋白的3-33位g酸的多肽(SEQIDNO:20的第31-61位M酌、一种含有成熟CD30蛋白的第3-32位氨基酸的多肽(SEQIDNO:20的第31-60位以及其它包含含有成熟0X40蛋白嘚保持了PLAD活性的第3-36位氨基酸的多肽片段的多肽本发明还提供了一种含有^L4示为SEQIDNO:21的全长DR4蛋白的第132-170位氨基酸的多肽以;^其它包含^^有SEQIDNO:21的保持了PLAD活性嘚第132-170位M酸的多肽片段的多肽。表1列举了含有本发明的PLAD的TNF受体样受体的实例根据表1中列出GenBank躬己号可以找到这些受体的核苷酸和多M列。根据表1中列出GenBank躬己号所示出的核苦酸序列、多肽序列以及^f^f可信息(例如信号序列和成熟蛋白歹MJ^O的全部内容通过引用的方式纳入本说明书例如，根据GenBank躬己号M75866可以找到p60的核苦酸序列、多肽序列和附加信息(例如信号序列和成熟蛋白残基奶根据GenBank躬己号M75866所示的这些p60序列和附加信息的全部內容通过引用的方式纳入本说明书。类似地根据GenBank&己号M32315可以找到4十对p80所示出的核苷酸序列、多肽序列和附加信息(例如信号序列和成熟蛋白殘基奶。根据GenBank射己号M32315所示出的这些p80序列和附加信息全部通过引用的方式纳^^说明书通过访问表l中列出的GenBank躬己号，本领域技术人员可以访问箌其中列出的附加GenBank躬己号以获得与信号序列和成熟蛋白序列相关的附加信息例如，当访问GenBank射己号M75866时本领域技术人员可以访问到表示p60的信号序列和成熟蛋白序列信息的GenBank射己号AAA61201。该信息也可通过直^访问GenBank射己号AAA51201(p60)、GenBank躬己号AAA59929(p80)、GenBank射己号AAA63174(Fas)、GenBank射己号AAA36757(LTBR)、GenBank射己号CAA43045(CD40)、GenBank射己号AAA51947(CD30)、GenBank躬己号AAA58411(CD27)、GenBank射己号AAB58354、GenBank躬己号CAA)、GenBank躬己号AAC51226(DR4)找到该信息通过引用的方式纳入本说明书。表1还提供了TNF样受体的LocusLink射己号现在LocusLink射己号等同于在美国国立医学图书馆的美國国家生物^支术信息中心可以访问到的EntrezGene识别号(GeneID号)。例如本领J^^支术人员可以通过访问EntrezGene数据库中的LocusLink号7132(3脉为EntrezGene中的GeneID7132)获得关于p60的附加信息，包括核苷酸和蛋白序列类似地，本领域技术人员可以通过访问EntrezGene数据库中的LocusLink号7133(现在为EntrezGene中的GeneID7133)获得关于p80的附加信息包括核苦酸和蛋白序列。因此夲领域技术人员通过访问表l中所列的4^f可TNF样受体在EntrezGene中的相应LocusLink(GeneID)号可以#^1易地获得与它们相关的信息。所有根据表l中列出的LocusLink(GeneID)号提供的信息的4^P内絲过引用的方式纳入^^i兌明书提供了含有vTNFR蛋白PLAD结构域的分离的J^^列的多肽(SEQIDNO:28-39)。可以4吏用蛋白-蛋白BLAST数据库的用于TNFR1和TNFR2PLAD序列的同源搜索来鉴定其它vTNFRPLAD也包括每种vTNFR及其修饰蛋白的全长絲蔣列(SEQIDNO:44—55)。还提供了可被本领域技术人员用iMt其他vTNFRPLAD多肽进行鉴定、生产和功能测试的方法等vTNFRPLAD结构域可以中断宿主TNFR的自締合和/或随后的配体结合以抑制抗病毒免疫和/或保护感染的细胞免遭TNF介导的细胞死亡。M-T2蛋白---种由粘液瘤病毒编码的TNF受>^#蛋白一一可以保护粘液瘤感染的T细胞免遭TNF诱导的死亡并且不^其胞外TNF结合能力(82)由于针对与宿主TNFRPLAD结构域结合的较高亲和力的进化选择，vTNFRPLAD序列可以用作比P60或P80PLAD夲身更有效的TNF诱导作用抑制剂在这点上，分离的病毒PLAD蛋白代表了用于阻断与类风湿性关节炎和其他自身免疫性疾病相关的TNF-相关发病的临床应用的改良试剂应该理解的是，例如本文所述的这些技术可被用于鉴定其它的微生物蛋白，所述蛋白与本文所述其它TNF受体样受体(例洳Fas)中存在的PLAD结构域具有同源性例如公开了含有与所述FasPLAD结构域(SEQIDNO.41-43，56-58)同源的序列的微:生物多肽的三个实例本文所用的"PLAD的分离的M齡列"是指M上不含在自然界中通常与所述M酸序列相关的天然存在的物质的序列。本发明的多肽可以包括具有PLAD活性的PLAD结构域或其片段的整个M酸序列本发明嘚多M其片段可通it^细胞中分离和纯化所述多肽来获得，其中这些多肽可天然产生或通it4iii^码PLAD的外源核g产生PLAD的片段可以通过肽的化学合成、通过PLAD戓含有PLAD的多肽的蛋白水解切割以及通过用编码目的部分的核酸合成来获得。所述PLAD可以包括保守性置换其中天然存在的氨基酸被具有类似性质的氨基酸所置换。这类保守性置换不会改变该多肽的功能通过产生各种氨基酸置换并iL4说明书中所述的结合测定中使用本领域普通技術人员可利用的技术对它们进行测试可以找到能增强结合和有效性的突变。因此应该理解的是，如果需要可以在编码本发明多肽的核酸和/或本发明多肽的^J^酸序列中进行修饰和改变并且仍获得具有类似的或所需的特征的多肽。这类改变可以存在于天然分离物中或者可以利鼡定点突变来通过合成手段引入其方法(如错配聚合絲iUJl(PCR))在本领域中是已知的。例如多肽中的某些M酸可以净皮其它氨基酸置换，同时没有奣显的功能活性损失因此，应该考虑到可以在所述PLAD的JIJ^酸序列(或其基础核酸序列)中制造各种改变同时没有明显的生物效用或活性损失并苴这些效用或活性还可能增加。例如p60TNFR天然序列中的Q24A突变、D49R突变和K19E突变不^有损PLAD的自締合。这些多肽也可以用本领域熟知的许多方法中的任哬方法来获得一种产生多肽的方法是利用蛋白质化学技术来将两种肽或多M接起来。例如可以通过Fmoc(9-芴曱氧mO或Boc(叔丁氧J^O化学，利用现在可获嘚的实验室4义器来化学合成肽或多肽(AppliedBiosystemsInc.,FosterCity,CA)。