qPCR技术在宿主细胞DNA残留检测及细胞培养监控中的最近进展_百度文库
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qPCR技术在宿主细胞DNA残留检测及细胞培养监控中的最近进展|q​P​C​R​ ​技​术​在​宿​主​细​胞​D​N​A​残​留​检​测​及​细​胞​培​养​监​控​中​的​最​近​进​展​,​美​国​生​命​技​术​公​司​,​任​育​华
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71RealtimeRT_qPCR检测规范化_马俊彦 (1)
中国生物工程杂志ChinaBiotechnolo；综述；RealtimeRT-qPCR检测规范化；马俊彦林俊；(浙江大学附属妇产科医院浙江省女性生殖健康重点实；摘要RealtimeRT-qPCR(rea-lt；中图分类号Q819；RealtmieRT-qPCR(rea-ltmi；[1-3]；以确定得到有意义的统计学差异所需的合适样本数;(；[3]；；科学研究
中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,):55-59综
述RealtimeRT-qPCR检测规范化马俊彦 林 俊*(浙江大学附属妇产科医院浙江省女性生殖健康重点实验室 杭州 310006)摘要 RealtimeRT-qPCR(rea-ltimequantitativereversetranscription-PCR)是一种快速、简便、准确、灵敏、成本低廉的基因检测技术,被认为是目前检测基因在转录水平表达的金标准。研究发现RealtimeRT-qPCR的检测结果会受到实验设计、引物、模板的质量、内参的选择及数据分析的方法等多个因素的影响,规范实验设计及操作是得到可靠结论的前提和必要条件。对近年来国内外涉及RealtimeRT-qPCR整个实验流程及数据发表的一些规范及标准进行综述,以便规范实验设计及操作,加强实验质量控制,促进研究结果的推广,和更好地发挥其应用价值。关键词 RealtimeRT-qPCR 规范化 基因表达中图分类号 Q819RealtmieRT-qPCR(rea-ltmiequantitativereversetranscription-PCR)是检测样本中基因表达量的有效方法,具有灵敏性、准确性、快速性、检测所需样品微量、操作技术简单等优点,被认为是目前检测基因表达的金标准[1-3]以确定得到有意义的统计学差异所需的合适样本数;(2)实验布局:目前常用的实验布局有两种,一种是样本最大化的布局,即在同一板实验中尽可能增加所检测的样本数而减少基因数;另一种是基因最大化的布局,即在同一板实验中选取几个样品进行多个基因的检测[3]。然而,随着RealtmieRT-qPCR技术在基础科学研究及临床检测等多个领域的广泛应用,越来越多的学者发现实验的结果会受到实验设计、引物、模板的质量、内参的选择及数据分析的方法等多个因素的影响,规范实验设计及操作是得到可靠结论的前提和必要条件[3-6]。上述两种实验的布局前者主要适用于基础或临床的科学研究,因为可以避免不同板间实验的差异;后者则主要适用于商业试剂盒研发过程中的前瞻性试验。特别值得注意的是,当在所有的样本不能全部在同一板实验中进行时,要比较不同板上得到的结果,则需通过板间校正(inter-runcalibrators,IRC)对不同板实验的Cq(quantificationcycle)值进行校正。IRC是在实验的每板中均对同一组样品进行同一基因的检测,随后比较其在各板间表达上的差异,并以其作为校正子,对不同板实验的Cq值进行标准化校正[7]。为此我们对RealtmieRT-qPCR整个实验流程中可能影响数据准确性和结论可靠性的各种因素进行综述,以便规范实验设计及操作,加强实验质量控制,更好地发挥其应用价值。1 实验准备阶段的影响因素及其规范化1.1 实验设计实验设计是最常被忽视的,而合理的实验设计不仅可提高实验结果的准确性还可以节省费用及时间。对于RealtmieRT-qPCR来说一个合理的实验设计必须注意以下三个方面:(1)样本数:对实验进行全面评估,收稿日期:
修回日期:*,:jccn。(3)样品的排列:尽可能地将同一基因的检测排列于96孔或384孔板的同一行或同一列中,以便于加样及样品的标记。1.2 模板的质控获得高质量的、能正确反应样品中转录情况的RNA,对于其后的定量结果是非常重要的,RNA质量不合格可导致错误甚至于完全相反的实验结果。RNA面RNA[8]否存在DNA污染。一般认为,适用于RealtmieRT-qPCR检测的模板RNA的纯度及完整性需满足以下条件:(1)rRNA比率[28s/18s]\1.1,RNA完整系数(RNAqualityscore,RIN)\7(利用Bioanalyzer2100进行分析);(2)28s和18s条带明显(变性琼脂糖凝胶电泳);(3)[260nm/280nm]比率=1.9~2.1(分光光度计测量);(4)通过PCR比较未知样品中某特定基因的5c和3c端扩增的比率与完整的对照样品中5c和3c端扩增的比率的差异,了解mRNA的完整性,要求mRNA的完整性达到95%以上[8-10]要有二种来源,一种是真正的生物体本身内在的差异,另一种则是由于实验误差导致的[2]。而选择合适的内参基因对目标基因表达量进行校正,可以摒除实验误差的干扰从而获得真实可靠的结果。