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【2017年整理】各种DNA提取方法.doc 16页
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【2017年整理】各种DNA提取方法
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一，基因组DNA提取方法
制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等
试验步骤： 1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。 4、加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀，50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相 6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL混匀，冰浴，10min.。 7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。2500rpm离心10min。弃上清。 8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。 9、12000r/min室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。
二，外周血DNA提取技术
分离外周血白细胞提取方法： 试验步骤： 1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。 2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml 离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。 4、2500rpm离心10min，弃上清。 5、加入10ml 溶血液，摇匀，冰浴15min。 6、3000rpm离心10min，弃上清。 7、倒置离心管，去掉残液。 8、得白细胞，－80℃冻存。 试验要求： 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。
三，氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：
试验试剂Ligsisbuffer： 133mM NH4Cl NHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。ACD抗凝剂：__________柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。 提取缓冲液（Extractionbuffer）：10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后灭去离子水至100ml， 高压灭菌 试验步骤： 1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。 2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。 3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。 4、加入8μl 的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。 5、每管加入450μl 饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。 6、取上清，每管加入250μl 饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 7、取上清，每管加入500μl 氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 8、取上清，每管加50μl 的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。 9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。 10、加入50μl 灭菌去离子水，转弹，混匀。
四，NaI提取法提取外周血白细胞基因组：
实验步骤： 1、取外周抗凝血（全血）100ul 于eppendorf管中，12000rpm离心12min。 2、弃上清，加双蒸水200ul 溶解，摇匀20s。 3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。 4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。 5、取上层液350ul
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关于提取的dna纯度会不会影响电泳结果，网友们最关心的问题
答：第四、五组的质粒大部分是超螺旋的，也有少量的线性质粒和更少的开环质粒，第五组的质粒量比第四组多，大概为第四组的3倍左右。该质粒的分子量大体上与Marker的第二条带的分子量相当。
答：第一：DNA有杂质（DNA+ DNA蛋白质合体+RNA) 第二：胶不均匀，
答：实验准备工作： 1 所用离心管、枪头要洗净、烘干（最好灭菌）。 2 试剂配制： 1 M Tris-HCl (pH 8.0): 称取Tris-Base 121g, 加入约800 ml 水在磁力搅拌器上搅拌，使其充分溶解后加入浓盐酸调整pH至8.0后加水定溶至1000 ml. 灭菌后于室温保存。 0...
答：质粒没什么可分析的，你这么个看起来有3个带，正常闭环（超螺旋），开环，线形。虽说大小是相同的，但状态不同，这三种形态电泳时的分离率不同，分离速度不同，分成三带。闭环（超螺旋），开环，线形的螺旋率依次降低。 第三条pcr扩增大小为750b...
答：1Mg2+浓度过高&2DNA降解3胶不充分溶解，胶倒的不一定要薄4. 胶凝固没有30min，就进行电泳5. 电泳液不新鲜的6. 没用中等强度电压跑胶，没把胶控制在20min跑结束
答：用紫外分光光度计测OD值 A260/A280正常1.8左右 如果制备的DNA样品A260/A2802，说明样品中RNA过高，可用RNase消化后，用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA
答：OD1.8-2认为是DNA，如果在小于目标片段长度的位置有发亮可能是DNA降解，如果在胶的特别后方，也可能是RNA，刚提取出来的DNA跑胶经常会有这种情况吧~
答：只要你提的含量够多就可以直接跑，如果是质粒的话，一般用1%的琼脂糖凝胶，如果是细胞基因组DNA，一般用0.7%的琼脂糖凝胶，根据你的DNA大小可以调整琼脂糖凝胶的浓度。
答：这个很好解释啊，你每次都是提取好DNA第一次跑电泳结果跟预期一致，后面跑就不一致了 这是因为提取得到的DNA由于含有DNA酶会降解断裂，反复冻融DNA样品的话就会更厉害，DNA降解了就会形成弥散状的条带，也就拖尾了，特别是提取的DNA纯度不高的时...
答：琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响 1、DNA的分子大小及构型 不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环DNA（covalently closed circular，cccDNA）&直线DNA&开环的双链环状DNA。线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA...