本领域技术人员可以#^易地认识到可以通过标准的化学^来合^目当于特定蛋白的肽或多肽例如，可鉯一种合成肽或多肽并且不将它从其合成树脂上切下来同时可以合成一种杂合肽的另一片段并I^将它从所述树脂上切下来，从而暴露出该叧一个片段上被功能性封闭的末端基团利用肽缩合反应，可以分别通itit些两片段的g和M末端的肽键将它们共价连4!"起来形成较大的多肽(Grant,ASyntheticP印tides:AUserGuide,W.H.FreemanandCo.N.Y.(1992)和BodanskyandTrost,Ed"PrinciplesofPeptideSynthesis,Springer-VerlagInc.,N.Y.(1993))。或者如上所述，可以在体内独立地合成所述肽或多肽一旦分离，则可以通过类似的肽缩^^M将这些独立的肽或多肽连^^形成较大的蛋白唎如，克隆的或合成的肽区段的SI^连接可使得能够将相对短的肽片段连接起来以产生较大的肽片段、多肽或全蛋白结构域C^w/z^e/7Wa/.Biochemistry,30:))或者，可以利用匼成肽的天然化学连接来通过合成方法由较短的肽片段构建较大的肽或多肽该方法由两步化学Jl^组成(/feH^0/7e/"a/.ASynthesisofProteinsbyNativeChemicalLigation,Science,266:776-779(1994))。第一步是无保护的合成肽-%-疏酯与另┅种含#^末端Cys残基的无保护肽区段进行化学选择反应以产生作为初始共价产物的硫酯连接性中间产物在不改变反应条件的情况下，该中间產物经历了自发的快速分子内反应从而在连接位置形成天然肽键这种天然化学连接方法在蛋白分子全合成过程中的应用可通it^白细胞介素8(IL-8)嘚制备来i兌明(67a,i-Zew7ia/.FEBSLett.，307:97(1987)6VarHew^y"a/,J.Biol.Chem.，269:)C/ayir-Zew^ya/.Biochemistry,30:),和ia力ra^/a迈Wa/.Biochemistry,29:))。或者无保护的肽区段可以是化学连接的，其中由于化学连接而在所述肽区段之间形成的键是非天然键(非肽键)CSt力加/zera/.Science,256:221(1992))这种技术已经被用来合成蛋白结构域的类似物以及大量具有完全生物活性的相对较纯的蛋白(f/eZ/Wea/.ATechniquesinProteinChemistryIV，AcademicPress,NewYork,pp.257-267(1992))本发明还提供了用于所公开多肽的g拟物。"g拟物"被定义为包括化合物或有机分子或任何其它肽才莫拟物其结构是基于或书f生自蛋白的结合区域。例如人们可以建立预測化学结构的模型以模拟结合区域(如PLAD)的结构，可以使用标准方法来进行这种建模。或者也可以以和所述肽大致相同的方式来从组合化學文库中选择肽模拟物(Ostresh，J.M.a丄Jcad5t/做j1994Nov8;91(23):11138-42;Dorner,B.a/.，A/oow#ecTC力e迈1996May;4(5):709—15;EichlerJ."a人，1995Nov;15(6):481-96;BlondelleS.E."a厶5/oc力柳/1996Jan1;313(Pt1):141—7;Perez—Paya，E.a/.,/A/o/C力e迈1996Feb23;271(8):4120-6)也可以利用功能测定iM^择Ab^拟物。本发明的多肽可与另一部分例如核酸、蛋白、肽、配体、糖部分、病毒蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体或脂质体相连接此外，也可以将两个或多个含PLAD的多肽彼jtbf目连接例如，可以制名^^有两个或多个不同PLAD的双功能或多功能多肽以使得所述多肽能够调节多种TNF受>^#受体的活性所述多肽也可以含有两个或多个源自相哃TNF受^#受体的PLAD以增加这种多M"特定TNF受^#受体的亲合力。含PLAD的融^^构j^体本文公开了含PLAD的融合蛋白和编码它们的核酸所述融合蛋白可以包括本文所公開的连接了融合标签的TNF受体样受体PLAD。所述功能分子可以是抗体或其靶向部分或其它融合标签由于PLAD是在细I^面上的，所以所组成部分例如，非TNF受^^羊标志物的配体的标志物结^P分可以与PLAD融合所述标志物位于指定的靶细胞的表面。所述PLAD可以与各种载体蛋白例如免疫球蛋白或其它血清、可溶的和/或稳定的蛋白融合所述融合标签可以是GST或其它有助于所述融^白纯化的分子。含PLAD的融^白可以包括有助于重组表达的PLAD分泌的信号序列也可以将编码包括PLAD或由PLAD组成的多肽的核酸与其它核酸功能性地连接以编码免疫粘合素。对本发明来i兌术语"免疫粘合素"被定义為包括任何由核酸编码的多肽，其中编码非免疫球蛋白分子(例如PLAD)的核酸的至少一部分与编码免疫球蛋白重链多肽(例如IgG)的核酸的至少"-^分偶联IgG2、IgG3、IgM、IgA、IgE的Fc区也可^UUiM^^疫津t^素。在一个具体的实例中所述融合蛋白包括与IgFc区部分一一特别是IgY4的Fc区部分一一融合的PLAD,。所述偶联是通过一种确保所述核酸片段能进行功能性转录⑩译并提供从其中分别获得的信息的方式来实现的可以通#各种哺乳动物宿主细胞以及杆状病毒感染的細胞中的瞬时或稳定转染来表达PLAD多肽融合蛋白。所表达的融M白可以根据标准方法来纯化与抗体类似，IgG免疫粘合素可以通过一步蛋白A或蛋皛G亲和色语从被分泌了该免疫津給素的培养基中纯化出来转基因提供了编码PLAD的转基因。"转基因，是指被^MlA为地插入到细胞中并成为该细胞及其子代细胞基因组的一部分的核酸序列对于所述细胞来说，该转基因可以是(但不一定;U部分或完全异源的(例如来自不同的物种)。术語"转基因"宽^J也指被导入到动物基因组中的^f可核酸包括但不限于含有通常可能不存在于所述基因组中的序列的基因或DNA、在给定基因组中存茬但通常不会被转录和翻译(表达)的基因或者人们希望导入到所述基因组中的4封可其它基因或DNA。这可包括可能通常存在于非转基因基因組中泹是人们希望改变其表达或者是人们希望以改变或变体形式导入的基因转基因可以包括一种或多种转录调控序列和可能是所选定的核酸嘚最佳表达所需的任何其它核酸，例如内含子转基因可以只有两个核苷酸长，但是优选地至少约50、100、150、200、250、300、350、400或500个核苷酸长或甚至更長转基因可以是编码或非编码序列或者其组合。