大量的研究结果表明,任何一种内参基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的细胞或实验因素作用下/有范围0的恒定,在其他类型的细胞中或实验因素作用下则是变化的,因此在特定的实验前根据样本类型及实验要求进行合适内参基因的筛选就显得尤为必要[2,13]。GeNorm。对于DNA的干扰和污染,(http://medgen.ugen.tbe/genorm/)和NormFinder(http://www.md.ldk/publicationsnormfinder.htm)是目前最常用的自动选择最适合内参基因的软件。GeNorm可将某一内参基因与其他内参基因表达水平的两两比值经对数变换后,计算其平均标准差作为基因表达稳定度的平均值M,对所有候选内参基因的表达稳定度进行排序,并对标准化因子进行配对差异分析来判定所需内参基因的最适数目[14]以往认为可以通过设计跨基因内含子的引物而避免样品中残余DNA扩增,但目前认为这种方法一般是不被推荐的(因为超过20%的人类基因被认为是单一外显子基因)[3]。适当的DNA酶处理被认为是排除DNA污染的最有效的策略,随后对处理后的RNA样品通过PCR进行目的基因的检测,若没有扩增产物,则证明该RNA样品没有DNA污染1.3 引物的设计实验准备阶段另一关键的因素就是引物的设计。一般可以通过以下三种方法获得所需特定的引物序列:(1)通过一些网上获得的免费的或公司提供的引物设计软件,自行进行设计;(2)请公司代为设计并合成;(3)寻找文献中或一些公共数据库(如rtprmierdb.org)中被验证过的引物。不管是用那种方法获得的引物序列,仍需经过数据库及实验对引物的适用性进行评估。
引物合成前一般首先通过BLAST比对序列确定引物的特异性,随后检查在引物的退火区是否存在多态性位点(这种多态性位点可能会阻碍引物的有效退火或阻止不同等位基因的扩增)、修饰的二级结构、发夹重叠等能阻碍和影响PCR效率的因素org),可以用于完成上述检测。引物合成之后还需经过一系列验证实验对其进行评估,常用的方法主要有:通过凝胶电泳中扩增片段的长度及溶解曲线可初步判定引物特异性,通过制作标准曲线以评估引物的扩增效率(稀释的范围越广所评估的扩增效率越精确)。制作标准曲线最常用的方法是将有代表性的实验样品进行混合,制成一混合物,以此为模板进行一系列的稀释并检测。1.4 内参基因的选择实验准备的最后一项就是选择合适的内参基因。主[11-12][8-9]。。NormFinder是一个MicrosoftExcel加载项,其不同于GeNorm的是综合计算内参基因在同一组内及不同组间表达的稳定性,以筛选最佳内参基因及最佳组合的两个内参基因[15]。此外,近年来qBasePlus的数据分析软件也被用于内参基因的选择,该软件是qBase软件中专业用于RealtmiePCR数据分析的模块,以geNorm和qBase技术为基础开发出来的qBase的二代产品。它具有评估及矫正PCR效率,筛选内参基因进行数据标准化,利用一个或多个板间矫正因子进行板间差异的矫正等多种功能[16]。qBasePlus软件以其快速计算并能用于多种计算机平台和具有多个水平的质量控制等特点正逐渐被广为采纳。1.5 反转录过程的注意事项反转录过程也是容易引入实验误差的步骤之一,为减少误差应注意以下方面:(1)实验过程应规范操作以防止RNA的降解及断裂,从而影响到模板RNA的完整性;(2)为防止非特异性扩增,应设置阴性对照;(3)对于同一模板,以相同的总RNA量分别进行2~3次的重复反转录;(4)设定内参以避免靶RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系间的温度差等所造成的误差;(5)选择合适的引物(当mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。但用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA;当对,Oli(dT),。这里推荐一个工具网站rtprmierdb.org(http://www.rtprmierdb.引物与mRNA的3c端Poly(A)尾配对并进行扩增;当仅对某特定的mRNA进行研究时,应选用含与目标RNA互补寡核苷酸序列的特异性引物,用此类引物仅对所需mRNA进行特异的扩增);(6)选择高效率且热稳定的反转录酶以提高反转录的效率。上Cq值仅同反应体系中模板的浓度相关而与反应的总体积不相关。然而,PCR体系过小可能会带来以下缺点:(1)不可避免性蒸发对结果的影响;(2)降低PCR反应检测的敏感性。因此,在模板量非常少的情况下,Derveaux等[3]建议通过样本的预扩增来增加模板量,2 实验阶段影响因素及其规范化2.1 操作污染及操作误差的控制操作污染及操作误差是实验阶段最为关键的影响因素。为避免操作污染,应将实验区域进行合理分隔(按样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物鉴定等进行区域划分),每个区域进入时必须重新更换一副新的手套避免交叉污染。移液器使用前应进行精度的校正,同时进行必要的清洁防止污染。移液器使用时吸取样品应注意缓慢进行,尽量一次性完成,忌多次抽吸,切勿形成喷雾,以免交叉污染或产生气溶胶污染。