答：原因有以下： 1、 可以考虑是不是样品不纯，目的产物与杂带相差不大，所以要多跑一段时间才有尾巴。参考marker,marker应该不会有。如果有的话说明配胶有问题。 2 、琼脂糖检测DNA一般去1~5微升原液，加2微升溴酚蓝便可，注意上样浓度； 3、可能...
答：你的这个电泳图基本上都可以看到主条带，从上往下第一条很清晰的条带就是基因组DNA，这条条带除了二号基本是比较完整而明亮的，做下游操作基本没啥问题。二号不是没有，而是量低了。四号和五号可以看到点样孔里面有些明亮的东西，这些是蛋白污染...
答：实验准备工作： 1 所用离心管、枪头要洗净、烘干（最好灭菌）。 2 试剂配制： 1 M Tris-HCl (pH 8.0): 称取Tris-Base 121g, 加入约800 ml 水在磁力搅拌器上搅拌，使其充分溶解后加入浓盐酸调整pH至8.0后加水定溶至1000 ml. 灭菌后于室温保存。 0...
答：电泳时间长短你可以和marker对比啊，如果marker迁移率过低确实可能是电泳时间短。此外，loading buffer中的溴酚蓝和二甲苯青等指示剂也能反映出电泳时间是否恰当。所以，对于一般熟手来说不存在电泳时间过短DNA未迁移的问题。在琼脂糖凝胶电泳中...
答：其实你要首先理解一下电泳染色的原理。 电泳时，我们一般使用的染色剂比如EB啊，GEL-Red啊之类的，都是潜入DNA双螺旋的分子间，所以能拿来作为结合染色染料。而对于RNA，其大多为单链形式存在，这些染料还能进行染色的原因，是因为其的大分子还...
答：1 材料和方法 1.1 样本来源 静脉抽取30份健康体检者血样。10份用EDTA抗凝, 10份不加抗凝处理，10份不抗凝在-40 ℃冻存2 a左右。 1.2 DNA提取方法 取凝血块，用9 g/L 氯化钠匀浆大约30 s，每换一个样本都要用70%乙醇和9 g/L 氯化钠清洗匀浆器以避...
答：很多种可能 试剂盒本身有问题（譬如柱子不行了）、你是否忘记向洗脱液储液中加入乙醇了、在加入两次洗脱液洗脱后是否又忘记额外离心一次、最后洗脱时是否加入了冷水而且没有在室温下静置几分钟……
答：不知道你提的这个DNA样品用RNase处理过没有？ 如果没有处理过的话，可能你的样品里有大量的RNA存在，显得电泳拖尾，不一定是你的DNA降解严重。另外，电泳图中没有看到明显的DNA条带存在，可能的原因是：1.DNA真的降解了；2.最后提取出来的DNA溶...
答：PCR技术中扩增的是两引物之间的核苷酸序列,意思是采用该技术,可以大量扩增引物之间的序列,一般情况下,我们需要大量的某一基因的片段时,我们在基因的两端...
答：分子生物学实验基础知识 16:31分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发并诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基...
答：因为质粒会有不同构象埃超螺旋、环形的条带肯定不一样，偶尔还会有线形
答：凝胶电泳是一大类技术，被科学工作者用于分离不同物理性质（如大孝形状、等电点等）的分子。凝胶电泳通常用于分析用途，但也可以作为制备技术，在采用某些方法（如质谱(MS)、聚合酶链式反应(PCR)、克隆技术、DNA测序或者免疫印迹）检测之前部分...
答：一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大校分离小于0.5kb的DNA段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,...
答：影响的因素很多。主要的有： 1、 DNA的分子大小 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，迁移得越慢。 2、 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶...
答：分离鉴定DNA。。不同长度还有不同形态（超螺旋，双链，单链，线性等等）的DNA在电场下的泳动速度不一样。而且凝胶上都是小孔洞。 大的不能穿梭就被缠住，泳动慢，小的在里面穿梭，泳动快，根据这个原理，使用标准的DNA样品。就可以知道目的DNA的...