转基因通常包括能够在适当M下促使一种或多种转基因表达的调控元件抗体本发明还提供了与TNF受体样受体的PLAD特异性结合的抗体。例如本发明的抗体可以是与TNF受体的PLAD特异性结合的抗体、与FAS的PLAD特异性结合的抗体或与DR4的PLAD特异性结匼的抗体，仅举这些为例所述抗体(多克隆或单克隆)可以是指本文所提供的何所考虑到的任何多肽，天然存在的和重组的多M其免疫源片段所述抗体可净皮用于例如诊断、治疗或疫苗接种等技术或方法中。也考虑到了抗-个体基因型抗体和亲和力成熟抗体可以通过许多熟知嘚方法来制备抗体(例如，参见a/w/Za/e"Antibodies;ALaboratoryManual"ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,(1988))。简言之以足以引出免M答的量和间隔将纯化的抗原注射到动物体内。抗体可以是直接纯化的或者脾细胞鈳以是从动物体内获得的然后可以将所述细胞与无限增殖细胞系融合并且筛选抗体分泌。所述抗体可用来筛选可分泌该抗原的细胞的核酸克隆文库然后对这些阳性克隆进行测序(例如，参见Kellyeta/.A/0/rec力/70/0^710:163—167(1992);&^//7^0/7Wa人Ar'o/7fec力加/^7，10:169—175(1992))本发明也考虑了人源化抗体和嵌合抗体。可以通过熟知的方法來制备异源抗体(例如参见美国专利5545806、5569825、5625126、5633425、5661016、5770429、5789650和5814318)。术语与多肽"特异性结合"是指可确定在一群异源蛋白和其他生物制品中是否存在所述疍白的一种结合反应因此，在指定的免疫测定条件下与特定蛋白结合的特定抗体不与样品中的其它蛋白以显著量结合。在这类M下与忼体的选择性结合可能会需要根据它对特定蛋白的特异性而被选出的抗体。可以使用各种免疫测定形式来选择会与特定蛋白选择性结合的忼体例如，通常使用固相ELISA免疫测定法^择可选择性地与蛋白进行免^L^应的抗体关于可被用来确定选择性结合的免疫测定形式和条件的描述請参见泡r/owa/"a/e"Antibodies,ALaboratoryManual"ColdSpringHarborPublications,NewYork,(1988)。核酸本发明还提供了编码最长达125个氨基酸的多肽的核酸所述多肽含有TNF受体样受体的PLAD;以及提供了编码由TNF受体样受体PLAD组成的多肽嘚核酸。本发明还提供了编码最长达125个氨基酸的多肽的核酸所述多肽含有分离的PLAD,其中所述多肽含有子序列R广PLAD-R2，其中H和&是^^的并且当存在時，它们可以是H、、NH2、^J^酸和肽本发明进一步提供了编码这样一种多肽的核酸，所述多肽含有TNF受体样受体的前配体装配域(PLAD)的分离的M酸序列其中所述多肽为R广TNF受体样受体PLAD-R2，其中R!或R2包括不位于天然存在的TNF受体样受体中TNF受体样受体PLAD侧面的M酸序列本文所用术语"核酸"是指可以是DNA或RNA戓其4^f可组合的单链或多链分子，包括对这些核酸的修饰所述核酸可以代表编码链或其互4喊或其任何组合。核酸的序列可以与本文所讨论嘚任何新基因的天然存在序列相同或者可以包括编码与天然存在序列中发现的M酸一样的氨基酸的备选密码子也可以对这些核酸的典型结構进行修饰。这些修饰包括但不限于曱基化核酸、将磷酸残基上的未桥接氧用硫(产生硫代磷自氧核苷酌、硒(产生硒代磷酸(phosphorselenoate)脱氧核苷酌或曱基基团(产生曱基膦皿氧核可以从通常存在编码PLAD的核酸分子的生物体中将其分离例如，可以构建基因组DM或cDNA文库并筛选目的核M否存在构建囷筛选这类M的方法是本领域中已知的，用于进行所述构建和筛选步骤的试剂盒是市售的('H口，StratageneCloningSystems,LaJollaCA)。一旦分离就可以将所述核酸直接克隆箌适当的载体中，或者如果需要的话可以对其进行修饰以帮助后续的克隆步骤。这些修饰步骤是常规的一个实例是在所述核酸末端加叺含有限制性位点的寡核苷酸接头。i^迈6/w^efa/.,"MolecularCloning,aLaboratoryManual,"ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)中阐述了-"^:的方法本发明也考虑了编码PLAD的不含配体结合位点的核酸。一^SJ^得了所需的PLAD的核酸序列就鈳以利用本领域中已知的技^任何具体的tt酸位置对编码特定氨基酸的序列进行修饰或改变。例如可以设计跨越所述一个或多个g酸位置的以>^任何#^酸可#:另一种氨基酸置换的PCR引物。然后可以扩增核酸并将其插入到野生型PLAD编码序列中以获得在所述PLAD的任何位置上的氨基酸的许多可能组匼的任一种或者，本领域技术人员可以通过点突变技术在特定核酸序列中的任何位点引入特定的突变5fe"力，M"Invitromutagenesis"Ann.Rev.Gen.19:423-462(1985)和ZoZ/er,i/."Newmolecularbiologymethodsforproteinengineering"Curr.Opin.Struct.Biol.，1:605-610(1991)中阐述了一般的方法这些技术可^^1来改变编码序列而不改变所编码的M酸序列。一种获得编码PLAD的DNA分子的方法的另一个实例是^^成编码所述PLAD的重组DNA分子例如，寡肽匼成方法在是本领域中常规的用于编码特定蛋白区域的寡核苷^UL^易通过自动DNA合成来获得的。可以合成双链分子一条涟的核酸并且使其与它嘚互^喊杂交Ail']可以i殳计这些寡核苷酸^吏得所得的双链分子具有内部P艮制性位点或在末端含有适当的5，或3突出端以克隆到适当的载体内。通过下述方法可以#^易地合成编码相对较大的蛋白的双链分子首先构建几种不同的编码所述蛋白特定区域的双链分子之后将这些廳^"连接在-"^。例如C画/./^A2迈，e"丄"Rec印torandAntibodyEpitopesinHumanGrowthHormoneIdentifiedbyHomolog-ScanningMutagenesis,"Science,243:89)已经通过首先构建重叠和互补的合成寡核苷酸并将这些片段连接起^而构建了编码人生长激素基因的合^&因。也可参见ferre"/a/.，Proc.Nat.Acad.Sci.82:599—603(1986)其中/^开了用合成的寡核苷^L合成1057个絲对的合成的牛视紫红质基因。通过以这种方式构建PLAD,本领域技术人员可以;f膝易地获;^f壬何特定的PLAD所述PLAD在PLAD内的任何一个或多个特定位置上具有所需氨基酸。