为减少操作误差对结果的影响,每一次实验必须设置无模板对照(notemplatecontro,lNTC)(即一个不含模板DNA或cDNA但含有PCR反应体系中所有其他成分的对照),同时设置1~2个复孔对于同一样品进行检测。2.2 检测方法的选择RealtmieRT-qPCR反应产物的检测通常有两种方法,SYBRGreen染料法和Taqman探针法[1-3]而不是过度地减少反应体系。3 数据分析阶段的影响因素及标准化3.1 绝对定量和相对定量RealtmieRT-qPCR通常分为绝对定量法和相对定量法。绝对定量法是用已知拷贝数的标准品进行稀释作标准曲线来推算未知样本的量。常用于病原体检测,基因表达等研究。相对定量是用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列的相对变化。常用于基因在不同组织中的表达差异,药物疗效评定,耐药性研究等。相对定量法通常需要通过内参(GAPDH基因,B-ACTIN基因等内参基因)来进行定量,根据目的基因与内参基因扩增效率一致性等因素还可分为双标准曲线法和$$Cq法[17-19]。当目的基因与内参基因扩增效率不一致时,应使用双标准曲线法:F=待测样品目的基因浓度/待测样品内参基因浓度对照样品目的基因浓度/对照样品内参基因浓度当目的基因和内参基因的扩增效率接近100%且偏差在5%以内,应使用$$Cq法:(1)用内参基因的Cq值归一目标基因的Cq值:
$Cq(test)=Cq(targe,ttest)-Cq(re,ftest)
$Cq(calibrator)=Cq(targe,tcalibrator)-Cq(re,fcalibrator)(2)用校准样本的$Cq值归一试验样本的$Cq值:$$Cq=$Cq(test)-$Cq(calibrator)
(3)计算表达水平比率:
2-$$Cq。SYBRGreen染料法是在PCR反应体系中,加入过量SYBRgreen荧光染料,通过对掺入DNA双链的SYBRgreen荧光染料所发射荧光信号进行定量分析。Taqman探针法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物。前者灵敏度高、通用性好、不需要设计探针、方法简便、价格低廉、适用高通量大规模的定量PCR检测,但其特异性不高。相比而言,Taqman探针法具有高度适应性和可靠性,实验结果稳定重复性好,特异性高等特点。由于其价格过于昂贵,不宜用于定量PCR的筛查,主要用于特定病原体或分子的定量检测。2.3 反应体系的选择不同的设计应选择合适的PCR反应体系。在一般的科研中多选用的是20Ll的反应体系,当模板量少或利用高通量大型RealtmiePCR仪进行分子的筛查时,可将PCR的反应体系缩小到10Ll(针对于96孔板)或5Ll(针对于384孔板)进行检测。PCR体系的缩小,不,,=表达量的比值3.2 生物学统计分析生物学统计分析是指运用统计学方法在看似杂乱无章的数据中如实、准确地寻找内在的变化规律。RealtmieRT-qPCR数据进行统计分析时,应注意以下几点:首先,选择合适的统计学方法。如当各组样本的表达总体符合正态分布且方差齐性一致时可选用经典的T检验和方差分析;而各组数据不符合正态分布、方差不齐时则应选择非参数检验。第二,样本检测时复孔的,统计分析没有任何意义。因此,不同实验组必须设置独立的生物学重复,参数检验(如95%可信区间计算)应设3个以上的生物学重复,非参数检验(如Wilcoxonsigned-ranktest)时应有6对以上的生物学重复统计学检验[3、21][20]我们对各步骤及工作流程中关键问题及一些重要的细节进行综述,希望能促进广大实时定量RT-qPCR使用者共同进步,完善定量RT-qPCR操作规则和实验技术,为更好地得到准确的实验数据而共同努力。。第三,当数据差异十分明显的情况下,意味着可不必去作。3.3 数据报告准则RealtmieRT-qPCR仪器和软件的多样化造成对后续的数据处理缺乏统一的标准,进而阻碍实验数据的发表及向公共数据库的传递。为解决上述问题,近年来由仪器商及试剂商、数据分析软件研发人员及PCR领域的资深学者、培训师等人共同开发了realtmie数据标记语言(RDML:theinternationalRea-ltmiePCRDataMarkupLanguage)[22]参考文献[1]NolanT,HandsRE,BustinSA,eta.lQuantificationofmRNAusingrea-ltimePCR.NatProtoc,):.[2]VandesompeleJ,DePreterK,PattynF,eta.lAccuratenormalizationofrea-ltimequantitativeRT-PCRdatabygeometricaveragingofmultipleinternalcontrolgenes,GenomeBio,l):RESEARCH0034.Epub2002Jun18.[3]DerveauxS,VandesompeleJ,HellemansJ.Howtodosuccessfulgeneexpressionanalysisusingrea-ltimePCR.Methods,):227-230.[4]BernardPS,WittwerCT.Rea-ltimePCRtechnologyforcancerdiagnostics.ClinChem,):.