答：那是他们提取的时候变性时间太长，变性的质粒DNA电泳的时候走在超螺旋DNA的前面，染色较淡。 变形的原因通常是上样量太大，也有可能是凝胶、缓冲液的原因。
答：其实提取细菌基因组DNA并不是要用到上面提到的所有试剂。 TE是用来浮起细菌的。如果是阳性菌的话最好是用溶菌酶处理一下。 SDS可以让细胞裂解，并与核蛋白结合（当然也包括DNA）。蛋白酶K自然是降解蛋白的。到这一步可以直接用异丙醇沉淀，70%乙...
答：植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。十六烷基三甲基溴化铵是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中可溶，当降低溶液盐浓度到一定程度时，...
答：质粒DNA电泳会有三条带,最远的是线形DNA（lDNA）：质粒的两条链均断裂；线性分子；中间的是开环DNA（ocDNA）：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子；共价闭合环状DNA（cccDNA）：质粒的两条链没有断裂；超螺旋这是由于在质粒提取过程中,机械力、酸...
答：不能这样说 还有其它因素影响的 渣滓肯定还有
答：二甲苯青一般不会，1 要确认你有没有跑出去 2 DNA的量低于琼脂糖胶-EB的检出限，这样你用PAGE-银染可能有而EB没有
答：血中DNA的提取 血液中DNA提取的原理：如果以外周血为DNA提取材料，在外周血中提取DNA就是从有核的白细胞中提取DNA。因此，从外周血中提取DNA包括以下几个关键步骤：第一，破坏红细胞，通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异，先使红细胞裂解，经离...
答：电泳出现拖尾现象,英文成为smear,就是弥散.其原因,主要从以下两个方面考虑： 1、PCR产物自身原因： 往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多,而造成PCR的非特异性产物 过多. 对策：①减少Taq酶的量,或...
答：嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA...扩增产物一般用电泳分析,不一定要用同位素,无放射性...对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞...
答：因为质粒会有不同构象埃超螺旋、环形的条带肯定不一样，偶尔还会有线形
答：RNA与DNA最重要的区别一是RNA只有一条链，二是它的碱基组成与DNA的不同，RNA没有碱基T（胸腺嘧啶），而有碱基U（尿嘧啶）。所以导致他们有以下性质上的不同。 1.两性解离：DNA无，只有酸解离，碱基被屏蔽（在分子内部形成了H键）。RNA有，有PI。...
答：中提取的热稳定的Taq DNA聚合酶,在热变性处理时不...合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相...尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度要求不高,但也不允许...
答：影响的因素很多。主要的有： 1、 DNA的分子大小 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，迁移得越慢。 2、 琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶...
答：ACeh01电导分析法 ACeh010001 电导滴定法测定镍的含量 由电导滴定法确定终点，在氨性介质中用丁二酮肟乙醇溶液滴定镍的含量，采用硫脲掩蔽Cu(Ⅱ)，用H2O2将Mn(Ⅱ)、Co(Ⅱ)氧化成Mn(ⅳ)和Co(Ⅲ)消除干扰，其它金属离子对测定没有干扰。此法的测定结果...
答：快速,能同时处理大量试样,所得DNA有一定纯度,可满足限制酶切割、电泳分析的需要...3.提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚...
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我最近提胃癌组织RNA，加入异丙醇之后总是出现大量白色絮状物，离心后出现大量白色沉淀，后来换了乳腺癌组织这步还是会出现大量白色絮状物，加氯仿吸上清时我留了很多上清，确定没有吸到蛋白层，而且最后加水溶解时白色物质迅速溶解。是不是存在DNA污染呀？提取的RNA总是降解，求高手帮助，谢谢了
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异丙醇加了之后要是没有沉淀你会哭的
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絮状沉淀那是基因组啊
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异丙醇沉淀的就是你的RNA啊，至于你的RNA降解，那是你的操作问题，要带口罩，最好是有RNA操作室，另外枪头等都要DEPC处理，保证无RNA酶。
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沉淀溶解可能就不是蛋白了，也有可能是多糖，首先跑个电泳看看之后就好分析了，普通电泳就行，1ug左右上样
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异丙醇就是为了沉淀RNA的啊 ，但是肉眼能看出絮状沉淀我感觉不像是RNA，建议你再检查下前面的步骤。
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RNA异丙醇沉淀后应该是看不见的。除非组织或细胞用量很大，不然基本看不到沉淀。如果组织和细胞用量太大的话，RNA很难纯化，不干净。
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