也参见美国专利5503,995,所述专利描述了一种制*成基因的酶模;^1>^应方法。这类技术在本领域中是常规的并且是有详尽记录的然后可以按照下文所^体内或体外表iiii些核酸或编码PLAD的核酸片段。本发明还提供了编码PLAD的分离的核酸所述核酸位于适合于表达它的载体中。一旦对编码特定的目的PLAD的核酸或该核酸的一个区域进行构建、修饰或分离后就可以将该核^隆到适当嘚载体中，所述载体可以指导该野生型和/或修饰后PLAD的体内或体外合成考虑到了所述载体应具有指导和调控插入基因或核酸转录所需的功能元件。这些功能元件包括但不限于启动子、所述启动子的上下游区域例如可能会调控所述启动子转录活性的增强子、复制起点、有助于所述启动子附近的插入片段克隆的适当的限制性位点、抗生素抗性基因或能用来筛选含有所述载体或所述的含插入片段的载体的细胞的其咜标记、RNA剪接点、转录终止区或者能用来帮助所述插入基因或杂合基因表达的4^f可其它区(通常参见i^6rooi:efa人)丑co7/(;tM埃希氏菌Cfoc力er/c力/aco/i))表达载体。其它适^H^吏鼡的微生物宿主包括杆菌例如枯草杆菌(勘c///^以及其它肠杆菌(勘c///〃》例如沙门氏菌C^/MMey/a)、沙雷氏菌(5fem和名4f假单胞菌(AeW咖o加;y)种。在这些原核宿主中人們也可以制备表达载体，所ii^达载体通常含有与所述宿主细船目容的表达控制序列(例如复制起点)此夕卜，应存在^f可数量的各种已知启动子例如享Ut启动子系统、色氨酸(Trp)启动子系统、P-内,酶启动子系统或入噬菌体的启动子系统。所述启动子通常会控制表达任选地具有操纵子序列；并且应含有核糖体结合位点序列，例如用于启动并完成转录和翻译如果需要的话，可以通过插入5端Met密码子并符合读框地插入下游核酸插入物来提供^J^末端曱减氨酸。也可以使用标准的寡核苷酸突变方法iM多除核酸插入片段的^^末端延伸部分此外，可以使用酵母表达酵毋表达系统具有多种优势。首先有证据表明酵母分泌系统产生的蛋白呈现出具有正确的j^克键配对。其次翻译后糖基化是通过酵母分泌系统来有效地进行的。酿酒酵母CS^cc力aro迈ycescerew'w'ae)的前-原-oc因子前导区(由W-7基因编码)通常可^^l来指导酵母的蛋白分泌C&"We""，Alpha-Factor-DirectedSynthesisandSecretionofMatureForeignProteinsini^cc力aro,ce51cereWae.Proc.Nat.Acad.Sci.81:84))。前-原-oc因子的前导区含有信号肽囷原区段所ii^、区段包括由KEX2基因编码的酵母蛋白酶的识别序列这种酶可切割Lys-Arg二肽切割信号序列的g侧上的前体蛋白。所述核酸编码序列可以茬框内与所述前-原-ot因子的前导区融合然后将这种构建体置于强转录启动子例如乙醇脱氢酶I启动子或糖酵解启动子的控制之下，所述核酸编码序列之后是翻*止密码子，所述翻*止密码子之后是转录终止信号或者，所述核酸编码序列可以与另一种蛋白编码序列(如Sj26或p-半乳糖苷酶)融合以便于通过亲和色语来纯化所述融M白对于用于酵母表达的构建体来说，插入蛋白S^刀割位点来分离融M白的^^且成部分是可4亍的也可鉯在杆状病毒系统中实现有效的翻译后糖基化和重组蛋白表达。哺乳动物细胞能在有利于重要的翻译后修饰(例如折叠和半胱氨酸配对)的环境中表达蛋白、加入复杂的糖结构以及分泌活性蛋白用于在哺乳动物细胞中表达活性蛋白的载体以在强病毒启动子和多腺苷酸化信号之間插入了蛋白编码序列为特征。所述载体可以含有赋予了用于基因扩增的潮霉素抗性、庆大霉素或G418抗性的基因或者其它适^^被用作可筛选標记的基因或表型，或者的甲M呤抗性基因使用曱呤抗性编码栽体可以将所述嵌合蛋白编码序列导入到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中或者使用适匼的筛选标记将其导入到其他细胞系中。通过DNA印迹分析可以确证是否在转化的细胞中存在所述载体DNA通过RM印迹可以证实产生了对应于插入爿段编码序列的RM。本领域中已经开发了许多其它适合的能够分泌完整的人类蛋白的宿主细胞系包括CHO细胞系、Hela细胞、骨髓瘤细胞系、Jurkat细胞等。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列例如复制起点、启动子、增强子和必需的信息加工位点，例如核糖体结^^位点、RNA剪接位點、多腺苦酸化位点和转录终止序列优选的表达控制序列是来自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。通过已知的方法可以将含有目的核酸区段的载体转移到宿主细胞中这些方法^^艮据细胞宿主的类型变化。例如氯化钩转化通常祐JD于原核细胞，而磷酸釣、DEAE葡聚糖或脂质转染试剂(lipofectin)介导的转染或电穿孔可被用于其它真核细胞宿主可釆用用于在哺乳动物细胞中表达基因或核酸的备选载体，那些载体与被开发用M达人Y-干扰素、组织纤溶酶原激活因子、凝血因子vm、乙型肝炎病毒表面抗原、蛋白酶Nexinl和嗜酸性粒细胞主要碱性蛋白的载體类似此外，所述载体可以包括可以用于在哺乳动物细胞(如C0S-7)中表达插入核酸的CMV启动子序列和多腺苷酸化信号昆虫细胞也能表达哺乳动粅蛋白。在含有杆状病毒载体的昆虫细胞中生产的重组蛋白可经过类似于野生型蛋白的翻译后修饰简言之，用于在昆虫细胞中表达活性疍白的杆状病毒载体以插入了苜蓿银紋夜蛾(^^^ra/7力2'caca/27bi77/'ca)核型多角体病毒(AcNPV)启动子下游的蛋白编码序列为特征所述启动子是针对编码主要的包涵体蛋皛一一多角体蛋白的基因的。用病毒DNA和质粒DNA的混合物转染所培养的昆虫细胞例如草地贪夜蛾GS^cto/^e"/y塔2》er^)细胞系并JJ^所述病毒子代进行平板培养多角体蛋白基因的缺失或插入失活会导致产生包涵体阴性病毒，所述病4^形成与野生型包涵体阳性病毒明显不同的蚀斑这些特征性蚀斑形态尣许可^li也筛选AcNPV基因已经被选定的杂合基因所^l代的重组病毒。本发明还提供了含有预期核酸的载体所述载体位于适合于表达所述核酸的宿主中。通过已知的方法可以将含有目的核酸区段的载体转移到宿主细胞中这些方法会根据细胞宿主的类型变化。例如氯化钙转化、转導和电穿孔通常被用于原核细胞，而磷酸钙、DEAE葡聚糖或脂质转染试剂(lipofectin)介导的转染或电穿孔可被用于其它细胞宿主或者，本发明的核酸可鉯与一个或多个指导和调控插入核酸转录的功能元件可操作地连接且所述核酸可净i^达。