[5]BustinSA,MuellerR.Rea-ltimereversetranscriptionPCR(RT-qPCR)anditspotentialuseinclinicaldiagnosis.ClinSci。RDML作为一种专门为realtmie设计的结构化语言及数据报告指南,是在XML实时PCR数据标记语言的基础上研发,它的运用可使PCR仪器与第三方数据软件之间,实验伙伴与合作者之间,实验者与杂志社之间或实验者与公共数据库之间,实现数据及相关信息的直接交流[22]。RDML的所(Lond),):365-379.[6]BustinSA,NolanT.Pitfallsofquantitativerealtimereverse-transcriptionpolymerasechainreaction.JBiomolTech,):155-166.[7]HellemansJ,MortierG,DePaepeA,eta.lqBaserelative有数据都以一个自我记录,开放的形式进行储存,不仅方便现有的软件对数据进行分析,而且有利于新分析软件的开发及新分析方法的产生。近年来为进一步规范RealtmieRT-qPCR数据的发表,在RDML的基础上又制定了MIQE(theMinmiumInformationforPublicationofQuantitativeRea-lTmiePCRExpermients)作为RealtmieRT-qPCR数据标准报告的指南。MIQE指南中规定,RealtmieRT-qPCR数据发表需上传评价RT-qPCR实验质量所必须的最小信息量,并将其列入一张清单中与最初的原文一起上传至杂志社[23]quantificationframeworkandsoftwareformanagementandautomatedanalysisofrea-ltimequantitativePCRdata.GenomeBio,l):R19.[8]FleigeS,PfafflMW.RNAintegrityandtheeffectontherea-ltimeRT-qPCRperformance.MolAspectsMed,-3):126-139.[9]HuggettJF,NovakT,GarsonJA,eta.lDifferential。通过MIQE提供的相关实验条件及检测特点,susceptibilityofPCRreactionstoinhibitors:animportantandunrecognisedphenomenon.BMCResNotes,):70.[10]NolanT,HandsRE,OgunkoladeW,eta.lSPUD:a审稿人可以评价所用方法的准确性;通过MIQE中充分公开所用的试剂、引物的序列及分析方法,其它研究者可进行实验的重复。MIQE的目的是确保科学文献的完整性,促进各实验室操作的一致性,增加实验的透明性,更好地促进广大使用RealtmieRT-qPCR这一技术的研究者们共同进步。quantitativePCRassayforthedetectionofinhibitorsinnucleicacidpreparations.AnalBiochem,):308-310.[11]HoebeeckJ,vanderLuijtR,PoppeB,eta.lRapiddetectionofVHLexondeletionsusingrea-ltimequantitativePCR.LabInvest,):24-33.[12]PattynF,RobbrechtP,DePaepeA,eta.lRTPrimerDB:the4 结 论RealtmieRT-qPCR技术是一种快速、简便、准确、灵敏、成本低廉的基因表达分析方法。然而,由于技术的简单性使得它容易在实验过程中由于操作者不执行,rea-ltimePCRprimerandprobedatabase,majorupdate2006.NucleicAcidsRes,-688.[13]AndersenCL,JensenJL,OrntoftTF.Normalizationofrea-ltimequantitativereversetranscription-PCRdata:varianceestimationmapproachamode-lbasedfortoidentifygenessuitedercolon)CancerRes,):.马俊彦等:RealtimeRT-qPCR检测规范化59functionmutationsinLEMD3resultinosteopoikilosis,Buschke-Ollendorffsyndromeandmelorheostosis.NatGenet,(11):.[20]WillemsE,LeynsL,VandesompeleJ.Standardizationofrea-ltimePCRgeneexpressiondatafromindependentbiologicalreplicates.AnalBiochem,):127-129.eta.lScanning[21]PfafflMW,HorganGW,DempfleL.Relativeexpression2004,36[14]VandesompeleJ,DePreterK,PattynF,eta.lGeNormsoftwaremanua,lupdate62004.Availablefrom:&http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm&.