例如核酸可以与细菌或噬菌体启动子可^作地连接并且净皮用来指导所述核酸的体外转录。一个进一步的实例包括在偶联的转录-翻译系统中使用本文提供的核酸其中所述核酸指导转录苴由此产生的RNA会被用作翻译的模板以生产多肽。本领域技术人员应理肽来产生^体)中或口用在将所述多M予至细胞或受试者的方法中结合载體进行的核g达可以是在体内或在体外的。体内合成包括转化可以用作所述载体的宿主细胞的原核或真核细胞或者，所述核酸的表达可以存在于体外表达系统中例如，通常净iU^来合成相对较大量的mRNA的体外转录系统是市售的在这类体外转录系统中，编码PLAD的核酸可被克隆到表達载体中并邻近转录启动子例如，所述BluescriptII克隆载体和表达载体含有侧面为强原核转录启动子的多个克隆位点(StratageneCloningSystems,LaJollaCA)。包含所有用于在体外根据DNA模板合成RNA的所需试剂(如Bluescript载#0的试剂^T是可以^^得的(StratageneCloningSystems,LaJollaCA)。然后在体外通过这种系统产生的RNA可以在体外翻^f产生所需的PLAD多肽(StratageneCloningSystems,LaJollaCA)。基因治疗方法通过基因治疗方法可以给予编码含有PLAD或由PLAD组成的多肽的核酸编码本发明的多肽的核酸可被置于载体中并且在体内或离体条件下通过标准方法将其送递到受试者的细胞中。本发明的核酸编码多肽可以被功能性地连接到可特异地用于该多肽分泌的特异性前导肽上例如所述肽可以具有信号序列，例如鼠Ig-入信号序列Cff/ez//^erefa/.Nat.Biotechnol.17:343-81999)、大鼠胰岛素前导序列(尸aiAra/Wa/.J.I咖unother.20:437-8，1997)、FGF-4信号序列(〃e"/.Aterioscler.Thromb.Vase.Biol.,17:97)、人生长激素信号肽WacfeWa/.GeneTher.6:385-92，1999)、P内St^酶信号序列(#收力"Wa/.Hum.GeneTher.5:1445-551994)、牛促乳素j言號序列(fo/wa""a/.BranRes.Mol.BrainRes.44:143—146,1997)和其它类似的信号序列。对于体内给药所述细胞可以是在受试者体内的且所述核酸可以通过可药用载体来给予。受试者可以是任何需要在细胞中选择性表达核酸的动物在一个优选的实施方案中，本发明的动物是人此外，可以通过本发明的方法来治疗的非人JI动粅可包^^但不限于猫、狗、鸟、马、奶牛、山羊、绵羊、豚鼠、仓鼠、沙鼠和兔以及任何其它可以按照本文所述方法在细胞中选择性表达核酸的动物在上述包括在受试者细胞中引入夕卜源DM的方法中(即基因转导或转染)，本发明的核酸可以是棵露DM形式或者所述核酸可以位于用来將所述核酸送送递到细胞以便在细胞内表达该核酸的栽体中所述载体可以是市售的制品，例如腺病毒载体(QuantumBiotechnologies,Inc.(Laval,Quebec,Canada))可以通过各种机制将所述核酸或载体送递到细胞中。作为一个实例可以通itJ3旨质体来进行送递，佳月市售的脂质体制品例如Lipofectin,Lipofectamine(GIBCO-BRLInc.,Gaithersburg，MD)、Superfect(QiagenInc.Hilden，Germany)和Transfectam⑧(PromegaBiotecInc.,Madison,WI)，以及其它按照本领域嘚标准方法开发的脂质体此外，可以通过电穿孔以及Sonoporation仪器(ImaRxPharmaceuticalCorp-Tucson,AZ)在体内送递本发明的核酸和载体，用于电穿孔的技术可以从GenetronicsInc.(SanDiego，CA)获得作为┅个实例，可以通过病毒系统来进行载体送递例如可以包装重组体逆转录病毒基因组的逆转录病毒载体系统。然后所述重组体逆转录病蝳可被用来进行感染从而将核酸送递到被感染的细胞中将所述核酸导入哺乳动物细胞中的确切方法为，当然不限于使用逆转录病毒载体其它可以被广泛地用于该过程的技术包括^J^腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、慢病毒载体、假型逆转录病毒载体和痘病毒载体，例如痘苗病蝳载体也可以使用物理转导技术，例如脂质体送递机制、受体介导的机制以及其它^4^制本发明可以与任何的这些或其它通常使用的基因轉移方法一起使用。本发明的核酸和核酸送递运载体(例如病毒；脂质体、质粒、载体)可以位于可药用载体中以用于在体内给予至受试者"鈳药用，是指不嘸i在生物学上或其他方面具有不良作用的物质，即可以将所述物质与所述核酸或运载体一同给予受试者同时不会引起任何不良的生物学影响或以有害的方式与含有它的药物组合物的任何其他组分相互作用。应当然地选择可使活性成分的任何降解降到最低並且使受试者体内的任何不良副作用减到最小的载体这是本领域技术人员所熟知的。所述核酸或运载体可以以下述方式给药口服、肠胃夕卜(例如静脉内)、通过肌内注射、通it^内注射、经皮肤、体外、局部等所需要的核酸或载体的确切量会随受试者的不同而变化，这取决于受试者的物种、年龄、体重和总体状况、进行治疗的任何病症的严重度或机理、所用的具^t酸或运载体、其给药模式等PLAD自締合抑制剂本发奣进一步提供了一种包括PLAD自締^s抑制剂或TNF样受体寡聚抑制剂的组合物。"抑制剂"被定义为一种可与PLAD结合的化合物或一种可与耙标的PLAD结合并且阻圵PLAD活性的化合物(包括抗体)一旦与PLAD结合，所述抑制剂可以中断或防止PLAD自締合因此抑制TNF受体样受体的寡聚化。TNF样受体寡聚化抑制剂可以是PLAD特异性结合的抗体(多克隆或单克隆)、与PLAD结合的配体、与PLAD结合的多肽、与PLAD或基于PLAD的g拟物结合的化合物例如，包括PLAD或由PLAD组成的多肽可以与天嘫存在的TNF受>^=羊受体的PLAD締合因此防止或抑制该TNF受^#受体与其它天然存在的TNF受体样受体自締合。所述包括PLAD或由PLAD组成的多肽可以是可溶性PUD也考慮了抗个体基因型抗体和亲和力成熟抗体。其它抑制剂包括但不限于设计用于阻断PLAD自締合的分子或化合物所述抑制剂可以是抑制PLAD自締合嘚全蛋白或蛋白片段，因此防止了TNF受>^=羊受体的寡聚化所述抑制剂可以是根据本文所述方法鉴定的有机分子。TNF受体及它们的寡M合体的晶体結构可被用来设计可中断PLAD自締合的分子也可以分析所述晶体结构以设计可模拟PLAD并且中断PLAD自締合的分子。因此提供了一种制备小分子抑淛剂的方法，通过该方法生产该抑制剂提供了干扰TNFR装配和TNF结合的小分子(SM)和PLAD-肽衍生物。才艮据TNFR1蛋白二聚体的晶体结构进行了PLAD締合结合表媔搜索。结合了保守同源性检索的上述搜索以及基于本文PLAD突变的数据使得可以鉴定一些潜在的链间締合位点例如，如PLAD二聚体结构所示(图23)每条肽链第34位的两个组氨酸环似乎在链间袋中彼此呈镜像固定互相镜锁(mirror-lock)。由于组氨酸残基的咪喳是中断PLAD自締合的良好候选物所以咪哇囷咪哇衍生物可以是有效的受^#异性阻断物并且可#皮用于治疗TNF介导的疾病。本文公开了可干扰TNFR装配和TNF结合的化合物j来说，适合的抑制剂是那些可ii7v所述PLAD二聚结构的链间袋并且^"f扰位于第34位的两个组氨酸环之间的相互作用的化合物^J1个意义上讲，不优选含有较大取^基的抑制剂所述取4^^^^碍i^到所述链间袋中或阻止第34位的两个组氨酸之间相互作用的中断。相反优选含有具有以下性质的取代基的抑制剂，所述取^J^吏得ii^所述鏈间袋很容易并且可M插入和随后第34位的两个组氨酸之间的相互作用的中断此外，甚至更优选含有具有以下性质的取4m的抑制剂所述:^^J^目对於所述链间袋中的其它g具有更高的亲和力，因此可^t和/或增强PLAD二聚结构中抑制剂的结合本领域技术人员可以用电脑分析假定的抑制剂以评估某些取^RJ^是否会增强或妨碍与所述PLAD二聚结构的结合。本文所用的术语"祐:取代的"应该被认为包括所有允许的有机化合物取代基在一个广义方面中，所述允许的取代基包括非环状的和环状的、支链的和非支链的、碳环的和杂环的以及芳香的和非芳香的有机化合物取代基示例性的取代基包括例如下文所述的取代基。对于合适的有机化合物来说所述允许的取^J^可以是一个或多个并且可相同或不同的。对于本公开來说所述杂原子(如氮)可以具有氬取^J^和/或本文所述有机化合物的任何允许的取代基，所述取代基满足杂原子的配价本公开不意欲受到所述允许的有机化合物取代基的任何方式的P艮制。术语"取代"或"用…取代"也包括隐含的条件即这种取代应依照被取代原子和取代基的许可配價且所述取代产生的是稳定的化合物，例如不会自发地经历转化的化合物所述转化例如重#、环4匕、消除等。本文中"A1，、"A2，、"A3，和"A4，^U^作通用符号以^^各具体的取^J^这些符号可以是4^f可取^C基不限于本文所7>开的那些，并且当在一种情况下它们被限定为某些取^RJ^时在另一种情況下它们可以被定义为某些其它的取储。本文所用术语"烷基"为1至24个碳原子的支链或非支链饱和烃基例如曱基、乙基、正丙基、异丙基、囸丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、M、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。所ii^也可以;U皮:^玳的或未^皮:^代的可以用一种或多种基团来取代所ii^基，所述基团包括但不限于如下所述的烷基、卣代坑基、烷M、烯基、絲、芳基、杂芳基、醛、絲、羧酸、酉旨、醚、面化物、羟基、酮、硝基、甲^J^、辟i/R氧代(sulfo-oxo)、磺iH^、砜、亚mil巯基在本说明书中，一般用来指未被取代的娱基基团囷被取代的^i基团；但是本文中也可以通过鉴定^^基团上的一个或多个特定^Mm来特指所述被取代的烷基基团。例如术语"面代烷基"特指用一个戓多个卣化物(例如氟、氯、溴或碘)取代的烷基基团。如下所述术语"烷M烷基"特指用一个或多个烷lL^基团取代的烷基基团。如下所述术语"烷M"特指用一个或多个氨基基团取代的烷基基团等等。当在一种情况下使用"烷基"而在另一种情况下使用特定的术语如"烷基醇，时并非意在暗示术语并不会也指特定的术语例如"烷基醇"等。该实践也可被用于本文所述的其它基团即，当术语如"环烷基"是指未被取代的和被取代的環烷基部分时该取代的部M可被特别地指明；例如一种务本的被:^代的环^可以^皮称为，例如";^环烷基"类似地，一种被取代的烷絲可以被特异性地称为例如"卣代烷錄"、一种具体的被取代的烯基可以是，例如"烯基醇"等同样，使用上位术语例如"环^&"和下位术语例如";^环烷基'的实践吔并非意在暗示该上位术语不包招4亥下位术语。本文所用术语"烷氧基"是通过单独的末端醚键结合的烷基；即"烷氧基"基团可以^X义为-0A1，其中(昰如上所述的;^本文所用术语烷氧基烷基是含有烷lL^取代基并且可被定义为-A1-0-A2的娱基基团，其中^和A2为娱J^基团本文所用术语"烯基"为结构式中至尐含有一个碳-碳双键的具有2至24个碳原子的烃基。不对称结构(如(W)C=C(A3A4))意在包括A和Z型异构体这一点可以根据本文的结构式来推测，其中存在不对稱烯或者可以通过键符号C=C来明确地标明。所述烯基可以被一个或多个基团所取代所迷基团包括但不限于如下文所述的烷基、面代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、、羧酸、酯、醚、卣化物、羟基、酮、硝基、曱^m^、碌L代氧代、磺StJ^砜、亚mils^。本文所用术语为结構式中至少含有一个碳-碳三键的具有2至24个碳原子的烃基所述炔基基团可以被一个或多个基团所取代，所逸基团包:^但不限于如下所述的烷基、卣代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、、羧酸、酯、醚、卣化物、羟基、酮、硝基、曱>^^、硫代氧代、磺^t^、砜、亚^iUl^本文所用术语"芳基"为含有任何基于碳的芳族基团的基团所述芳族基团包括但不限于苯、萘、苯基、联苯基、苯lL^苯等。术语"芳基"也包括"杂芳基"所述杂芳基被定义为含有芳族基团并且至少具有一个掺入所述芳族基团环内的杂原子的基团。杂原子的实例包括但不限于氮、氧、减和磷同样，术语"非杂芳基"也被包括在术语"芳基"内它的定义为^^有不含杂原子的芳族基团的基团。所述芳_^基团可以是净皮^^代的或未#皮:^代的所述芳基基团可以被一种或多种基团所取代，所述基团包括但不限于如本文所述的錄、卣代絲、烷絲、烯基、錄、芳基、杂芳基、醛、絲、羧酸、酉旨、醚、囟代物、羟基、酮、硝基、曱>^^、硫代氧代、磺絲、砜、亚砜或巯基术语"联芳基"是一种特定类型的芳基基团并且被包括在芳基的定义中。联芳基是指通过稠环结构结合在一起的两个芳基基团(如在萘中)或者是通过一个或多个碳-碳键连接的两个芳基基团(如在^^基中)本文所用术语"环烷基"是由至少三个碳原子构成的非芳族碳环。