[15]NormFinderSoftware.Availablefrom:&http://www.md.ldk/publicationsnormfinder.htm&.[16]Segers-NoltenGM,WymanC,WijgersN,confocalfluorescencemicroscopyforsinglemoleculeanalysisofnucleotideexcisionrepaircomplexes.NucleicAcidsRes,):.[17]KarlenY,McNairA,PerseguersS,eta.lStatisticalsignificanceofquantitativePCR.BMCBioinformatics,):131.[18]SchmittgenTD,LivakKJ.Analyzingrea-ltimePCRdatabythecomparativeC(T)method.NatProtoc,):.[19]HellemansJ,PreobrazhenskaO,WillaertA,eta.lLoss-o-fsoftwaretool(REST)forgroup-wisecomparisonandstatisticalanalysisofrelativeexpressionresultsinrea-ltimePCR.NucleicAcidsRes,):e36.[22]LefeverS,HellemansJ,PattynF,eta.lRDML:structuredlanguageandreportingguidelinesforrea-ltimequantitativePCRdata.NucleicAcidsRes,):.[23]BustinSA,BenesV,GarsonJA,eta.lTheMIQEguidelines:minimuminformationforpublicationofquantitativerea-ltimePCRexperiments.ClinChem,):611-622.ToNormalizetheUsingofQuantitativeRea-ltimeReverseTranscriptionPCRMAJun-yan LINJun(Women.sHospita,lSchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Women.sReproductiveHealthLaboratoryofZhejiangProvince,Hangzhou 310006,China)Abstract Quantitativerea-ltimereversetranscription-PCR(RT-qPCR)isanefficienttooltomeasureabsolutetranscriptabundanceandprovidesvaluablequantitativeinformationongeneexpressionofbiologicsamplesfromdifferentsources.ThousandsofresearchlaboratoriesworldwidehaveembracedRT-qPCRasafrequentlyusedmethodformeasuringgenesexpressionintranscriptlevelsbecauseofitsrelativelylowcos,thighprecision,andhighsensitivity,aswellasflexibilityandsimplicity.However,despiteitspopularity,moreandmoreresearchersbegintorealizethattheaccuracyofRT-qPCRgeneexpressionanalysisdependslargelyonapropernormalization.However,thesimplicityofthetechnologyitselfmakesitvulnerableforabuseinexperimentsinwhichtheoperatordoesnotperformtherequiredqualitycontrolthroughouttheentireprocedure.Here,theentireRT-qPCRworkflowwerereviewedandwhereandhowcriticalissuescanberesolvedwereindicatedpointbypoin,tsuchasexperimentdesign,sampleandassayqualitycontro,lselectionofproperreferencegenesfornormalization,dataanalysisandreportingguidelines.Followingtheadvice,anyusershouldbeabletodo(more)successfulgeneexpressionprofilingusingtheRT-qPCRtechnology.
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