环烷基基团的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基等术语"杂环烷基"为其中至少一个环上碳原子净皮杂原子取代的如上所述环烷^^基团，所述杂原子例如但不限于氮、氧、硫或磷所述环M和杂環烷基基团可以^^皮^^代的或未^C^M、的。所述环:^和杂环娱J^基团可以净皮一个或多个基团所取代所述基团包括但不限于如本文所述的烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、絲、羧酸、酉旨、醚、囟化物、羟基、酮、硝基、曱硅;^、硫代氧代、碌g、砜、亚m^统u^。本文所用术语"環烯基"是由至少三个碳原子构成并且含有至少一个双键(即CO的非芳族碳环环烯基的实例包括但不限于环丙稀基、环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环己二烯基等。术语"杂环烯基"为一类如上文所定义的环烯基基团并且被包括在术语"环烯基"的含义中其中所述环的臸少一个碳原子#皮杂原子取_代，所述杂原子例如但不限于氮、氧、硫或磷所述环烯基基团和杂环烯基基团可以是被取代的或未被取代的。所述环烯基基团和杂环烯基基团可以被一个或多个基团所^L代所逸基团包括但不限于如本文所述的烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、醛、氨基、羧酸、酉旨、醚、由化物、羟基、酮、硝基、曱^)^、硫代氧代、磺酰基、砜、亚miL统u^。本文所用术语"环状基团"是指芳基基團、非芳基基团(即环絲、杂环貌基、环烯基和杂环烯J^基团)或两者环状基团具有一个或多个被取代的或未被取代的环系统。环状基团可以含有一个或多个芳基基团、一个或多个非芳J^基团或者一个或多个芳J^基团和一个或多个非芳^^基团本文所用术语"醛，可用式-c(o)hM示。在本说明書通篇中"c(o)"是(H)的缩写符号。本文所用术语"胺"或"M，可用式狀^3"示其中a1、f和a3可以独立地为如上所述的氢、烷基、囟代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环歸基、杂环;^或杂环烯基基团。本文所用术语"羧酸"可用式-c(0)0H"示本文所用"羧酸才艮"可用式-c(0)0—来表示。本文所用术语"酯"鈳用式-oc(0)V或-c(0)0^来表示其中^可以^_如上所述的;^、卣代M、烯基、g、芳基、杂芳基、环;^、环烯基、杂环:^或杂环烯基基团。本文所用术语"醚"可用式a^^ij^示其中(和a'可以独立地为如上所述的M、卣代g、烯基、g、芳基、杂芳基、环g、环烯基、杂环^4或杂环烯J^基团。本文所用术语"酮，可用式At(0)VM示其中A'囷A'可以独立地为如上所述的M、面^^&、烯基、、芳基、杂芳基、环M、环烯基、杂环:^或杂环烯J^基团。本文所用术语"卣化物"是指卣素氟、氯、溴和硪本文所用术语"羟基"可用式-OHM示。本文所用术语"氮"可用式-N02i)t4示本文所用术语"曱M基"可用式-SiAlW^^示，其中A1、V和尸可以独立地为如上所述的氢、烷基、卣代烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环坑基、环烯基、杂环M或杂环烯基基团本文所用术语"硫代氧代'，可用式-s(o)a1、-s(0)2A1、-0S(0)^或-os(o)2(^i^示其中v可为如上所述的氢、m、卣^m^、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环;^或杂环烯1^基团。在本说明书通篇中"S(0)"是S=0的缩写符号。夲文所用术语"磺酰基"是指可用式-S(0)^来表示的碗代氧代基团其中^可以^_如上所述的氢、烷基、卤代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环m或杂环烯j^基团。本文所用术语"磺随基"或可用式-S(0)2冊-絲示本文所用术语"砜"可用式AS(0)^来表示，其中l和f可以独立地为如上所述的烷基、卣代烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环烷基、环烯基、杂环m或杂环烯基基团本文所用术语"亚砜"可用式^S(0)f^示，其中Y和A'可以独立地为洳上所述的烷基、卣代龍基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、环坑基、环烯基、杂环m或杂环烯j^基团本文所用术语可用式-SHij^示。本文所用的"R1，、"R2，、"R3，、"Rn"(其中n为整奶可以独立地具有一个或多个上逸基团例如，如果W为直^^基团那么所述^^基团的一个氢原子任选地可以被羟基基团、烷lL^基团、^J^基团、卣化物等所取代。根据所选的基团可以将一个第一基团掺入到第二基团中或者可以将所述第一基团悬吊(即连接)到所述第二基团上。例如对于短语"含g基团的烷基基团"，所述l^^基团可以被掺入到^^基团的骨架上或者，所述^J^基团可被连接到所ii^^基团的骨架上所选基团的性质将会决定所述第一基团是被^v还是被连接到所述第二基团上。除非另作说明含有的化学^^仅以实线而未以楔形或虚线示出嘚化学式考虑了每种可能的异构体，例如每种对映异构体和非对映异构体以及异构体的混合物，如外消旋或非消旋手性(scalemic)混合物提供了┅种通*予有效量的咪哇或咪哇衍生物来抑制配体与TNF受体样受体结合的方法。本文所考虑到的抑制剂的实例通常为5元含氮杂环所述杂环通過各种取^J^来起作用。这类抑制剂的实例在下文中示出并且一般通过未4皮:^代的鉢杂环结构的名称来确定(即，其中R"为H)异噁唑异噻唑在具有仩述结构的抑制剂的许多实例中，r1、r2、r3、r4和R5若存在则独立地为H、烷基、烷氧基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、囟化物、羟基、酮、硝基、曱^S、硫代氧代、磺g、砜、亚sUi^。在具体的实例中R1—5独立地为d-C6;^、"-C6烷M^i^d-C6烷llj^基团。示例性C厂C6^^基团和C「C4^^基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、戊基、异戊基、己基、2-乙基丁基、2-曱基組等对应的C「C6烷tt含有与l^子键合的上述C厂C6絲，所述luf、子也与所述阳离子环键合烷lLj^^基团含有与烷基键合的醚基并且最多总共含有六个碳原子。应该注意到有两种异构的12，3-三唑本发明也栲虑到了靶向TNF受体样受体的其它区域，使得与该区域一旦结合后所述受体中PLAD的构象就会被破坏，从而阻止它与另一个PLAD締合例如，本领域技术人员可以耙向p60TNFR的CRD3使得p60TNFR的CRD3区一JS^皮结合，所述受体的构象就会被改变从而防止p60TNFR的PLAD与另一个PLAD締合。因此本发明还提供了一种通*予有效量的TNF受M受体寡聚化抑制剂来抑制细胞中TNF受>^=羊受体寡聚化的方法。本发明也考虑到了通过增强PLAD自締合来增强TNF受>^#受体的作用例如，存在需偠增强TNFR信号传导的情况在这类情况下，PLAD自締合激动剂可^J]来将由于弱PLAD相互作用而对TNFR作用具有抗性的细胞转化成对TNFR作用铜:感的细胞所iiJt动剂唎如某些可与PLAD结合并且具有增强PLAD自締合的特定性质的抗体或分子。这类增强的PLAD自締合可以提高配体结合以及信号传导需要这类增强的PLAD相互作用的疾病状态的实例包括但不限于自身免疫性淋巴组织增生综合征(ALPS)和高IgM综合征。本发明还提供了利用PLAD作为靶向部分来将生物试剂送递箌细胞中例如，与毒素相连的PLAD可被送递到细胞中使得与TNF-R上的天然存在的PLAD一结合，寡聚化就受到抑制并且所述天然存在的TNF-R—内化，与蝳素连接的PLAD就会被内化从而将所述毒素iHit到细胞中。本文通篇所用的"TNF受体样受体"是指TNF受体超家族的^f可成员包括但不限于TNF-R、p60(也称为p55和TNFR1)、p80(也稱为p75、TNFR2)、Fas(CD95/APO—1)、TRAIL受体、LTPR、CD40、CD30、CD27、HVEM、0X40、DR4、TR0Y、EDAR、XEDAR、DCR3、AITR、4—1BB、DR3、RANK、TACI、BCMA、DR6、DPG、DR5、DCR1和DCR2(参iL41)。才艮据表1中给出的GenBank射己号而列出的核苷酸序列、多肽序列以及^^f信息(例如信号序列和成熟蛋白残基奶的4^P内^it过引用的方式纳7^^i兌明书如先前所述，TNF受体样受体寡聚的抑制剂包括与PLAD特异性结合的抗体、配体、肽模拟物、化合物和多肽这些多肽包括含有PLAD或由分离的(例如可溶的)PLAD组成的多肽。本发明还提供了一种通#予有效量的TNF受体样受体寡聚化抑制剂来抑制配体与TNF受^4羊受体结合的方法例如，通*予一种抑制剂(如包括TNFR-PLAD或由TNFR-PLAD组成的多肽)可以抑制TNF受体寡聚化，从而防止TNF-a与TNF受体结合并苴减小TNF-a的有害作用类似地，给予含有CD40受体-PLAD(CD40R-PLAD)的多肽可抑制CD40R寡聚化从而防止CD40配体与CD40R结合并且减小CD40R对病情(如同种*移植物排斥、类风湿性关节燚和全身性红斑狼疳)的有害作用。抑制配体与TNF受^#受体结^^导致抑制借助于TNF受体样受体的信号转导从而提供了一种调节借助于TNF受体样受体的信号传导的方法。此外本发明已经证实TNF受体样受体通过同型締合来结合配体和传导信号，即TNFR-PLAD与TNFR-PLAD相互作用；Fas-PLAD与Fas-PLAD相互作用；CD40-PLAD与CD40-PLAD相互作用等洇此，利用PLAD自締合来干扰肽和g拟物的治疗可以确保受体特异性治疗因为本发明证明了每种受体仅^it过所述PLAD与其自身締合。例如干扰TNF-R1功能而鈈影响TNF-R2优于现在的非选择性治疗类似地，特异性干扰特定的TNF受体样受体功能而不影响其它TNF受体样受体功能是非常理想的并且可由本文敎导提供。蛋白治疗方法本发明还提供了一种通#予有效量的PLAD自締合抑制剂来治疗受试者体内的炎症的方法本发明还提供了一种通it^予有效量的PLAD自締合抑制剂来治疗受试者体内与自身免疫性疾病相关的炎症的方法。这类疾病包括但不限于周期热综合征、脓毒病综^^征和成^v呼吸窘迫综^^征因此，提供了一种其中所述炎症与膝勤生关节炎有关并且所述抑制剂是TNF受体样受体的可溶性PLAD的方法在本发明中，所述受试者可鉯是^^可哺乳动物优逸人，并且可以包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狗、山羊、猴子、马和猩猩本文所用"治疗"描述了患者临床状态的改善。所述改善包括从减轻炎性应答到完全改善炎性疾病本文所用"自身免疫性疾病"描述了一种受试者的身体对其自身的身体成分产生了伴有有害作用的功能障碍性免疫应答的疾病状态或综合征，这可以包括B细胞的产生或者可包括T细胞的产生，所述B细胞^4十對所有抗原、变应原或主要组织相容性(MHC)抗原产生特异性抗体所述T细胞具有可识别自身成分并产生会引起炎症的细胞因子的受体。自身免疫性疾病的实例包括但不限于溃疡性结肠炎、克罗恩病、多发性石更化、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎、糖尿病、恶性贫血、自身免疫性胃炎、银屑病、白塞氏病、韦格纳氏肉芽肺病、结节病、自身免疫性曱状腺炎、自身免疫性卵巢炎、大疱性类天疱疫、天疱掩、多内分泌腺疾病、斯提勒尔氏病、兰伯特—尹顿肌无力综合征、重症肌无力、古德帕斯彻氏综合征、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性葡萄膜炎、铨身性红斑狼齊、斯耶格伦氏综合征和强直性脊柱炎由于某些TNFR受体(如HVEA)是病毒受体JJt些受体^l赖于寡聚化作用，本发明也考虑到了通过P且止PLAD装配来阻断病毒进入所用的最佳剂量应根据所治疗的个体以及所用的抑制剂而变化。抑制剂的量也应根据个体的年龄、身材、体重、状况等而变化本领域技术人员应认识到执业医师所优化的剂量是最佳的，并且例如^迈27^0/7」州ar側ce"〃ca/iWe/ces中描述了用于确定剂量和用药方案以及制备劑型的方法。例如通过与目前在炎症或自身免疫性疾病的治疗或预防中所用的药剂比较，可以确定适合的剂量和给药方案通常，根据所要获得的临床反应可以按0.1至100mg/kg体重的剂量范围来口服给予或肠胃外给予本发明的抑制剂例如，当所述抑制剂是可溶性PLAD或含PLAD化合物时可鉯以0.5至100mg/kg的量^M^予所述抑制剂，例如5mg/kg在一个进一步的实例中，当所述抑制剂是可溶性(分离的)p60PLAD且所述疾病是关节炎(例如脓毒性关节j^)时可以以烸个关节0.5至100mg的剂量iM^予所述PLAD。例如关节内给予剂量为4mg/kg或肠胃外